Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Denna forskning finansierades av NIH 1R01HL140239-01 till AMC. Vi vill tacka Cell Imaging Center vid Drexel University.

1. Bröst epitelcell tillväxt och analys media
<ol><li>MCF10A bröst epitelceller OBS: Den icke-tumorigenic förevigade bröst epitelial cellinjen härrör från en patient med fibrocystic sjukdom43. Celler uttrycker inte östrogenreceptor.<ol>
<li>För att förbereda 20 μg/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), lös upp 100 μg lyofiliserad EGF i 500 μL sterilt dH2O för att göra 200 μg/mL EGF. Tillsätt 500 μL 200 μg/ml EGF i 4,5 ml steril 0,1 % BSA i dH2O för att...

Detta protokoll är det första i sitt slag att bioprint sfäroider i sin 3D arkitektur för samkultur med endotelceller också i sin 3D arkitektur. Kritiska protokoll steg inkluderar den första bildandet av bröst epitelial sfäroider och HUVEC nätverk. Extrem försiktighet måste iakttas vid utfodring av amningsepitela sfäroider, eftersom de lätt störs från matrislösningen. På samma sätt måste bröstepitela sfäroider behandlas varsamt när de pipetted av matrislösningen och blandas i nätverken. HUVEC-nätv...

3D in vitro Vascularized tumör modeller är viktiga verktyg för mekanistisk studie av cancer tillväxt och metastasering. För bröstcancer i synnerhet, bröst epitelceller odlade i Matrigel organisera i polariserade sfäroider som mer liknar in vivo bröst acinusarkitektur 1,2,3,4,5,6,7,8. 3D bröst epitelial cell kultur påverkar också cellfunktionen, med 3D kulturer som visar skillnader i epidermal tillväxtfaktor (EGF) receptor modulering8,9; Onkogenfunktion, inklusive ErbB210. tillväxt och apoptossignalering11,12; och kemoterapiresistens13,14. Vaskulär endotelceller svarar på samma sätt annorlunda på miljöstimulanser i 3D jämfört med traditionell 2D-kultur15,16,17,18. Emellertid, mycket av förståelsen av vaskulär endotel och bröst epitelial interaktioner kommer från 2D kultur med konditionerade medium eller Transwell insatser, eller 3D-modeller där de två celltyperna är fysisktseparerade 19,20,21,22,23. Dessa samkulturella modeller ger begränsad fysiologisk insikt, eftersom både 3D-kultur och cellcellskontakt är avgörande för vaskulär endotel – bröstepitela cellinteraktioner24,25,26.
3D-cancermodeller har tillverkats med hjälp av en mängd olika tekniker, inklusive hängande droppsfäroidbildning, bioprinting, magnetisk montering och kultur inom hydrogeler eller på konstruerade byggnadsställningar5,27,28,29. Mer nyligen skapades 3D tumör modeller med flera celltyper ordnade i sina respektive 3D strukturer. I ett exempel på en tumör-på-ett-chip plattform blandades cancer, endotel och stromal celler i en matris och injicerades sedan i de tre centrala vävnadskamrarna i en polydimethylsiloxane (PDMS) enhet. Vävnadskamrarna gränsar till två yttre kanaler som representerade en artär och venule. Efter 5-7 dagar av kultur bildade endotelceller ett mikrovaskulärt nätverk och cancerceller prolifererade för att bilda små tumörer nära vaskulaturen. Denna plattform användes sedan för att screena droger och läkemedelskombinationer30. Ytterligare plattformar för tumör-på-chip har skapats för att studera metastasering och cancertyper med specifika mekaniska stimuli (t.ex. mekanisk stam i lungan)31,32. Dessa plattformar inkluderar dock i allmänhet inte både vaskulatur och cancer i sina respektive 3D-strukturer.
Biofabricering visar stort löfte i att främja 3D in vitro vascularized tumör modeller, eftersom det möjliggör snäva rumslig kontroll över cell plats. Trots tillväxten av bioprinting under det senaste decenniet fokuserar få studier specifikt på tumörer33,34. I ett exempel användes 3D-utskrift av HeLa-celler i en gelatin/alginat/fibrinogen hydrogel för att skapa en in vitro livmoderhalscancer modell. Tumör celler var bioprinted som enskilda celler och sedan tillåtet att bilda sfäroider, som visade en högre spridning hastighet, ökad matris metalloproteinase uttryck och högre chemoresistance än celler i 2D kultur35. I dessa studier, som i många andra36,37, var dissocierade cellupphängningar bioprintade, och sedan fick cellkulturerna de nödvändiga mekaniska och biokemiska ledtrådarna för att cellerna skulle kunna bilda en 3D-struktur. Cellulär självmontering kan dock ta dagar eller veckor, kan kräva komplexa rumsliga och tidsmässiga miljösignaler eller inte uppstå när två celltyper är samkulturerade. Till exempel bröst epitelial celler inducerad celldöd i endotelceller i 2D-samkultur, och dissociated bröst epitelial celler bildade inte 3D sfäroider när bioprinted i alginate/gelatin hydrogels38. Dissocierade bröst epitelial eller cancerceller bildade sfäroider i alginate baserade bioinks endast när de är fastspända i cirkulära PDMS mögel. I andra fall bildades sfäroider med upphängda droppar i ultralåga cirkulära brunnsplattor och blandades sedan i alginatbaserade biobläck39,40.
Vi beskriver nu en alternativ 3D vävnad biomanufacturing metod i detta protokoll. Snarare än att så dissocierade celler och vänta på att dessa celler bildar 3D-strukturerna beskriver vi hur man skapar och bioprintar 3D-tumörsfäroider på ett kärlrörsnätverk för att skapa en tumörsamkulturmodell som kan användas nästan omedelbart. Tumör sfäroider kan odlas in vitro eller härrör från mänskliga vävnader (organoider). På samma sätt kan kärlrör odlas eller härledas från fettvävnad mikrovaskulära fragment. Bioinks kan variera från biologiskt inaktivt alginat till det mycket biologiskt aktiva Matrigel41. Eftersom denna 3D tumör co-culture modell kan skapas med en mängd olika cellstrukturer och bioinks, Det kan innehålla flera celltyper, extracellulära matriser och kemokine gradienter15,42. Även om de endotelnäten i sin nuvarande formulering inte kan perfunderas, kan framtida iterationer integrera denna metod med mikrofluider eller -on-chip-system. Bioprinting 3D bröst epitelial sfäroider på endotel nätverk möjliggör snabb biofabricering av mänskliga bröst modeller för läkemedelstestning och personlig precision medicin27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting växer fram som ett lovande verktyg för att tillverka 3D-modeller för mänsklig cancer som bättre rekapitulera kritiska kännetecken för in vivo-vävnadsarkitektur. I nuvarande skikt-för-lager extrudering bioprinting, enskilda celler extruderas i en bioink tillsammans med komplexa rumsliga och tidsmässiga signaler för att främja hierarkisk vävnad självmontering. Denna biofabriceringsteknik bygger dock på komplexa interaktioner mellan celler, bioinks och biokemiska och biofysiska signaler. Således kan självmontering ta dagar eller till och med veckor, kan kräva specifika bioinks och kan inte alltid uppstå när det finns mer än en celltyp inblandad. Vi utvecklade därför en teknik för att direkt bioprinta förformade 3D bröst epitelial sfäroider i en mängd olika bioinks. Bioprinted pre-formed 3D bröst epitelial sfäroider lidit sin livskraft och polariserade arkitektur efter utskrift. Vi tryckte dessutom 3D-sfäroiderna på vaskulär endotel cell nätverk för att skapa en co-culture modell. Således skapar den nya bioprintingtekniken snabbt en mer fysiologiskt relevant 3D-bröstmodell till lägre kostnad och med högre flexibilitet än traditionella bioprintingtekniker. Denna mångsidiga bioprintningsteknik kan extrapoleras för att skapa 3D-modeller av andra vävnader i ytterligare bioinks.

