Name: transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Academie van Finland [315948, 314387 aan N.K.]; Sigrid Jusélius Stichting [aan N.K., J.T.]; Stichting Emil Aaltonen [aan J.-A.M., T.L.]; Turks doctoraatsprogramma moleculaire geneeskunde [S.C.-M., O.O.].

Het onderhoud van laboratoriummuizen en alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften voor de verzorging en het gebruik van proefdieren in de Universiteit van Turku.
1. Bereiding van halfniferige tubuli voor microdissectie
<ol><li>Offer een volwassen mannelijke muis op (≥8 weken oud, testis 80-120 mg afhankelijk van de stam en leeftijd) via CO 2-verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. OPMERKING: De muis moet geslachtsrijp zijn en bij voorkeur minstens 8 weken oud zijn. Transilluminatiepatroon van juveniele muizen verschilt van volwassen omdat de golf van het seminifereuze epitheel nog niet volledig is vastgesteld en de timing van de eerste golf van spermatogenese duidelijk21,22is . Gebrek aan langwerpige spermatiden in <4 weken oude mannelijke muizen sluit het gebruik ervan voor transillumination-ondersteunde microdissectie uit. Alle muizenstammen met normale spermatogenese kunnen worden gebruikt.</li>
	<li>Besproei de ventrale buik met 70% ethanol. Open de abdominopelvic holte met een steriele schaar, waardoor een V-vormige opening wordt gemaakt.</li>
	<li>Trek aan de epididymale vetkussen met steriele tang, lokaliseer de teelballen, ontleed ze met een schaar en plaats ze op een steriele Petri-schaal van 100 mm met PBS. OPMERKING: Om de steriliteit te behouden, moet u ervoor zorgen dat alle laboratoriumartikelen en chirurgische hulpmiddelen steriel zijn.</li>
	<li>Met een schaar met fijne punt worden de teelballen ingekapseld door een spleet in de tunica albugineate snijden, het dikke vezelige vel dat de testis inkapselt. Scheur vervolgens de tunica open met een tang. Forceer de tubuli door met een tang te drukken en gooi de tunica weg. OPMERKING: Tijdens het weggooien van de tunica kan het voor sommige downstreamtoepassingen gunstig zijn dat arteria testicularis samen met de tunica wordt verwijderd. Voorkom beschadiging van de halfniferige tubuli.</li>
	<li>Verplaats de halfniferige tubuli naar een nieuwe Petrischaal en giet voldoende steriele PBS om de bodem van de Petrischaal te bedekken. Trek vervolgens voorzichtig de tubuli uit elkaar, maar voorkom beschadiging van de tubuli. OPMERKING: Te veel mechanische belasting zal het transilluminatiepatroon aantasten en de levensvatbaarheid van het weefsel en de cellulaire architectuur beïnvloeden. De tubuli kunnen vanaf dit punt ook worden verwerkt voor immunostainings op de hele berg zonder staging (3B). Soms volstaat het om het stadium retrospectief te definiëren door antilichamen tegen eiwitten op te nemen, uitgedrukt in differentiërende spermatogonia, zoals SALL4, c-KIT en DNMT3A18,23. De dichtheid van spermatogonia is een relatief betrouwbare fase-indicator (figuur 2).</li>
</ol>2. Transillumination-ondersteunde microdissectie
<ol><li>Plaats de Petrischaal stevig onder een dissectiemicroscoop door deze op het podium te tikken. OPMERKING: Het is belangrijk om de Petrischaal goed vast te plakken om de beweging ervan te voorkomen, wat kan leiden tot het mengen van de verzamelde geënsceneerde seminifereuze tubulisegmenten.</li>
