Name: transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

इस काम को फिनलैंड अकादमी [315948, 314387 से एनके] के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; सिग्रिड जुसेलियस फाउंडेशन [एनके, जेटी के लिए]; एमिल Aaltonen फाउंडेशन [जे-ए.M, T.L.]; तुरकू डॉक्टोरल प्रोग्राम ऑफ मॉलिक्यूलर मेडिसिन [एस.C-एम., ओ.ओ.] ।

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	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हमारे ऊपर वर्णित ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि शुक्राणुओं के अध्ययन के लिए एक चरण उन्मुख दृष्टिकोण को सक्षम बनाती है। शुक्राणुएटोजेनेसिस एक अत्यधिक सिंक्रोनाइज्ड प्रक्रिया है, और शुक्राणुजनित विभेदन के दौरान सभी प्रमुख चरणों को चरणबद्ध रूप से सीमित और निष्पादित किया जाता है, जैसे कि विभेदन प्रतिबद्धता (सातवीं-आठवीं चरणों में), मेयोसिस (सातवीं-आठवीं), मेयोटिक डिवीजनों (बारहवीं) की शुरुआत, शुक्राणु विस्तार (आठवीं) और शुक्राणुना(आठवीं)1,26,27। चरण उन्मुख विश्लेषण इन विशेष घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है जो शुक्राणुओं के विशिष्ट चरणों तक सीमित हैं और इसलिए केवल अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के परिभाषित चरणों में पाए जाते हैं। विधि माहिर कुछ अभ्यास लेता है और एक अच्छी गुणवत्ता विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और उचित रोशन स्थितियों सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । रोजमर्रा के टूलकिट के एक भाग के रूप में इस विधि को लागू करने के लिए शुक्राणुओं के दौरान आणविक घटनाओं के अधिक सटीक विच्छेदन की अनुमति देकर पुरुष प्रजनन कार्यों पर अनुसंधान के प्रभाव और जैविक प्रासंगिकता में बहुत सुधार करने की क्षमता है।
सभी डब्ल्यूटी माउस उपभेदों कि हमने अध्ययन किया है एक समान ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न प्रदर्शित करता है और अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरणों में संरक्षित सेल संघों को प्रदर्शित करता है। इस शर्त पर कि रोगाणु कोशिकाओं का शुक्राणुजनित विभेदन डब्ल्यूटी चूहों से बिल्कुल अलग नहीं है, यही उन सभी नॉकआउट माउस मॉडल पर भी लागू होता है जिनका हमने अध्ययन किया है। इसके अलावा, इसे अन्य प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है जो अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र7के चरणों की देशांतर खंडीय व्यवस्था प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, गैर-सेगमेंटल चरणों (जैसे मानव) वाली प्रजातियों का उपयोग नहीं किया जा सकता है। ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न को परिभाषित करने में शुक्राणुओं को बढ़ाने में क्रोमेटिन संघनन की आवश्यक भूमिका को देखते हुए, यह स्पष्ट है कि इस प्रक्रिया का कोई भी गलतीकरण अनिवार्य रूप से इस विधि के कार्यान्वयन पर अतिक्रमण करेगा । किशोर चूहों और युवा वयस्कों (5-6 सप्ताह) में ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न अभी तक पूरी तरह से स्थापित नहीं किया गया है, और इसलिए, केवल 8 सप्ताह से पुराने चूहों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह भी ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि ट्यूबलों को निचोड़ना और खींचना अनिवार्य रूप से ट्रांसिल्यूमिनेशन पैटर्न पर अतिक्रमण करेगा क्योंकि यह अर्धनिफेरस एपिथेलियम के भीतर सेलुलर वास्तुकला को विकृत करता है।
