Name: transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de l’Académie de Finlande [315948, 314387 à N.K.]; Fondation Sigrid Jusélius [à N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [à J.-A.M., T.L.]; Turku Doctoral Programme of Molecular Medicine [S.C.-M., O.O.].

L’entretien des souris de laboratoire et de toutes les expériences sur les animaux a été effectué conformément aux lignes directrices et règlements pertinents pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire à l’Université de Turku.
1. Préparation de tubules séminifères pour la microdissection
<ol><li>Sacrifier une souris mâle adulte (≥8 semaines, testis 80-120 mg selon la souche et l’âge) par asphyxie au CO2 suivie d’une dislocation cervicale. REMARQUE : La souris doit être mature sexuellement et de préférence d’au moins 8 semaines. Le modèle de transillumination des souris juvéniles diffère de l’adulte parce que l’onde de l’épithélium séminifique n’a pas encore été entièrement établie, et le moment de la première vague de spermatogenèse est distinct21,22. Le manque de spermatids allongés chez des souris mâles de 4 semaines empêche leur utilisation pour la microdissection assistée par transillumination. Toutes les souches de souris qui ont une spermatogenèse normale peuvent être utilisées.</li>
	<li>Vaporiser l’abdomen ventral de 70 % d’éthanol. Ouvrez la cavité abdominopelvienne à l’aide de ciseaux stériles, en faisant une ouverture en forme de V.</li>
	<li>Tirant sur le tampon de graisse épididymale avec des forceps stériles, localisez les testicules, disséquez-les à l’aide de ciseaux et placez-les sur une boîte de Pétri stérile de 100 mm contenant du PBS. REMARQUE : Pour maintenir la stérilité, assurez-vous que tous les outils de laboratoire et chirurgicaux sont stériles.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux à pointe fine décapsulent les testicules en coupant une fente dans le tunica albuginea,l’épaisse feuille fibreuse encapsulant les testicules. Puis déchirer la tunica ouverte à l’aide d’une paire de forceps. Forcer les tubules en appuyant avec des forceps et jeter la tunica. REMARQUE : Tout en jetant la tunica, il pourrait être avantageux pour certaines applications en aval que l’artéiculaire testiculaire soit enlevée avec la tunica. Évitez d’endommager les tubules séminifères.</li>
	<li>Déplacez les tubules séminifères dans une nouvelle boîte de Pétri et versez suffisamment de PBS stérile pour couvrir le fond de la boîte de Pétri. Ensuite, retirez doucement les tubules, mais évitez d’endommager les tubules. REMARQUE : Trop de stress mécanique emprisera le modèle de transillumination et affectera la viabilité du tissu et de son architecture cellulaire. Les tubules peuvent également être traités pour des immunostainings de montage entier à partir de ce point sans mise en scène (3B). Parfois, il suffit de définir la scène rétrospectivement en incluant des anticorps contre les protéines exprimées dans la différenciation spermatogonia, tels que SALL4, c-KIT et DNMT3A18,23. La densité du spermatogonia est un indicateur de stade relativement fiable (Figure 2).</li>
</ol>2. Microdissection assistée par transillumination
<ol><li>Placez fermement la boîte de Pétri sous un microscope à dissection en l’enlanant sur scène. REMARQUE : Il est important d’enregistrer bien la boîte de Pétri pour empêcher son mouvement qui pourrait causer le mélange des segments de tubule séminifères mis en scène rassemblés.</li>
	<li>Pour révéler le modèle d’absorption de la lumière des tubules séminifères sous mise au point, assurez-vous que l’échantillon est éclairé d’en bas et que la lumière traverse l’échantillon, c’est-à-direqu’il est transilluminé. REMARQUE : La quantité de lumière absorbée/dispersée est par rapport au niveau de condensation de chromatine dans les spermatids allongés et à leur regroupement à l’intérieur du tubule séminifère : plus il est condensé, plus la lumière est absorbée, c’est-à-dire qu’elleapparaît plus foncée.</li>