	<li>Om het lichtabsorptiepatroon van seminifereuze tubuli onder focus te onthullen, moet u ervoor zorgen dat het monster van onderaf wordt verlicht en dat het licht door het monster gaat, d.w.z.dat het wordt getransillumineerd. OPMERKING: De hoeveelheid geabsorbeerd/verspreid licht is relatief ten opzichte van het niveau van chromatinecondensatie in langwerpige spermatiden en hun bundeling in de seminifereuze tubule: hoe meer gecondenseerd, hoe meer licht wordt geabsorbeerd, d.w.z., donkerder lijkt.</li>
	<li>Maak kennis met het lichtabsorptiepatroon van verschillende stadia zoals beschreven in figuur 2, figuur 5A en figuur S1 door voorzichtig bundels tubuli te verplaatsen met fijne tang. OPMERKING: De stadia volgen elkaar altijd in een logische volgorde en vormen de golf van seminiferous epitheel. Het is echter belangrijk om te weten dat de richting van de spermatogene golf af en toe omkeert en vervolgens weer terugkeert (ook bekend als modulaties4,9),wat de procedure soms bemoeilijkt. Ook varieert de lengte van elke fase, in termen van hoeveel mm tubulus, aanzienlijk.</li>
	<li>Til de tubule voorzichtig op met behulp van een tang met een haakpunt en snijd vervolgens een segment van de juiste lengte met behulp van een microdissectieschaar (zie aanvullende video 1). Een haak aan de punt van de tang maakt het tillen en vasthouden van een tubulus gemakkelijker en helpt om te voorkomen dat deze wordt ingedrukt. OPMERKING: De lengte van de te snijden segmenten is afhankelijk van downstreamtoepassingen. Voor de verzameling van samengevoegde tubulusstukken van een specifiek stadium voor eiwit- of RNA-analyse12,13 (II–V, VII–VIII en IX–XI, figuur 5B) is de lengte doorgaans 2-5 mm. Wanneer standaard fenol-chloroform extractie wordt gebruikt, kan ongeveer 200 ng RNA worden afgeleid van 1 mm tubulus. Voor het geheel monteren van gefaseerde buissegmenten moet de lengte van de segmenten >5 mm zijn. Voor squashpreparaten mag de lengte van segmenten niet langer zijn dan 1-2 mm, omdat de cellen in het midden van het segment mogelijk niet of te lang kunnen worden verlaten. Gebruik een mm-schaal onder de Petrischaal voor een nauwkeurige meting van de buislengte.</li>
</ol>3. Immunostaining van verschillende preparaten
<ol><li>Squashpreparaat: faseverificatie en immunostainring OPMERKING: Fasespecifieke tubulusstukken kunnen op een microscoopschuif met een afdekglas worden geplet om morfologische analyse van levende cellen uit te voeren door fasecontrastmicroscopie en daaropvolgende immunostainring. Een beginner wordt aanbevolen om deze aanpak te gebruiken om de stadia te verifiëren wanneer u kennismaakt met de transillumination-ondersteunde microdissectiemethode.<ol>
<li>Verzamel het segment in een volume van 10 μL met behulp van een pipet en verplaats het op een microscoopschuif.</li>
		<li>Plet de tubule door een afdekglas (20 mm x 20 mm) voorzichtig op de tubule te plaatsen. Als gevolg hiervan zullen cellen de tubule uitstromen en een levende celmonolaag vormen. Plaats een filterpapier op de rand van het afdekglas om het verspreiden van cellen te vergemakkelijken. Vermijd het verpletteren van de cellen te veel om ze in leven te houden.</li>
		<li>Monitor de verspreiding van cellen onder een microscoop. Gebruik een fasecontrastmicroscoop met een doelstelling van 40x om de faseherkenning te verifiëren door de aanwezige celtypen te onderzoeken (figuur 2, figuur S2).</li>
		<li>Zodra de cellen zich hebben verspreid om een ronde monolaag van beide uiteinden van de tubulus te vormen, dompelt u de glijbaan in een container met vloeibare stikstof terwijl u deze met een tang vasthoudt. Houd het 10 s onder water. U de glijbaan ook op een droogijsplaat plaatsen om in te vriezen.</li>
		<li>Verwijder het afdekglas door het af te draaien met een scalpel.</li>