अलग-थलग सेमिनिफेरस ट्यूबल सेगमेंट को पूर्व वीवो अवलोकन और मेयोसिस सहित शुक्राणुओं के युग्मित प्रक्रियाओं में हेरफेर को सक्षम करने के लिए भी सुसंस्कृत किया जा सकता है। ऊतक की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने और आरएनए और प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए, नमूनों को एकत्र किया जाना चाहिए और माउस का त्याग करने के 2 घंटे से अधिक समय तक संसाधित नहीं किया जाना चाहिए। अर्धनिफेरस ट्यूबल्स की पूर्व वीवो संस्कृति के लिए, बलिदान से संस्कृति की शुरुआत तक का समय 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। ट्यूबल टुकड़ों की अखंडता आम तौर पर विट्रो में ७२ घंटे तक बनाए रखा जा सकता है अगर ठीक से काटा ।
सेमीनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरण को सत्यापित किया जा सकता है और स्क्वैश तैयारी के चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और भी अधिक सटीक रूप से परिभाषित किया जा सकता है16। माइक्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं पर किया जाता है, जो विश्लेषण में एक अतिरिक्त आयाम प्रदान करता है औरशुक्राणु28, 29,30के विशिष्ट चरणों में ऑर्गेनेल या कोशिका आंदोलनों के अवलोकन की अनुमति देता है। चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी बाद में इम्यूनोस्टेपिंग के लिए सटीक मंचन प्रदान करता है, जो शुक्राणुओं के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण गतिशीलता का बहुत विस्तृत विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है, जिसमें चरण-विशिष्ट परिवर्तन शामिल हैं।
जबकि कोशिकाओं को स्क्वैश तैयारी में एपिथेलियल संदर्भ से जारी किया जाता है, ट्यूबल सेगमेंट के पूरे माउंट इम्यूनोस्टेटिंग अपने शारीरिक वातावरण में शुक्राणुओं की कोशिकाओं के अध्ययन को सक्षम करते हैं। इसलिए, पूरे माउंट तैयारी सेमिनिफेरस ट्यूबल आर्किटेक्चर और क्रॉस-सेक्शन पर इम्यूनोसटेनिंग की तुलना में इसके अंतरकोशिकीय संपर्कों का बेहतर दृश्य प्रदान कर सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इम्यूनोस्टेपिंग से पहले ट्यूबल सेगमेंट के ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड स्टेजिंग किसी दिए गए सेगमेंट के विशिष्ट चरण पर जानकारी को शामिल करके दृष्टिकोण को और भी शक्तिशाली बनाता है। पूरे माउंट धुंधला सेमिनिफेरस ट्यूबलों की परिधि में कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी उपकरण है, जैसे पेरिटुबुलर मायोइड कोशिकाएं, पेरिटुब्युलर मैक्रोफेज और शुक्राणुटोगोनिया, लेकिन मेइओटिक और पोस्टमेयोटिक रोगाणु कोशिकाओं पर शोध में उपन्यास अंतर्दृष्टि भी खोल सकता है।

डिप्लोइड शुक्राणुओं से परिपक्व हैप्लॉयड स्पर्मटोगोनिया यानीशुक्राणुओं की कोशिकाओं का भेदभाव एक जटिल प्रक्रिया है जो यौन परिपक्व व्यक्ति के टेस्ट में सेमिनिफेरस ट्यूबल के एपिथेलियम में होती है1। A1 शुक्राणुओं के माइटोटिक वंशज पहले भेदभाव-प्रतिबद्ध आबादी का विस्तार करने के लिए पांच बार विभाजित होते हैं, फिर शुक्राणुओं के रूप में मेयोसिस में प्रवेश करते हैं जो अंततः हैप्लॉयड शुक्राणुओं को जन्म देते हैं। शुक्राणुओं में गोल शुक्राणुओं के विभेदन, यानी शुक्राणुओं की आकृति विज्ञान में जटिल परिवर्तन शामिल हैं,जिसमें परमाणु कॉम्पैक्टेशन और शुक्राणु-विशिष्ट संरचनाओं जैसे एक्रोसोम और फ्लैगेलम का निर्माण शामिल है। माउस में शुक्राणुओं की पूरी प्रक्रिया को पूरा करने में 35 दिन लगते हैं2,3.
