Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Bu araştırma NIH 1R01HL140239-01 tarafından AMC'ye finanse edildi. Drexel Üniversitesi Hücre Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz.

1. Meme Epitel Hücre Büyümesi ve Assay Medya
<ol><li>MCF10A meme epitel hücreleri NOT: Tümörojenik olmayan ölümsüzleştirilmiş meme epitel hücre hattı fibrokistik hastalığı olan bir hastadan türetilmiştir43. Hücreler östrojen reseptörü ifade etmez.<ol>
<li>20 μg/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) hazırlamak için, 200 μg/mL EGF yapmak için 500 μL steril dH2O'da 100 μg lyophilized EGF çözün. 20 μg/mL EGF stok çözeltisi yapmak için dH 2 O'da 4,5 m...

Bu protokol, 3D mimarilerinde de endotel hücreleriyle ortak kültür için 3D mimarilerinde sferoidleri biyobaskılamak için türünün ilk örneğidir. Kritik protokol adımları meme epitel sferoidlerinin ve HUVEC ağlarının ilk oluşumunu içerir. Meme epitel sferoidlerinin beslenmesinde çok dikkatli olunmalıdır, çünkü matris çözeltisinden kolayca bozulurlar. Benzer şekilde, meme epitel sferoidleri matris çözeltisi dışında pipetlendiğinde ve ağlara karıştırıldığında dikkatli bir şekilde ted...