	<li>Familiarisez-vous avec le modèle d’absorption de la lumière des différentes étapes tel que décrit dans la figure 2, la figure 5A et la figure S1 en déplaçant soigneusement des faisceaux de tubules à l’aide de forceps fins. REMARQUE : Les étapes se suivent toujours dans un ordre logique, formant la vague de l’épithélium séminifère. Cependant, il est important de savoir que la direction de l’onde spermatogénique s’inverse parfois, puis revient à nouveau (également connu sous le nom de modulations4,9), compliquant parfois la procédure. En outre, la longueur de chaque étape, en termes de combien de mm de tubule, varie considérablement.</li>
	<li>Soulevez soigneusement le tubule d’intérêt à l’aide de forceps avec une pointe accrochée, puis coupez un segment de longueur appropriée à l’aide de ciseaux de microdissection (voir vidéo supplémentaire 1). Un crochet à l’extrémité des forceps facilite le levage et la tenue d’un tubule et aide à éviter de le presser. REMARQUE : La longueur des segments à couper dépend des applications en aval. Pour la collecte de morceaux de tubule mis en commun d’une étape spécifique pour l’analyse des protéines ou del’ARN 12,13 (II-V, VII-VIII et IX-XI, figure 5B),la longueur est généralement de 2-5 mm. Lorsque l’extraction standard phénol-chloroforme est utilisée, environ 200 ng d’ARN peuvent être dérivés de 1 mm de tubule. Pour la coloration de montage entier des segments de tubule mis en scène, la longueur des segments devrait être >5 mm. Pour les préparations de courge, la longueur des segments ne doit pas dépasser 1 à 2 mm parce que les cellules au milieu du segment peuvent ne pas sortir si elles sont trop longues. Utilisez une échelle de mm sous la boîte de Pétri pour une mesure précise de la longueur du tubule.</li>
</ol>3. Immunostaining de différentes préparations
<ol><li>Préparation de courge : vérification de stade et immunostaining REMARQUE : Des morceaux de tubule spécifiques à l’étape peuvent être écrasés sur une lame de microscope avec un verre de couverture pour effectuer l’analyse morphologique des cellules vivantes par microscopie de phase-contraste et immunostaining suivant. Un débutant est recommandé d’utiliser cette approche pour vérifier les étapes lors de la connaissance de la méthode de microdissection assistée par transillumination.<ol>
<li>Recueillir le segment dans un volume de 10 μL à l’aide d’une pipette et le déplacer sur une lame de microscope.</li>
		<li>Écraser le tubule en plaçant soigneusement un verre de couverture (20 mm x 20 mm) sur le tubule. En conséquence, les cellules s’écoulent du tubule et forment un monocouche à cellules vivantes. Placez un papier filtre sur le bord du verre de couverture pour faciliter la propagation des cellules. Évitez trop d’écraser les cellules pour les garder en vie.</li>
		<li>Surveiller la propagation des cellules au microscope. Utilisez un microscope à contraste de phase à l’objectif 40x pour vérifier la reconnaissance par étapes en examinant les types de cellules présents (figure 2, figure S2).</li>
		<li>Une fois que les cellules se sont propagées pour former un monomouche rond des deux extrémités du tubule, trempez la glissière dans un récipient contenant de l’azote liquide tout en la tenant avec des forceps. Gardez-le immergé pendant 10 s. Placez alternativement la glissade sur une plaque de glace sèche pour le gel.</li>
		<li>Retirer le verre de couverture en le renversant à l’aide d’un scalpel.</li>