Bröst epitelceller bör själv organisera sig i 3D-sfäroider efter 5-8 dagars kultur på matrislösning och i odlingsmedium med 2% matrislösning. Icke-tumörogena MCF10A bröst epitelial sfäroider bör visas runt och ha en ihålig centrum, med integrin α6 polariseras till ytterkanten av sfäroiden (Figur 1, inset visar ihåliga centrum). Mycket invasiva MDA-MB-231 bröstcancer epitelceller bildar oregelbundna sfäroider. Sfäroider bör användas när de är cirka 100 – 300 μm i diam...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Målet med detta protokoll är att direkt bioprinta bröst epitelceller som multicellulära sfäroider på förformade endotel nätverk för att snabbt skapa 3D bröst-endotel co-culture modeller som kan användas för läkemedelsscreening studier.

Direkt bioprintning av 3D multicellulära bröstsfäroider till endotelnätverk

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Konstruktion av en flercellig 3D Scaffold för Leverans av Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellering äggstockscancer flercelliga Sfäroid Beteende i en dynamisk 3D Peritoneal mikroanordning

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Skapande av hjärtvävnad som visar mekanisk integration av sfäroider med 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-på-en-CD plattform för att generera Multicellulära tredimensionell spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoll för 3D Bioprinning av gelatin Methacryloyl hydrogel baserade Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes för engineering neural-liknande vävnad

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Prisvärd syremikroskopi-assisterad biofabricering av multicellulära sfäroider

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...