		<li>Ga zonder vertraging verder met de bevestiging en plaats de schuif snel gedurende 2-5 minuten in een container met 90% ethanol. OPMERKING: Zorg ervoor dat het pompoenpreparaat niet ontdooit voordat u het op 90% ethanol plaatst. Andere fixatieven kunnen ook worden gebruikt, zoals aceton, gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Aan de lucht drogen en bewaren bij kamertemperatuur (RT) (tot enkele dagen) of bij -80 °C (langdurig).</li>
		<li>Voor immunostaining, postfixeer de monsters in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij RT.</li>
		<li>Spoel in PBS en permeabiliseer gedurende 5 minuten met 0,1% Triton X-100 in PBS.</li>
		<li>Spoel PBS af en teken een vetring rond elk squashmonster.</li>
		<li>Voeg 50–100 μL van 10% BSA (runderserumalbumine) in 0,1% Tween in PBS (PBST) toe aan de vetring en blokmonsters gedurende 30 minuten bij RT.</li>
		<li>Verwijder de BSA-oplossing en incubeer met een primair antilichaam verdund in 10% BSA in PBST gedurende 1 uur bij RT.</li>
		<li>Was 3x gedurende 5 minuten met PBST.</li>
		<li>Incubatie met een secundair antilichaam verdund in 10% BSA in PBST. OPMERKING: Om de acrosomen te bevlekken, kunnen de monsters worden geïncubeerd met Rhodamine-gelabeld Peanut agglutinine antilichaam (PNA, 1:1000) in 10% BSA in PBST gedurende 1 uur bij RT (Figuur S3) in plaats van specifieke primaire en secundaire antilichamen.</li>
		<li>Was 3x gedurende 5 minuten elk met PBST, spoel af met PBS en monteer met een mountant met DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunostaining van seminifereuze tubuli op de hele berg OPMERKING: Het onderstaande protocol beschrijft hele-mount vlekken voor geënsceneerde (vanaf stap 2.4) tubulussegmenten. Als een onderzoeker hele vlek wil uitvoeren zonder enscenering (vanaf stap 1.5), let dan op notities in 3.2.1 en 3.2.7.<ol>
<li>Breng met behulp van een pipet de buissegmenten (vanaf stap 2.4) in ijskoude PBS over in een conische buis van 15 ml en laat ze op ijs bezinken. OPMERKING: Bij gebruik van ongefaseerde tubuli vanaf 1.5. scheidt u de tubuli in een Petrischaal door meerdere keren op een gekanteld gerecht te spuiten. Gebruik een pipet van 1 ml met een gesneden punt. Deze stap is bedoeld om de structuur van het weefsel te openen. Vermijd echter te veel pipetten, omdat dit de tubuli kan beschadigen. Sedimentatie van tubuli duurt enkele tientallen seconden. Kleine tubulusfragmenten, interstitiële cellen en celresten blijven in het supernatant.</li>
		<li>Verwijder de supernatant (SN) voorzichtig door te pipetten of met een aspirator. Voeg 10 ml ijskoude PBS toe en meng door inversie.</li>
		<li>Laat bezinking en verwijder vervolgens SN zoals voorheen.</li>
		<li>Voeg 5 ml van 4% PFA toe en bevestig gedurende 5 uur op een roterende tafel (20-30 tpm) bij +4 °C. OPMERKING: De fixatietijd is afhankelijk van de eiwitten van belang en hun subcellulaire lokalisatie. Voor nucleaire en cytoplasmatische eiwitten is een fixatie van 2 uur meestal voldoende, maar membraanmarkers, zoals GFRα1 (GDNF-familiereceptor alfa 1; Figuur 6A,B), profiteren van een langere fixatie, tot 6 uur.</li>
		<li>Laat bezinken, verwijder SN (PFA) zoals voorheen en spoel kort door 10 ml PBS toe te voegen en de buis om te draaien.</li>
		<li>Laat bezinken, verwijder de SN zoals voorheen en herhaal de PBS-wasstap driemaal gedurende ten minste 10 minuten op een roterende tafel bij +4 °C en ga verder met vlekken of bewaar deze bij +4 °C. OPMERKING: Als de werkomstandigheden steriel en schoon zijn, kunnen de monsters ten minste enkele weken worden bewaard en gebruikt. U ook natrium azide toevoegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,02% (w/v) uit een voorraadoplossing van 2% om de tubuli te helpen behouden voordat u ze bij +4 °C bewaart.</li>