		<li>Sans délai, procéder à la fixation et placer rapidement la glissière dans un récipient avec 90% d’éthanol pendant 2-5 min. REMARQUE : Assurez-vous que la préparation de la courge ne dégèle pas avant de la placer à 90 % d’éthanol. D’autres fixatifs peuvent également être utilisés, comme l’acétone, pendant 10 min.</li>
		<li>Sécher à l’air et les conserver à température ambiante (RT) (jusqu’à quelques jours) ou à -80 °C (à long terme).</li>
		<li>Pour l’immunostaining, post-fixer les échantillons dans 4% paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min à RT.</li>
		<li>Rincer en PBS et perméabilizer avec 0,1% Triton X-100 en PBS pendant 5 min.</li>
		<li>Rincer au PBS et dessiner un anneau de graisse autour de chaque échantillon de courge.</li>
		<li>Ajouter 50 à 100 μL de 10 % de BSA (albumine de sérum bovin) dans 0,1 % de préadolescent dans le PBS (PBST) à l’intérieur de l’anneau de graisse et bloquer les échantillons pendant 30 min à RT.</li>
		<li>Retirez la solution BSA et incubez avec un anticorps primaire dilué dans 10% BSA en PBST pendant 1 h à RT.</li>
		<li>Laver 3x pendant 5 min avec PBST.</li>
		<li>Incuber avec un anticorps secondaire dilué dans 10% BSA en PBST. REMARQUE : Pour tacher les acrosomes, les échantillons peuvent être incubés avec de l’anticorps agglutinine d’arachide étiqueté rhodamine (PNA, 1:1000) dans 10% BSA en PBST pendant 1 h à RT (figure S3) au lieu d’anticorps primaires et secondaires spécifiques.</li>
		<li>Laver 3x pendant 5 min chacun avec PBST, rincer avec PBS et monter avec un support contenant DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunostaining de montage entier des tubules seminifères REMARQUE : Le protocole ci-dessous décrit la coloration de montage entier pour les segments de tubules mis en scène (à partir de l’étape 2.4). Si un chercheur veut effectuer des taches de montage entier sans mise en scène (à partir de l’étape 1.5), faites attention aux notes en 3.2.1 et 3.2.7.<ol>
<li>À l’aide d’une pipette, transférer les segments tubules (de l’étape 2.4) dans un PBS glacé dans un tube conique de 15 mL et leur permettre de sédimenter sur la glace. REMARQUE : Si vous utilisez des tubules non mis en scène à partir de 1,5,, séparez les tubules dans une boîte de Pétri en érigés de haut en arrière sur un plat incliné plusieurs fois. Utilisez une pipette de 1 mL avec une pointe coupée. Cette étape vise à ouvrir la structure du tissu. Cependant, évitez trop de pipetage car il pourrait endommager les tubules. La sédimentation des tubules prendra quelques dizaines de secondes. De petits fragments de tubules, des cellules interstitielles et des débris cellulaires restent dans le supernatant.</li>
		<li>Retirez soigneusement le supernatant (SN) par pipetting ou avec un aspirateur. Ajouter 10 mL de PBS glacé et mélanger par inversion.</li>
		<li>Laisser sédimenter, puis enlever le SN comme avant.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de 4% de PFA et fixer pendant 5 h sur une table rotative (20-30 rpm) à +4 °C. REMARQUE : Le temps de fixation dépend des protéines d’intérêt et de leur localisation subcellulaire. Pour les protéines nucléaires et cytoplasmiques, une fixation de 2 h est généralement suffisante, cependant, des marqueurs membranaires, tels que GFRα1 (récepteur familial GDNF alpha 1; Figure 6A,B), bénéficier d’une fixation plus longue, jusqu’à 6 h.</li>
		<li>Laisser sédimenter, enlever le SN (PFA) comme avant, et rincer brièvement en ajoutant 10 mL de PBS et en inversant le tube.</li>
