Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Esta investigación fue financiada por NIH 1R01HL140239-01 a AMC. Nos gustaría dar las gracias al Centro de Imágenes Celulares de la Universidad drexel.

1. Crecimiento de células epiteliales mamarias y medios de ensayo
<ol><li>Células epiteliales mamarias MCF10A NOTA: La línea celular epitelial mamaria inmortalizada no tumorigénica se deriva de una paciente con enfermedad fibroquística43. Las células no expresan el receptor de estrógeno.<ol>
<li>Para preparar 20 μg/mL factor de crecimiento epidérmico (EGF), disolver 100 μg de EGF liofilizado en 500 μL de dH estéril2O para hacer 200 μg/mL EGF. Añadir 500 μL de 200 μg...

Este protocolo es el primero de su tipo en bioimprimir esferoides en su arquitectura 3D para co-cultivo con células endoteliales también en su arquitectura 3D. Los pasos críticos del protocolo incluyen la formación inicial de esferoides epiteliales mamales y redes HUVEC. Se debe tener extrema precaución en la alimentación de esferoides epiteliales mamarios, ya que se interrumpen fácilmente de la solución de matriz. Del mismo modo, los esferoides epiteliales mamales deben tratarse con cuidado cuando se pipetizan f...

Los modelos tumorales vascularizados in vitro 3D son herramientas esenciales para el estudio mecanicista del crecimiento del cáncer y la metástasis. Para el cáncer de mama en particular, las células epiteliales mamarias cultivadas en Matrigel se organizan en esferoides polarizados que se asemejan más a la arquitectura in vivo mammary acinus1,2,3,4,5,6,7,8. Cultivo celular epitelial mamario 3D también afecta la función celular, con cultivos 3D que muestran diferencias en la modulación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF)8,9; función de oncogeno, incluyendo ErbB210; crecimiento y apoptosis señalización11,12; y resistencia a la quimioterapia13,14. Las células endoteliales vasculares responden de manera similar a los estímulos ambientales en 3D frente al cultivo tradicional 2D15,16,17,18. Sin embargo, gran parte de la comprensión de las interacciones endoteliales vasculares y epiteliales mamarias proviene del cultivo 2D utilizando insertos medianos o transwell acondicionados, o modelos 3D en los que los dos tipos de células están físicamente separados19,20,21,22,23. Estos modelos de co-cultivo proporcionan una visión fisiológica limitada, ya que tanto el cultivo 3D como el contacto célula-celular son críticos para el endotelial vascular – interacciones celulares epiteliales mamarias24,25,26.
Los modelos oncológicos 3D han sido fabricados utilizando una variedad de técnicas, incluyendo la formación de esferoides colgantes, bioimpresión, montaje magnético y cultivo dentro de hidrogeles o en andamios diseñados5,27,28,29. Más recientemente, se crearon modelos de tumores 3D con múltiples tipos de células dispuestas en sus respectivas estructuras 3D. En un ejemplo de una plataforma tumoral en un chip, el cáncer, las células endoteliales y estromales se mezclaron en una matriz y luego se inyectaron en las tres cámaras del tejido central en un dispositivo de polidimetilesiloxano (PDMS). Las cámaras de tejido estaban bordeadas por dos canales exteriores que representaban una arteria y una venul. Después de 5-7 días de cultivo, las células endoteliales formaron una red microvascular y las células cancerosas proliferaron para formar pequeños tumores cerca de la vasculatura. Esta plataforma se utilizó entonces para examinar drogas y combinaciones de drogas30. Se han creado plataformas adicionales de tumor en un chip para estudiar metástasis y tipos de cáncer con estímulos mecánicos específicos (por ejemplo, tensión mecánica en el pulmón)31,32. Sin embargo, estas plataformas generalmente no incluyen vasculatura y cáncer en sus respectivas estructuras 3D.
La biofabricación muestra una gran promesa en el avance de modelos tumorales vascularizados in vitro en 3D, ya que permite un estricto control espacial sobre la ubicación celular. A pesar del crecimiento de la bioimpresión en la última década, pocos estudios se centran específicamente en tumores33,34. En un ejemplo, la impresión 3D de células HeLa en un hidrogel gelatina/alginato/fibrinógeno se utilizó para crear un modelo de cáncer cervical in vitro. Las células tumorales fueron bioimpresas como células individuales y luego se les permitió formar esferoides, que mostraron una mayor tasa de proliferación, mayor expresión de metaloproteinasa de matriz y mayor quimioterasis que las células en el cultivo2D 35. En estos estudios, como en muchos otros36,37,las suspensiones celulares disociadas fueron bioimpresas, y luego se proporcionaron los cultivos celulares con las señales mecánicas y bioquímicas requeridas para permitir que las células formen una estructura 3D. Sin embargo, el autoensamblaje celular puede tardar días o semanas, puede requerir señales ambientales espaciales y temporales complejas o no puede ocurrir cuando dos tipos de células son co-cultivadas. Por ejemplo, las células epiteliales mamarias indujeron la muerte celular en células endoteliales en el co-cultivo 2D, y las células epiteliales mamarias disociadas no formaron esferoides 3D cuando se bioimprimieron en hidrogeles de alginato/gelatina38. Las células epiteliales o cancerosas de mama disociadas formaron esferoides en bioinks a base de alginato solo cuando se encerraban en moldes circulares de PDMS. En otros casos, los esferoides se formaron utilizando gotas suspendidas en placas circulares de pozos de fijación ultrabaja y luego se mezclaron en bioinks a base de alginato39,40.
Ahora describimos un método alternativo de biomanufacturación de tejidos 3D en este protocolo. En lugar de semillas disociadas y esperar a que estas células formen las estructuras 3D, describimos cómo crear y bioimprimir esferoides tumorales 3D en una red de tubos vasculares para crear un modelo de co-cultivo tumoral que se puede utilizar casi inmediatamente. Los esferoides tumorales pueden cultivarse in vitro o derivarse de tejidos humanos (organoides). Del mismo modo, los tubos vasculares se pueden cultivar o pueden derivarse de fragmentos microvasculares de tejido adiposo. Los bioinks pueden ir desde el alginato biológicamente inactivo hasta el altamente activo Matrigel41. Dado que este modelo de co-cultivo tumoral 3D se puede crear con una variedad de estructuras celulares y bioinks, puede incorporar múltiples tipos de células, matrices extracelulares y gradientes de quimiocina15,42. Mientras que en su formulación actual, las redes endoteliales no pueden ser perfundidas, futuras iteraciones podrían integrar este método con microfluidos o sistemas -on-chip. La bioimpresión de esferoides epiteliales de mamas 3D en redes endoteliales permite una biofabricación rápida de modelos mamarias humanos para pruebas de drogas y medicina de precisión personalizada27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