		<li>Beweeg met een pipet van 1 ml 10-20 vaste tubulussegmenten naar een buis met ronde bodem van 2 ml. Laat sediment en verwijder SN. OPMERKING: Als u werkt met lange tubuli die niet in scène zijn gezet, giet dan de tubuli op een Petrischaal en gebruik een microdissectieschaar en tang gesneden segmenten van ongeveer 5-20 mm. Te lange segmenten zullen tijdens de kleuringsprocedure in de war raken, terwijl te korte segmenten gemakkelijk verloren gaan.</li>
		<li>Voeg 1 ml van 2% BSA + 10% FBS (foetaal runderserum) toe in 0,3% Triton X-100 in PBS (PBSX). Blokkeer gedurende ten minste 1 uur op een roterende tafel (20-30 tpm) bij RT.</li>
		<li>Spoel af met 1 ml PBSX, verwijder SN door pipetten en voeg 250 μL primair antilichaam toe dat is verdund in 1% BSA in PBSX (1:100–1:2000 verdunning). Incubeer gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij +4 °C op een roterende tafel (20-30 tpm).</li>
		<li>Verwijder de antilichaamoplossing door de tubuli te pipetten en af te spoelen met 1 ml PBSX zoals hierboven beschreven. Was drie keer gedurende 1 uur in PBSX op een roterende tafel (20-30 tpm) bij RT. OPMERKING: Na deze eerste wasbeurt kan het monster indien nodig 's nachts op +4 °C worden achtergelaten.</li>
		<li>Verwijder SN en voeg 250 μL secundair antilichaam toe dat is verdund in 1% BSA in PBSX (meestal 1:500 verdunning van een fluorescerend antilichaam). Dek af in folie en broed gedurende 1 uur op een roterende tafel (20-30 tpm) bij RT.</li>
		<li>Herhaal 3.2.10.</li>
		<li>Verwijder ten slotte SN en giet de tubuli naar een microscoopschuif. Scheid tubuli voorzichtig en rangschik ze in lineaire strips met behulp van gellaadtips. Giet overtollige buffer af en voeg montagemedium en een dekenslip toe. OPMERKING: Vermijd het drogen van de tubuli tijdens het plaatsen ervan. Tegenkleuring van de kernen met DAPI is in de meeste gevallen niet nodig. Sluit de rand van de afdeklip af met nagellak om uitdroging en verslechtering van het monster te voorkomen. Dia's kunnen 1-2 weken bij +4 °C worden bewaard voordat ze worden gebeeldhuild.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De transilluminatie-ondersteunde microdissectiemethode die we hierboven hebben beschreven, maakt een fasegerichte aanpak mogelijk voor de studie van spermatogenese. Spermatogenese is een sterk gesynchroniseerd proces en alle belangrijke stappen tijdens de spermatogene differentiatie worden gereguleerd en uitgevoerd op een faseafhankelijke manier, zoals differentiatietoezegging (in stadia VII-VIII), het begin van meiose (VII-VIII), meiotische deling (XII), het begin van spermatoïde verlenging (VIII) en spermiatie (VIII)1,26,27. De fasegerichte analyse biedt een krachtig hulpmiddel om deze specifieke gebeurtenissen te bestuderen die beperkt zijn tot specifieke stappen van spermatogenese en daarom alleen worden gevonden in gedefinieerde stadia van de seminifereuze epitheelcyclus. Het beheersen van de methode vereist enige oefening en het gebruik van een dissectiemicroscoop van goede kwaliteit en de juiste verhelderende omstandigheden zijn de sleutel tot succes. Het implementeren van deze methode als onderdeel van de dagelijkse toolkit heeft het vermogen om de impact en biologische relevantie van onderzoek naar mannelijke voortplantingsfuncties aanzienlijk te verbeteren door nauwkeurigere dissectie van moleculaire gebeurtenissen tijdens spermatogenese mogelijk te maken.