		<li>Laisser sédimenter, enlever le SN comme avant, et répéter l’étape de lavage PBS trois fois pendant au moins 10 min chacun sur une table rotative à +4 °C et procéder à la coloration ou le stocker à +4 °C. REMARQUE : Si les conditions de travail sont stériles et propres, les échantillons peuvent être stockés et utilisés pendant au moins quelques semaines. Sinon, ajoutez de l’azide de sodium à une concentration finale de 0,02 % (w/v) à partir d’une solution de stock de 2 % pour aider à préserver les tubules avant de les stocker à +4 °C.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette de 1 mL, déplacez 10 à 20 segments de tubules fixes vers un tube à fond rond de 2 mL. Laisser sédimenter et enlever le SN. REMARQUE : Si vous travaillez avec de longs tubules qui n’ont pas été mis en scène, versez les tubules sur une boîte de Pétri et à l’aide de ciseaux de microdissection et de forceps coupent des segments d’environ 5 à 20 mm. Les segments trop longs s’emmêlent pendant la procédure de coloration, tandis que les segments trop courts sont facilement perdus.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de 2% BSA + 10% FBS (sérum bovin fœtal) dans 0,3% Triton X-100 en PBS (PBSX). Bloquez pendant au moins 1 h sur une table rotative (20-30 tr/min) à RT.</li>
		<li>Rincer avec 1 mL de PBSX, retirer le SN par pipetting et ajouter 250 μL d’anticorps primaires dilués dans 1% BSA dans PBSX (1:100-1:2000 dilution). Incuber pendant 2 h à RT ou toute la nuit à +4 °C sur une table rotative (20-30 tr/min).</li>
		<li>Retirez la solution d’anticorps en pipetage et rincez les tubules avec 1 mL de PBSX comme ci-dessus. Laver trois fois pendant 1 h en PBSX sur une table rotative (20-30 tr/min) à RT. REMARQUE : Après ce premier lavage, l’échantillon peut être laissé toute la nuit à +4 °C si nécessaire.</li>
		<li>Retirer le SN et ajouter 250 μL d’anticorps secondaires dilués dans 1 % de BSA dans PBSX (dilution généralement de 1 500 d’un anticorps étiqueté fluorescent). Couvrir de papier d’aluminium et incuber sur une table rotative (20-30 tr/min) à RT pendant 1 h.</li>
		<li>Répétez 3.2.10.</li>
		<li>Enfin enlever le SN et verser les tubules sur une lame de microscope. Séparer délicatement et disposer les tubules en bandes linéaires à l’aide de pointes de chargement de gel. Égoutter l’excès de tampon et ajouter le milieu de montage et un coverslip. REMARQUE : Évitez de sécher les tubules tout en les arrangeant. La contre-coloration des noyaux avec dapi n’est pas nécessaire dans la plupart des cas. Sceller le bord du coverslip avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et la détérioration de l’échantillon. Les diapositives peuvent être stockées pendant 1 à 2 semaines à +4 °C avant l’imagerie.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode de microdissection assistée par transillumination que nous avons décrite ci-dessus permet une approche axée sur le stade pour l’étude de la spermatogenèse. La spermatogenèse est un processus hautement synchronisé, et toutes les étapes clés de la différenciation spermatogénique sont régulées et exécutées d’une manière dépendante de l’étape, telles que l’engagement de différenciation (aux stades VII-VIII), l’apparition de la méiose (VII-VIII), les divisions méiotiques (XII), l’apparition de l’allongement du spermatodon (VIII) et la spermiation (VIII)1,26,27. L’analyse scénique fournit un outil puissant pour étudier ces événements particuliers qui sont limités à des étapes spécifiques de la spermatogenèse et ne se trouvent donc qu’à des stades définis du cycle épithélial séminifère. Maîtriser la méthode demande une certaine pratique et l’utilisation d’un microscope de dissection de bonne qualité et des conditions d’éclairage appropriées sont la clé du succès. La mise en œuvre de cette méthode dans le cadre de la boîte à outils quotidienne a la capacité d’améliorer considérablement l’impact et la pertinence biologique de la recherche sur les fonctions reproductives masculines en permettant une dissection plus précise des événements moléculaires pendant la spermatogenèse.