किसी भी स्थान पर, सेमिनिफेरस एपिथेलियम कीटाणु कोशिकाओं के साथ-साथ जर्मलाइन स्टेम/जनक कोशिकाओं और दैहिक सेर्टोली कोशिकाओंको 1में अंतर करने के पांच साथियों तक होस्ट करता है । रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने से गाढ़ा परतें बनती हैं, जिनकी संरचना उम्मीद के मुताबिक होती है, और विकास के दिए गए कदम पर हैप्लॉयड कोशिकाएं हमेशा कुछ प्रकार के शुक्राणुओं और शुक्राणुओं के साथ संबद्ध होती हैं4,5। इसलिए, ट्यूबल का कोई भी क्रॉस-सेक्शन निरंतर संरचना की रोगाणु कोशिकाओं के साथियों को होस्ट करता है। इन विशिष्ट सेल संघों को अर्धनिफेरस एपिथेलियम के चरणों के रूप में परिभाषित किया गया है। चरण प्रति स्थिर चेक-पॉइंट जैसी राज्यों को प्रस्तुत नहीं करते हैं, लेकिन लगातार विकसित होते हैं क्योंकि रोगाणु कोशिका साथियों का भेदभाव सिंक्रोनी1,2,6में बढ़ता है। चूहों में, 12 चरण (आई-12)2 हैं जिन्हें अर्धनिफेरस ट्यूबल की देशांतर धुरी के साथ एक खंडीय फैशन में व्यवस्थित किया जाता है, और वे एक तार्किक क्रम में एक दूसरे का पालन करते हैं जिससे अर्धनिफेरस एपिथेलियम, या शुक्राणुओं की लहर7,8,9 (चित्रा 1)की लहर बनती है। शुक्राणुओं के पूरा होने से चार चक्र लगते हैं, और किसी भी अर्धनिफेरस ट्यूबल क्रॉस-सेक्शन के भीतर रोगाणु कोशिकाओं को अलग करने की पदानुक्रमित परतें या साथियों को एक-दूसरे के अलावा अस्थायी रूप से एक अर्धनिफेरस चक्र होता है। चक्र की लंबाई प्रजातियों पर निर्भर है और माउस में प्रत्येक चक्र 8.6 दिन10लेता है।
चरणों की पहचान सेलुलर संरचना और हिस्टोलॉजिकल टेस्टिस सेक्शन5 (चित्रा 1 और चित्रा 2)पर सेमिनिफेरस एपिथेलियम के संगठन के आधार पर की जा सकती है। हालांकि, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण श्रमसाध्य, समय लेने वाला है और फिक्सिंग और धुंधला करने की आवश्यकता होती है, और इसलिए, ऊतक जीने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि चक्र के विभिन्न चरणों(चित्रा 2)द्वारा प्रदर्शित विशिष्ट प्रकाश अवशोषण/स्कैटर पैटर्न का लाभ उठाकर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जीवित ऊतक पर भी मंचन किया जा सकता है । प्रकाश को अवशोषित और तितर - बितर करने के लिए प्रत्येक चरण की क्षमता देर से पोस्ट-मेयोटिक शुक्राणुओं के क्रोमेटिन संघनन के स्तर के सापेक्ष होती है जो किसी भी मंच मेजबान और बंडलों में इन कोशिकाओं कीपैकिंग 7,11। शुक्राणुभेदी विभेदन, यानीशुक्राणुओं की रोकथाम को आगे 16 विकासात्मक चरणों में विभाजित किया गया है, जिसमें गोल शुक्राणुओं के 8 चरण (चरण 1-8) और 8 चरण शुक्राणु (चरण 9-16) भेदभाव(चित्र 1)शामिल हैं। चरण 9-11 लम्बी शुक्राणु (चरण IX-XI) केवल क्रोमेटिन संघनन का निम्न स्तर प्रदर्शित करता है जिसके परिणामस्वरूप कम मात्रा में प्रकाश अवशोषित होता है। क्रोमेटिन संघनन चरण 11 शुक्राणुओं (चरण XI) में शुरू होता है, और चरण 15-16 लम्बी शुक्राणुओं (चरण IV-VIII) में पूरी तरह से गाढ़ा क्रोमेटिन होते हैं, और इसलिए अधिकतम प्रकाश अवशोषण(चित्रा 3)प्रदर्शित करते हैं। क्रोमेटिन को शुक्राणु सिर में कसकर पैक करने के लिए गाढ़ा होना चाहिए। प्रकाश अवशोषण पैटर्न में योगदान देने वाले अतिरिक्त कारक एपिथेलियम (बेसल बनाम एपिकल) के भीतर शुक्राणुओं को बढ़ाने और लम्बी शुक्राणुओं (द्वितीय-वी चरणों में स्पष्ट)11 (चित्र 3)के बंडलिंग के स्थान हैं। बंडलों को ट्यूबल के बीच में धब्बे के रूप में देखा जाता है और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे किनारों पर धारियों के रूप में और क्रोमेटिन को अधिक गाढ़ा किया जाता है, जोजगह/धारी 11गहरा होता है ।