Alle WT-muisstammen die we hebben bestudeerd, vertonen een vergelijkbaar transilluminatiepatroon en vertonen geconserveerde celassociaties in stadia van de seminifereuze epitheelcyclus. Op voorwaarde dat spermiogene differentiatie van kiemcellen niet enorm verschilt van WT-muizen, geldt hetzelfde ook voor alle knock-out muismodellen die we hebben bestudeerd. Bovendien kan het worden toegepast op andere soorten die longitudinale segmentale rangschikking vertonen van stadia van de seminiferische epitheelcyclus7. Soorten met niet-segmentale stadia (zoals de mens) kunnen echter niet worden gebruikt. Gezien de essentiële rol van chromatinecondensatie bij het verlengen van spermatiden bij het definiëren van het transilluminatiepatroon, is het duidelijk dat elke verkeerde regulering van dit proces onvermijdelijk afbreuk zal doen aan de implementatie van deze methode. Bij juveniele muizen en jongvolwassenen (5-6 weken) is het transilluminatiepatroon nog niet volledig vastgesteld en daarom mogen alleen muizen ouder dan 8 weken worden gebruikt. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat het knijpen en trekken van de tubuli onvermijdelijk het transilluminatiepatroon zal aantasten omdat het de cellulaire architectuur binnen het seminifereuze epitheel vervormt.
De geïsoleerde seminifereuze tubulisegmenten kunnen ook worden gekweekt, waardoor ex vivo observatie en manipulatie van spermatogenese-gekoppelde processen, waaronder meiose, mogelijk is. Om de levensvatbaarheid van het weefsel te waarborgen en RNA- en eiwitafbraak te voorkomen, mogen de monsters niet meer dan 2 uur na het opofferen van de muis worden verzameld en verwerkt. Voor ex vivo cultuur van seminifereuze tubuli mag de tijd van offer tot begin van cultuur niet langer zijn dan 1 uur. De integriteit van tubulusfragmenten kan meestal tot 72 uur in vitro worden gehandhaafd als ze goed worden geoogst.
De fase van de seminifereuze epitheelcyclus kan worden geverifieerd en nog nauwkeuriger worden gedefinieerd met behulp van fasecontrastmicroscopie van squashpreparaten16. Microscopie wordt uitgevoerd op levende cellen, wat een extra dimensie in de analyse biedt en observatie van organellen of celbewegingen in specifieke stadia van spermatogenese mogelijk maakt28,29,30. Fasecontrastmicroscopie biedt exacte fasering voor latere immunostainring, die een zeer gedetailleerde analyse van eiwitexpressie en lokalisatiedynamiek tijdens spermatogenese mogelijk maakt, inclusief fasespecifieke veranderingen.
Terwijl cellen worden vrijgegeven uit de epitheelcontext in squashpreparaten, maken hele-mount immunostainings van tubulisegmenten de studie van spermatogene cellen in hun fysiologische omgeving mogelijk. Daarom kunnen preparaten voor hele montage een betere visualisatie van seminifereuze tubulearchitectuur en zijn intercellulaire contacten bieden dan immunostaining op dwarsdoorsneden. Belangrijk is dat transillumination-assisted staging van de tubulesegmenten voorafgaand aan immunostaining de aanpak nog krachtiger maakt door informatie over het specifieke stadium van een bepaald segment op te nemen. Whole-mount vlekken zijn een bijzonder nuttig hulpmiddel voor de studie van cellen aan de periferie van seminifereuze tubuli, zoals peritubulaire myoïde cellen, peritubulaire macrofagen en spermatogonia, maar kunnen ook nieuwe inzichten openen in onderzoek naar meiotische en postmeiotische kiemcellen.

Differentiatie van mannelijke kiemcellen van diploïde spermatogonia tot volwassen haploïde spermatozoa, d.w.z.spermatogenese, is een complex proces dat plaatsvindt in het epitheel van seminifereuze tubuli in de teelballen van een geslachtsrijp individu1. Mitotische afstammelingen van A1 spermatogonia delen zich eerst vijf keer om de differentiatie-geëngageerde populatie uit te breiden en voeren vervolgens meiose in als spermatocyten die uiteindelijk aanleiding geven tot haploïde spermatiden. Differentiatie van ronde spermatiden in spermatozoa, d.w.z.spermiogenese, omvat complexe veranderingen in cellulaire morfologie, waaronder nucleaire verdichting en constructie van spermaspecifieke structuren zoals het acrosome en het flagellum. Bij muizen duurt het hele proces van spermatogenese 35 dagen om2,3te voltooien.