Toutes les souches de souris WT que nous avons étudiées présentent un modèle de transillumination similaire et présentent des associations cellulaires conservées aux stades du cycle épithélial séminifère. À condition que la différenciation spermiogénique des cellules germinales ne soit pas très différente des souris WT, la même chose s’applique également à tous les modèles de souris knock-out que nous avons étudiés. En outre, il peut être appliqué à d’autres espèces qui présentent un arrangement segmental longitudinal des stades du cycle épithélial séminifique7. Toutefois, les espèces dont les stades ne sont pas segmentaux (comme l’homme) ne peuvent pas être utilisées. Étant donné le rôle essentiel de la condensation de la chromatine dans l’allongement des spermatatids dans la définition du modèle de transillumination, il est clair que toute mauvaise réglementation de ce processus empiilait inévitablement la mise en œuvre de cette méthode. Chez les souris juvéniles et les jeunes adultes (5-6 semaines), le modèle de transillumination n’a pas encore été pleinement établi, et, par conséquent, seules les souris de plus de 8 semaines devraient être utilisées. Il est également important de garder à l’esprit que la compression et la traction des tubules empièteront inévitablement sur le modèle de transillumination parce qu’elles déforment l’architecture cellulaire dans l’épithélium séminifère.
Les segments isolés de tubule séminifère peuvent également être cultivés permettant l’observation ex vivo et la manipulation des processus spermatogenesis-couplés, y compris la méiose. Pour assurer la viabilité du tissu et prévenir la dégradation de l’ARN et des protéines, les échantillons doivent être prélevés et traités au plus tard 2 heures après avoir sacrifié la souris. Pour la culture ex vivo des tubules séminifères, le temps du sacrifice à l’apparition de la culture ne doit pas dépasser 1 heure. L’intégrité des fragments de tubules peut généralement être maintenue jusqu’à 72 heures in vitro si elle est récoltée correctement.
Le stade du cycle épithélial séminifère peut être vérifié et encore plus précisément défini à l’aide de la microcopie de contraste de phase des préparations decourge 16. La microscopie est effectuée sur les cellules vivantes, ce qui fournit une dimension supplémentaire dans l’analyse et permet l’observation des mouvements organiques ou cellulaires à des stades spécifiques de la spermatogenèse28,29,30. La microscopie de contraste de phase fournit la mise en scène exacte pour l’immunostaining suivant, qui permet l’analyse très détaillée de l’expression de protéine et de la dynamique de localisation pendant la spermatogenèse, y compris les changements étape-spécifiques.
Tandis que les cellules sont libérées du contexte épithélial dans des préparations de courge, les immunostainings de montage entier des segments de tubule permettent l’étude des cellules spermatogenic dans leur environnement physiologique. Par conséquent, les préparations de montage entier peuvent fournir une meilleure visualisation de l’architecture de tubule séminifère et de ses contacts intercellulaires que l’immunostaining sur des sections transversales. Fait important, la mise en scène assistée par transillumination des segments tubules avant l’immunostaining rend l’approche encore plus puissante en incluant des informations sur l’étape spécifique d’un segment donné. La coloration de montage entier est un outil particulièrement utile pour l’étude des cellules à la périphérie des tubules séminifères, tels que les cellules myoïdes peritubulaires, les macrophages périphériques et la spermatogonie, mais pourrait également ouvrir de nouvelles perspectives dans la recherche sur les cellules germinales méiotiques et postméiotiques.