3D in vitro vasküler tümör modelleri kanser büyümesi ve metastazının mekanistik çalışması için gerekli araçlardır. Özellikle meme kanseri için, Matrigel'de kültürlenen meme epitel hücreleri, in vivo meme acinus mimarisine daha yakından benzeyen polarize sferoidler halinde organize edilir1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D meme epitel hücre kültürü de hücre fonksiyonunu etkiler, 3D kültürler epidermal büyüme faktörü (EGF) reseptör modülasyonunda farklılıklar gösterir8,9; ErbB210dahil onkogen fonksiyonu; büyüme ve apoptoz sinyal11,12; ve kemoterapi direnci13,14. Vasküler endotel hücreleri benzer şekilde 3D ve geleneksel 2D kültür15 , 16 , 17,18'deçevresel uyaranlara farklı yanıt verir. Bununla birlikte, vasküler endotel ve meme epitel etkileşimlerinin anlaşılmasının çoğu, şartlandırılmış orta veya Transwell kesici uçlar kullanılarak 2D kültüründen veya iki hücre tipinin fiziksel olarak ayrıldığı 3D modellerden gelir19,20,21,22,23. Bu ortak kültür modelleri sınırlı fizyolojik içgörü sağlar, çünkü hem 3D kültür hem de hücre-hücre teması vasküler endotel için kritik öneme sahiptir - meme epitel hücre etkileşimleri24,25,26.
3D kanser modelleri, hidrojellerde veya mühendislik iskelelerinde asılı damla küresel oluşumu, biyobaskı, manyetik montaj ve kültür dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak üretilmiştir5,27,28,29. Daha yakın zamanda, kendi 3D yapılarında düzenlenmiş birden fazla hücre tipi ile 3D tümör modelleri oluşturulmuştur. Çip üzerindeki tümör platformunun bir örneğinde, kanser, endotel ve stromal hücreler bir matrise karıştırıldı ve daha sonra polidimetilsiloksiksan (PDMS) cihazındaki üç merkezi doku odasına enjekte edildi. Doku odaları, arter ve venule'yi temsil eden iki dış kanalla sınırlandı. 5-7 günlük kültürden sonra endotel hücreleri bir mikrovasküler ağ oluşturdu ve kanser hücreleri çoğalarak vaskülatın yakınında küçük tümörler oluşturdu. Bu platform daha sonra uyuşturucu ve ilaç kombinasyonlarını taramak için kullanıldı30. Belirli mekanik uyaranlara (örneğin, akciğerdeki mekanik zorlanma) sahip metastaz ve kanser türlerini incelemek için ek çip üzerinde tümör platformları oluşturulmuştur31,32. Bununla birlikte, bu platformlar genellikle ilgili 3D yapılarında hem vaskülat hem de kanser içermez.
Biyofabrikasyon, hücre konumu üzerinde sıkı mekansal kontrol sağladığından, 3D in vitro vasküler tümör modellerinin ilerletmesinde büyük umut vaat ediyor. Son on yılda biyobaskı büyümesine rağmen, çok az çalışma özellikle tümörlere odaklanmaktadır33,34. Bir örnekte, in vitro serviks kanseri modeli oluşturmak için hela hücrelerinin jelatin/aljinat/fibrinojen hidrojelde 3D baskısı kullanılmıştır. Tümör hücreleri tek tek hücreler olarak biyobaskı yapıldı ve daha sonra daha yüksek çoğalma oranı, matris metalloproteinaz ekspresyözü ve 2D kültürdeki hücrelerden daha yüksek chemoresistance gösteren küreseller oluşturmasına izin verildi35. Bu çalışmalarda, diğerlerinde olduğu gibi36,37, ayrışmış hücre süspansiyonları biyobaskı verildi ve daha sonra hücre kültürlerine hücrelerin 3D bir yapı oluşturmasını sağlamak için gerekli mekanik ve biyokimyasal ipuçları sağlandı. Bununla birlikte, hücresel kendi kendine montaj günler veya haftalar sürebilir, karmaşık uzamsal ve zamansal çevresel ipuçları gerektirebilir veya iki hücre tipi birlikte kültürlendiğinde gerçekleşmeyebilir. Örneğin, meme epitel hücreleri 2D ortak kültürde endotel hücrelerinde hücre ölümüne neden oldu ve ayrışmış meme epitel hücreleri aljinat / jelatin hidrojellerinde biyobaskılandığında 3D sferoidler oluşturmadı38. Dissosiyatif meme epitel veya kanser hücreleri aljinat bazlı biyoinkslerde sadece dairesel PDMS kalıplarına yakalandığında sferoidler oluşturdu. Diğer durumlarda, sferoidler ultra düşük bağlanma dairesel kuyu plakalarında askıya alınmış damlacıklar kullanılarak oluşturulmuş ve daha sonra aljinat bazlı biyoinks39,40' a karıştırılmıştır.
Şimdi bu protokolde alternatif bir 3D doku biyomüslüm yöntemini tarif ediyoruz. Tohum ayrışmış hücreler yerine ve bu hücrelerin 3D yapıları oluşturmasını beklemek yerine, hemen kullanılabilecek bir tümör ortak kültür modeli oluşturmak için vasküler bir tüp ağında 3D tümör sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını ve biyobaskı yapılacağını açıklıyoruz. Tümör sferoidleri in vitro olarak yetiştirilebilir veya insan dokularından (organoidler) türetilebilir. Benzer şekilde, vasküler tüpler yetiştirilebilir veya yağ dokusu mikrovasküler parçalarından elde edilebilir. Biyoinksler biyolojik olarak aktif olmayan aljinattan son derece biyolojik olarak aktif Matrigel41'ekadar değişebilir. Bu 3D tümör ortak kültür modeli çeşitli hücre yapıları ve biyoinks ile oluşturulabildiğinden, birden fazla hücre tipi, hücre dışı matrisler ve kemokin gradyanları15,42. Mevcut formülasyonunda, endotel ağları perfüzyona maruz kalamasa da, gelecekteki yinelemeler bu yöntemi mikrofluidler veya yonga üzerindeki sistemlerle entegre edebilir. Endotel ağlarına biyobaskı 3D meme epitel sferoidleri, ilaç testi ve kişiselleştirilmiş hassas tıp için insan meme modellerinin hızlı biyofabrikasyonuna olanak sağlar27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Biyobaskı, in vivo doku mimarisinin kritik özelliklerini daha iyi yeniden toplayan 3D insan kanseri modelleri imal etmek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkıyor. Mevcut katman katman ekstrüzyon biyobaskısında, tek tek hücreler hiyerarşik doku kendini birleştirmeyi teşvik etmek için karmaşık mekansal ve zamansal ipuçları ile birlikte bir biyoinkte ekstrüde edilir. Bununla birlikte, bu biyofabrikasyon tekniği hücreler, biyoinksler ve biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimlere dayanır. Bu nedenle, kendi kendine montaj günler hatta haftalar sürebilir, belirli biyoinksler gerektirebilir ve her zaman birden fazla hücre tipi söz konusu olduğunda ortaya çıkmayabilir. Bu nedenle, çeşitli biyoinkslerde önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidlerini doğrudan biyobaskılamak için bir teknik geliştirdik. Biyobaskı önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidleri baskıdan sonra canlılıklarını ve polarize mimarilerini sürdürdüler. Ayrıca 3D sferoidleri vasküler endotel hücre ağlarına yazdırarak ortak kültür modeli oluşturduk. Böylece, yeni biyobaskı tekniği hızla daha düşük maliyetle ve geleneksel biyobaskı tekniklerinden daha yüksek esneklikle daha fizyolojik olarak ilgili bir 3D insan meme modeli oluşturur. Bu çok yönlü biyobaskı tekniği, ek biyoinkslerde diğer dokuların 3D modellerini oluşturmak için tahmin edilebilir.

Meme epitel hücreleri matris çözeltisi üzerinde 5-8 günlük kültürden sonra ve % 2 matris çözeltisi ile kültür ortamında 3D sferoidler halinde kendi kendine organize edilmelidir. Tümörijenik olmayan MCF10A meme epitel sferoidleri yuvarlak görünmeli ve entegre α6 sferoidin dış kenarına polarize edilmiş içi boş bir merkeze sahip olmalıdır(Şekil 1, inset içi içi boş merkezleri gösterir). Son derece invaziv MDA-MB-231 meme kanseri epitel hücreleri düzensiz sferoid...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Jelatin Metacryloyl Hidrojel Bazlı Bioinks 3D Biyobaskı Protokolleri

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...