Op een bepaalde plaats herbergt het seminifereuze epitheel maximaal vijf cohorten differentiërende kiemcellen plus de kiembaanstam/voorlopercellen en de somatische Sertoli-cellen1. Differentiërende kiemcellen vormen concentrische lagen waarvan de samenstelling voorspelbaar is, en haploïde cellen bij een bepaalde ontwikkelingsstap associëren zich altijd met bepaalde soorten spermatocyten en spermatogonia4,5. Daarom herbergt elke doorsnede van een tubulus cohorten van kiemcellen met een constante samenstelling. Deze specifieke celassociaties worden gedefinieerd als de stadia van het seminifereuze epitheel. Stadia op zich vertonen geen stagnerende controlepuntachtige toestanden , maar ontwikkelen zich voortdurend naarmate de differentiatie van kiemcelcohorten vordert in synchronie1,2,6. Bij muizen zijn er 12 stadia (I-XII)2 die op een segmentale manier langs de lengteas van de seminifereuze tubulus zijn gerangschikt, en ze volgen elkaar in een logische volgorde en vormen zo de golf van seminiferous epitheel, of spermatogene golf7,8,9 ( Figuur1). Voltooiing van spermatogenese duurt vier cycli, en hiërarchische lagen of cohorten van differentiërende kiemcellen binnen elke seminifereuze tubulidoorsnede zijn tijdelijk één seminifereuze cyclus apart van elkaar. De lengte van de cyclus is soortafhankelijk en in de muis duurt elke cyclus 8,6 dagen10.
De stadia kunnen worden geïdentificeerd op basis van de cellulaire samenstelling en organisatie van het seminifereuze epitheel op histologische testissecties 5 (figuur 1 en figuur 2). Histologische analyse is echter bewerkelijk, tijdrovend en vereist bevestiging en kleuring, en kan daarom niet worden toegepast op levend weefsel. Belangrijk is dat enscenering ook kan worden uitgevoerd op levend weefsel onder een dissectiemicroscoop door gebruik te maken van verschillende lichtabsorptie/ verstrooiingspatronen die door verschillende stadia van de cyclus worden tentoongesteld (figuur 2). Het vermogen van elke fase om licht te absorberen en te verspreiden is relatief ten opzichte van het niveau van chromatinecondensatie van late post-meiotische spermatiden die een bepaald stadium host en de verpakking van deze cellen in bundels7,11. Spermatid differentiatie, d.w.z.spermiogenese, is verder onderverdeeld in 16 ontwikkelingsstappen, waaronder 8 stappen van ronde spermatid (stap 1-8) en 8 stappen van het verlengen van spermatid (stappen 9-16) differentiatie (Figuur 1). Stap 9-11 langwerpige spermatiden (stadium IX-XI) geven alleen een laag niveau van chromatinecondensatie weer, waardoor een lage hoeveelheid licht wordt geabsorbeerd. Chromatinecondensatie begint in stap 11 spermatiden (stadium XI), en stap 15-16 langwerpige spermatiden (stadium IV-VIII) bevatten volledig gecondenseerd chromatine en vertonen daarom maximale lichtabsorptie (figuur 3). Chromatine moet worden gecondenseerd om stevig in het spermahoofd te worden verpakt. Bijkomende factoren die bijdragen aan het lichtabsorptiepatroon zijn de locatie van langwerpige spermatiden in het epitheel (basaal versus apicaal) en bundeling van langwerpige spermatiden (uitgesproken in stadia II-V)11 (figuur 3). Bundels worden gezien als vlekken in het midden van de tubuli en als strepen aan de randen onder een dissectiemicroscoop en hoe meer gecondenseerd de chromatine, hoe donkerder de vlek / streep11.