La bioimpresión está emergiendo como una herramienta prometedora para fabricar modelos de cáncer humano 3D que recapitulan mejor las señas de identidad críticas de la arquitectura de tejidos in vivo. En la bioimpresión actual de extrusión capa por capa, las células individuales se extruyen en un bioink junto con señales espaciales y temporales complejas para promover el autoensamblaje del tejido jerárquico. Sin embargo, esta técnica de biofabricación se basa en interacciones complejas entre células, bioinks y señales bioquímicas y biofísicas. Por lo tanto, el autoensamblaje puede tomar días o incluso semanas, puede requerir bioinks específicos, y no siempre puede ocurrir cuando hay más de un tipo de célula involucrado. Por lo tanto, desarrollamos una técnica para bioimprimir directamente esferoides epiteliales de mama 3D preformados en una variedad de bioinks. Los esferoides epiteliales 3D preformados bioimpresos mantuvieron su viabilidad y arquitectura polarizada después de la impresión. Además imprimimos los esferoides 3D en redes celulares endoteliales vasculares para crear un modelo de co-cultivo. Por lo tanto, la novedosa técnica de bioimpresión crea rápidamente un modelo mamario humano 3D más fisiológicamente relevante a menor costo y con mayor flexibilidad que las técnicas tradicionales de bioimpresión. Esta versátil técnica de bioimpresión se puede extrapolar para crear modelos 3D de otros tejidos en bioinks adicionales.

Las células epiteliales mamarias deben autoorganización en esferoides 3D después de 5-8 días de cultivo en solución de matriz y en medio de cultivo con 2% solución de matriz. Los esferoides epiteliales de mama MCF10A no tumorigénicos deben aparecer redondos y tener un centro hueco, con integrina α6 polarizada al borde exterior del esferoide(Figura 1,inset muestra centros huecos). Las células epiteliales de cáncer de mama MDA-MB-231 altamente invasivas forman esferoides irregulares....

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

El objetivo de este protocolo es bioimprimir directamente las células epiteliales mamarias como esferoides multicelulares en redes endoteliales preformadas para crear rápidamente modelos de co-cultivo endotelial mamario 3D que pueden ser utilizados para estudios de detección de fármacos.

Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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