Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Это исследование финансировалось NIH 1R01HL140239-01 для AMC. Мы хотели бы поблагодарить Центр визуализации клеток при Университете Дрекселя.

1. Рост эпителиальных клеток молочной железы и анализ СРЕДСТВ массовой информации
<ol><li>Эпителиальные клетки молочной железы MCF10A ПРИМЕЧАНИЕ: Неоморогенная увековеченная линия эпителиальных клеток молочной железы происходит от пациента с фиброзистным заболеванием43. Кл?...

Этот протокол является первым в своем роде биопечать сфероидов в их 3D архитектуры для совместной культуры с эндотелиальных клеток также в их 3D архитектуры. Критические этапы протокола включают первоначальное образование сетей эпителиальных сфероидов молочной железы и HUVEC. Чрезвычайн...

3D в пробирке сосудистой опухоли модели являются важными инструментами для механистического исследования роста рака и метастазов. Для рака молочной железы, в частности, эпителиальные клетки молочной железы, культурные в Matrigel организовать в поляризованных сфероидов, которые больше напоминают in vivo mammary acinusархитектуры 1,2,3,4,5,6,7,8. 3D груди эпителиальной клеточной культуры также влияет на функцию клеток, с 3D культур, показывающих различия в эпидермального фактора роста (EGF)модуляции рецепторов 8,9; онкоген функции, в том числе ErbB210; рост и апоптоз сигнализации11,12; ихимиотерапевтического сопротивления 13,14. Сосудистые эндотелиальные клетки одинаково по-разному реагируют на экологические стимулы в 3D против традиционной 2Dкультуры 15,16,17,18. Тем не менее, большая часть понимания сосудистых эндотелиальных и грудных эпителиальных взаимодействий происходит от 2D культуры с использованием условных средних или Transwell вставки, или 3D-модели, в которых два типаклеток физически разделены 19,20,21,22,23. Эти модели совместной культуры обеспечивают ограниченное физиологическое понимание, так как и 3D-культура, и контакт клеток имеют решающее значение для сосудистого эндотелиального - взаимодействияэпителиальных клеток молочной железы 24,25,26.
3D модели рака были изготовлены с использованием различных методов, в том числе висячие капли сфероидов формирования, биопечати, магнитной сборки и культуры в гидрогелях или на инженерии леса5,27,28,29. Совсем недавно были созданы 3D-модели опухолей с несколькими типами клеток, расположенными в их соответствующих 3D структурах. В одном из примеров опухоли на чипе платформы, рак, эндотелиальные и стромальные клетки были смешаны в матрицу, а затем введены в три центральные камеры ткани в устройстве polydimeylsiloxane (PDMS). Камеры тканей были граничит с двумя внешними каналами, которые представляли артерию и венуле. После 5-7 дней культуры, эндотелиальные клетки сформировали микрососудикулярную сеть и раковые клетки размножались, чтобы сформировать небольшие опухоли вблизи сосудов. Эта платформа была затем использована для проверки наркотиков и комбинаций наркотиков30. Дополнительные платформы опухоли-на-чипе были созданы для изучения метастазов и типов рака с конкретными механическими стимулами (например, механический штаммв легких) 31,32. Тем не менее, эти платформы, как правило, не включают как сосуды и рак в их соответствующих 3D структур.
Биофабрика показывает большие перспективы в продвижении 3D в пробирке васкуляризированных моделей опухоли, так как это позволяет жесткий пространственный контроль над расположением клеток. Несмотря на рост биопечати за последнее десятилетие, лишь немногие исследования сосредоточены конкретно наопухолях 33,34. В одном примере для создания модели рака шейки матки in vitro использовалась 3D-печать клеток HeLa в гидрогеле из желатина/альгината/фибриногена. Опухолевые клетки были биопечать в качестве отдельных клеток, а затем позволило сформировать сфероиды, которые показали более высокий уровень распространения, увеличение экспрессии матрицы металлопротеиназы, и более высокую химиорезистансность, чем клетки в 2Dкультуры 35. В этих исследованиях, как и вомногих других 36,37, диссоциированных клеточных суспензий были биопечати, а затем клеточные культуры были предоставлены необходимые механические и биохимические сигналы, чтобы клетки, чтобы сформировать 3D структуру. Тем не менее, клеточная самосвеывание может занять несколько дней или недель, может потребовать сложных пространственных и временных экологических сигналов, или не может произойти, когда два типа клеток совместно культуры. Например, эпителиальные клетки молочной железы индуцированных клеточной смерти в эндотелиальных клетках в 2D совместной культуры, и диссоциированных клеток груди эпителиальной не образуют 3D сфероидов, когда биопечать в альгинат / желатингидрогелий 38. Диссоциированные эпителиальные или раковые клетки молочной железы образуют сфероиды в биоинках на основе альгината только тогда, когда они в ловушке в круглых формах PDMS. В других случаях, сфероиды были сформированы с использованием подвесных капель в ультра-низкой крепления круговых пластин хорошо, а затем смешивается в альгинат наоснове биоинк 39,40.
Теперь в этом протоколе мы описываем альтернативный метод биофактирования 3D-тканей. Вместо того, чтобы семена диссоциированных клеток и ждать этих клеток, чтобы сформировать 3D структуры, мы описываем, как создать и биопечать 3D-сфероидов опухоли на сосудистой сети трубки для создания опухоли совместно культуры модели, которые могут быть использованы почти сразу. Опухолевые сфероиды могут быть выращены в пробирке или получены из тканей человека (органоидов). Аналогичным образом, сосудистые трубки могут быть выращены или могут быть получены из жировой ткани микрососудистых фрагментов. Биоинкс может варьироваться от биологически неактивного альгината до высоко биологически активного Matrigel41. Так как эта 3D-модель совместной культуры опухоли может быть создана с различными клеточными структурами и биоинками, она может включать в себя несколько типов клеток, внеклеточные матрицы, и химиокинградиенты 15,42. Хотя в своей нынешней формулировке эндотелиальные сети не могут быть пронизаны, будущие итерации могут интегрировать этот метод с микрофлюидами или системами-чипами. Биопечать 3D эпителиальных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети позволяет быстро биофабрикацию моделей груди человека для тестирования на наркотики и персонализированной точноймедицины 27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Биопечать становится перспективным инструментом для изготовления 3D-моделей рака человека, которые лучше резюмируют критические признаки архитектуры тканей in vivo. В текущей биопечати экструзии слоя за слоем отдельные клетки экструдируются в биоинке вместе со сложными пространственными и временными сигналами для содействия самосожасыванию иерархических тканей. Тем не менее, этот метод биофабрики опирается на сложные взаимодействия между клетками, биоинки и биохимические и биофизические сигналы. Таким образом, самос сборка может занять несколько дней или даже недель, может потребовать конкретных биоинкв, и не всегда может произойти, когда есть более чем один тип клеток участие. Поэтому мы разработали метод непосредственно биопечати предварительно сформированных 3D груди эпителиальных сфероидов в различных биоинк. Биопечатные предварительно сформированные 3D эпителиальные сфероиды груди поддерживали свою жизнеспособность и поляризованную архитектуру после печати. Мы дополнительно напечатали 3D сфероиды на сосудистых эндотелиальных клеточных сетях, чтобы создать модель совместной культуры. Таким образом, новая методика биопечати быстро создает более физиологически релевантную 3D модель груди человека при более низких затратах и с более высокой гибкостью, чем традиционные методы биопечати. Этот универсальный метод биопечати может быть экстраполирован для создания 3D-моделей других тканей в дополнительных биоинках.