Dit artikel beschrijft het gebruik van transillumination-ondersteunde microdissectiemethode voor de isolatie van seminifereuze tubulisegmenten die specifieke stadia van de seminifereuze epitheelcyclus vertegenwoordigen. Eenmaal geïsoleerd kunnen gefaseerde tubulussegmenten worden onderworpen aan verschillende downstreamanalyses, waaronder biochemische RNA - en eiwitanalyses12,13,14,15, flowcytometrie16, ex vivo tubuluscultuur17 en immunostaining18. Hier bieden we ook gedetailleerde downstreamprotocollen om geplette monolagen van gefaseerde tubulussegmenten voor te bereiden op live celmorfologische analyse en daaropvolgende immunostaining, evenals hele-mount immunostainings van tubulussegmenten. De werkstroom in een notendop in beschreven in figuur 4.
De transillumination-ondersteunde microdissectiemethode maakt nauwkeurige identificatie en isolatie van kiemcellen mogelijk in specifieke stappen van differentiatie dankzij de gesynchroniseerde cellulaire samenstelling van de stadia. Belangrijk is dat het ook de studie van stadiumafhankelijke gebeurtenissen tijdens spermatogenese op levend weefsel mogelijk maakt. Gezien het ontbreken van schaalbare in vitro modellen voor spermatogenese, heeft deze methode ook een uniek voordeel dat gerichte ontwikkelings - en toxicologische studies op korte termijn mogelijk zijn voor stadiumspecifieke tubulisegmenten ex vivo12,17. Hoewel we hier de methode voor de muis beschrijven, kan dezelfde procedure worden toegepast op elke zoogdiersoort met longitudinale en segmentale rangschikking van seminifereuze epitheelstadia, zoals de rat4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Spermatogenese is een uniek differentiatieproces dat uiteindelijk aanleiding geeft tot een van de meest verschillende celtypen van het lichaam, het sperma. Differentiatie van kiemcellen vindt plaats in de cytoplasmatische zakken van somatische Sertoli-cellen die 4 tot 5 generaties kiemcellen tegelijkertijd hosten en hun ontwikkeling coördineren en synchroniseren. Daarom is de samenstelling van kiemceltypen binnen een doorsnede constant, en deze celassociaties staan ook bekend als stadia (I-XII) van de seminifereuze epitheelcyclus. Belangrijk is dat stadia ook kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van intacte seminifereuze tubuli op basis van hun differentiële lichtabsorptie/ verstrooiingskenmerken die door transilluminatie worden onthuld, en het feit dat de stadia elkaar in een numerieke volgorde langs de tubulus volgen. Dit artikel beschrijft een transillumination-ondersteunde microdissectiemethode voor de isolatie van seminifereuze tubulussegmenten die specifieke stadia van de seminifereuze epitheelcyclus van muizen vertegenwoordigen. Het lichtabsorptiepatroon van seminifereuze tubuli wordt eerst geïnspecteerd onder een dissectiemicroscoop en vervolgens worden tubulisegmenten die specifieke stadia vertegenwoordigen gesneden en gebruikt voor downstreamtoepassingen. Hier beschrijven we immunostainingprotocollen voor podiumspecifieke squashpreparaten en voor intacte tubulussegmenten. Deze methode stelt een onderzoeker in staat om zich te concentreren op biologische gebeurtenissen die plaatsvinden in specifieke fasen van spermatogenese, waardoor een uniek hulpmiddel wordt geboden voor ontwikkelings-, toxicologische en cytologische studies van spermatogenese en onderliggende moleculaire mechanismen.

Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Dit protocol beschrijft transillumination-ondersteunde microdissectie van segmenten van volwassen muis seminifereuze tubuli die specifieke stadia van seminifereuze epitheelcyclus vertegenwoordigen, en celtypen daarin, en daaropvolgende immunostaining van squashpreparaten en intacte tubulussegmenten.

Transillumination-Assisted Dissectie van specifieke stadia van de muis seminifereuze epitheelcyclus voor downstream immunostaininganalyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolatie van Mouse Endometrial epitheliale en stromale cellen voor<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualisatie

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissectie en Cultuur van Muis Embryonale Nier

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...