La différenciation des cellules germinales mâles de la spermatogonie diploïde au spermatozoa haploïde mature, c’est-à-dire la spermatogenèse, est un processus complexe qui a lieu dans l’épithélium des tubules séminifères dans les testicules d’un individu sexuellement mature1. Les descendants mitotiques de la spermatogonie A1 se divisent d’abord cinq fois pour augmenter la population engagée par différenciation, puis entrent dans la méiose sous forme de spermatoocytes qui donnent finalement naissance à des spermatides haploïdes. La différenciation des spermatozods ronds en spermatozoa, c’est-à-dire la spermiogenèse, implique des changements complexes dans la morphologie cellulaire, y compris le compactage nucléaire et la construction de structures spécifiques au sperme telles que l’acrosome et le flagellum. Chez la souris, l’ensemble du processus de spermatogenèse prend 35 jours pour terminer2,3.
À n’importe quel endroit donné, l’épithélium séminifère accueille jusqu’à cinq cohortes de cellules germinales différenciantes plus les cellules souches/progénitrices germinales et les cellules somatiques sertoli1. Les cellules germinales différenciantes forment des couches concentriques dont la composition est prévisible, et les cellules haploïdes à un pas donné de développement s’associent toujours à certains types de spermatocytes et de spermatogonia4,5. Par conséquent, n’importe quelle section transversale d’un tubule accueille des cohortes de cellules germinales d’une composition constante. Ces associations cellulaires spécifiques sont définies comme les stades de l’épithélium séminifère. Les stades en soi ne présentent pas d’états stagnants de type check-point, mais se développent continuellement à mesure que la différenciation des cohortes de cellules germinales progresse ensynchronie 1,2,6. Chez la souris, il y a 12 étapes (I-XII)2 qui sont disposées de façon segmentale le long de l’axe longitudinal du tubule séminifère, et elles se suivent dans un ordre logique formant ainsi l’onde de l’épithélium séminifère, ou vague spermatogénique7,8,9 ( Figure1). L’achèvement de la spermatogenèse prend quatre cycles, et les couches hiérarchiques ou les cohortes de cellules germinales différenciantes dans n’importe quelle section transversale de tubule séminifère sont temporellement un cycle séminifère indépendamment les uns des autres. La durée du cycle dépend des espèces et chez la souris chaque cycle prend 8,6 jours10.
Les stades peuvent être identifiés sur la base de la composition cellulaire et de l’organisation de l’épithélium séminifère sur les sections5 des testicules histologiques (figure 1 et figure 2). Cependant, l’analyse histologique est laborieuse, chronophage et nécessite une fixation et une coloration, et ne peut donc pas être appliquée aux tissus vivants. Fait important, la mise en scène peut également être effectuée sur des tissus vivants sous un microscope à dissection en profitant de modèles distincts d’absorption/dispersion de la lumière exposés à différentes étapes du cycle (figure 2). La capacité de chaque étape d’absorber et de disperser la lumière est relative au niveau de condensation de chromatine des spermatatids post-méiotiques tardifs que n’importe quel hôte de stade donné et l’emballage de ces cellules dans les faisceaux7,11. La différenciation spermatid, c’est-à-direla spermiogenèse, est encore divisée en 16 étapes de développement, y compris 8 étapes de spermatid ronde (étape 1-8) et 8 étapes de différenciation du spermatid allongé (étapes 9-16) (figure 1). Les spermatids allongés de l’étape 9-11 (stade IX-XI) n’affichent qu’un faible niveau de condensation de chromatine, ce qui entraîne l’absorption d’une faible quantité de lumière. La condensation de chromatine commence à l’étape 11 spermatids (stade XI), et l’étape 15-16 allongeant les spermatatids (stade IV-VIII) contiennent la chromatine entièrement condensée, et présentent donc une absorption maximale de lumière (figure 3). La chromatine doit être condensée afin d’être bien emballée dans la tête du sperme. D’autres facteurs qui contribuent au modèle d’absorption de la lumière sont l’emplacement des spermatatids allongés dans l’épithélium (basal vs apical) et le regroupement des spermatatids allongés (prononcés aux stades II-V)11 (Figure 3). Les faisceaux sont considérés comme des taches au milieu des tubules et comme des rayures sur les bords sous un microscope de dissection et plus la chromatine est condensée, plus la tache/bande11 est foncée.