Грудные эпителиальные клетки должны самообориться в 3D сфероиды после 5-8 дней культуры на матричном растворе и в культурной среде с 2% матричным раствором. Неоморогенные MCF10A груди эпителиальных сфероидов должны появиться круглые и имеют полый центр, с интегрином No 6 поляризованы на внеш?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Целью этого протокола является непосредственно биопечать эпителиальных клеток молочной железы в качестве многоклеточных сфероидов на предварительно сформированные эндотелиальные сети для быстрого создания 3D эндотелиальных моделей совместной культуры груди, которые могут быть использованы для исследования скрининга наркотиков.

Прямая биопечать 3D многоклеточных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Простые висячей капли культуре клеток Протокол Генерация 3D сфероидов

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Тканевая инженерия: Строительство многоклеточного 3D строительные леса на поставки слоистых сотовых листов

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Моделирование рака яичников Многоклеточная Сфероид Поведение в микроустройство Dynamic 3D перитонеального

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Платформа Lab-on-a-CD для генерации многоклеточных трехмерных сфероидов

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Протоколы 3D биопечати желатина Methacryloyl Гидрогель на основе биоинков

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D-биопечать мышиных кортикальные астроциты для инженерии невроходобной ткани

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Доступная кислородная микроскопия с помощью биофабрикации многоклеточных сфероидов

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...