Cet article décrit l’utilisation de la méthode de microdissection transillumination-aidée pour l’isolement des segments seminifères de tubule représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifère. Une fois isolés, les segments de tubules mis en scène peuvent faire l’objet de diverses analyses en aval, y compris les analyses biochimiquesde l’ARN et des protéines 12,13,14,15, cytométrie du débit16, culture ex vivo tubule17 et immunostaining18. Ici, nous fournissons également des protocoles détaillés en aval pour préparer les monocouches écrasées des segments de tubules par étapes pour l’analyse morphologique des cellules vivantes et l’immunostaining subséquent, ainsi que des immunostainings de montage entier des segments de tubule. Le flux de travail en un mot décrit dans la figure 4.
La méthode de microdissection assistée par transillumination permet l’identification et l’isolement précis des cellules germinales à des étapes spécifiques de différenciation grâce à la composition cellulaire synchronisée des stades. Fait important, il permet également l’étude d’événements dépendant des stades pendant la spermatogenèse sur les tissus vivants. Étant donné l’absence de modèles in vitro évolutifs pour la spermatogenèse, cette méthode a également un avantage unique de permettre des études développementales et toxicologiques ciblées à court terme sur des segments tubules spécifiques à l’étape ex vivo12,17. Alors que nous décrivons la méthode ici pour la souris, la même procédure peut être appliquée à toutes les espèces de mammifères avec arrangement longitudinal et segmental des stades épithéliales séminifères, tels que le rat4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Spermatogenesis est un processus de différenciation unique qui donne finalement lieu à l’un des types de cellules les plus distincts du corps, le sperme. La différenciation des cellules germinales a lieu dans les poches cytoplasmiques des cellules somatiques sertoli qui hébergent simultanément 4 à 5 générations de cellules germinales et coordonnent et synchronisent leur développement. Par conséquent, la composition des types de cellules germinales dans une section transversale est constante, et ces associations cellulaires sont également connues sous le nom de stades (I-XII) du cycle épithélial séminifère. Fait important, les stades peuvent également être identifiés à partir de tubules séminifères intacts en fonction de leurs caractéristiques différentielles d’absorption/dispersion de la lumière révélées par la transillumination, et du fait que les stades se suivent le long du tubule dans un ordre numérique. Cet article décrit une méthode de microdissection transillumination-aidée pour l’isolement des segments seminifères de tubule représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifique de souris. Le modèle d’absorption de la lumière des tubules séminifères est d’abord inspecté au microscope à dissection, puis les segments de tubules représentant des étapes spécifiques sont coupés et utilisés pour des applications en aval. Ici, nous décrivons les protocoles d’immunostaining pour les préparations de courges spécifiques à l’étape et pour les segments intacts de tubule. Cette méthode permet à un chercheur de se concentrer sur les événements biologiques qui se déroulent à des phases spécifiques de spermatogenèse, fournissant ainsi un outil unique pour les études développementales, toxicologiques et cytologiques de la spermatogenèse et des mécanismes moléculaires sous-jacents.

Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Ce protocole décrit la microdissection transillumination-aidée des segments des tubules séminifères adultes de souris représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifère, et des types de cellules là, et l’immunostaining suivant des préparations de courge et des segments intacts de tubule.

Dissection assistée par transillumination d’étapes spécifiques du cycle épithélial séminifique de la souris pour les analyses d’immunostaining en aval

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolement de souris endométriale épithéliales et stromales Cellules pour<em&gt; In vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissection et culture du rein embryonnaire de la souris

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Une Technique de Squash de tube séminifère pour l’analyse cytologique de la spermatogenèse en utilisant le modèle de souris

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissection, culture et analyse des cellules neurales primaires de crête neurale de la souris pour l'étude de la délamination et de la migration neurales de cellules de crête

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...