यह लेख अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाले अर्धनिफेरस ट्यूबुल खंडों के अलगाव के लिए ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि के उपयोग का वर्णन करता है। एक बार अलग होने के बाद, मंचन ट्यूबल सेगमेंट विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के अधीन हो सकते हैं, जिनमें जैव रासायनिक आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण12,13,14,15,प्रवाह साइटोमेट्री16, पूर्व वीवो ट्यूबल संस्कृति 17 और इम्यूनोदाता18 शामिल हैं। यहां हम लाइव सेल रूपात्मक विश्लेषण और बाद में इम्यूनोस्टेटिंग के साथ-साथ ट्यूबल सेगमेंट के पूरे माउंट इम्यूनोस्टेटिंग के लिए मंचन ट्यूबल सेगमेंट के कुचल मोनोलेयर तैयार करने के लिए विस्तृत डाउनस्ट्रीम प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं। अंक 4में वर्णित संक्षेप में कार्यप्रवाह ।
ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि चरणों की सिंक्रोनाइज्ड सेलुलर संरचना के लिए भेदभाव के विशिष्ट चरणों में रोगाणु कोशिकाओं की सटीक पहचान और अलगाव की अनुमति देती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह जीवित ऊतकों पर शुक्राणुओं के दौरान चरण पर निर्भर घटनाओं के अध्ययन को भी सक्षम बनाता है। शुक्राणुओं के लिए स्कैलेबल इन विट्रो मॉडल की कमी को देखते हुए, इस विधि में चरण-विशिष्ट ट्यूबल सेगमेंट पूर्व वीवो12, 17पर लक्षित अल्पकालिक विकासात्मक और विषाक्त अध्ययनों की अनुमति देने का एक अनूठा लाभ भी है। जब हम माउस के लिए यहां विधि का वर्णन करते हैं, तो चूहा4,7,15,19,20जैसे अर्धनिफेरस एपिथेलियल चरणों की देशांतर और खंडीय व्यवस्था के साथ किसी भी स्तनधारी प्रजाति पर एक ही प्रक्रिया लागू की जा सकती है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

शुक्राणुएटोजेनेसिस एक अनूठी भेदभाव प्रक्रिया है जो अंततः शरीर के सबसे अलग कोशिका प्रकारों में से एक शुक्राणु को जन्म देती है। रोगाणु कोशिकाओं का भेदभाव दैहिक सेर्टोली कोशिकाओं के साइटोप्लाज्मिक जेब में होता है जो एक साथ 4 से 5 पीढ़ियों की रोगाणु कोशिकाओं की मेजबानी करता है और उनके विकास को समन्वित और सिंक्रोनाइज करता है। इसलिए, एक क्रॉस-सेक्शन के भीतर रोगाणु कोशिका प्रकारों की संरचना स्थिर है, और इन सेल संघों को अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के चरणों (I-XII) के रूप में भी जाना जाता है। महत्वपूर्ण बात, चरणों को उनके अंतर प्रकाश अवशोषण/बिखराव विशेषताओं के आधार पर अक्षुण्ण अर्धनिषदीय ट्यूबलों से भी पहचाना जा सकता है, और यह तथ्य कि चरण संख्यात्मक क्रम में ट्यूबुल के साथ एक दूसरे का अनुसरण करते हैं । यह लेख माउस अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाले अर्धनिफेरस ट्यूबल सेगमेंट के अलगाव के लिए ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन विधि का वर्णन करता है। सेमिनिफेरस ट्यूबल के प्रकाश अवशोषण पैटर्न का पहले विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण किया जाता है, और फिर विशिष्ट चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाले ट्यूबल सेगमेंट को काट दिया जाता है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है। यहां हम स्टेज-स्पेसिफिक स्क्वैश तैयारियों के लिए और अक्षुण्ण ट्यूबल सेगमेंट के लिए इम्यूनोस्टेपिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह विधि एक शोधकर्ता को शुक्राणुओं के विशिष्ट चरणों में होने वाली जैविक घटनाओं पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देती है, इस प्रकार शुक्राणुओं और अंतर्निहित आणविक तंत्र के विकासात्मक, विषविज्ञानी और साइटोलॉजिकल अध्ययन के लिए एक अद्वितीय उपकरण प्रदान करती है।

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस सेमीनिफेरस ट्यूबल के खंडों के ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड माइक्रोडिसेक्शन का वर्णन करता है जो अर्धनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों और उसमें सेल प्रकारों का प्रतिनिधित्व करता है, और बाद में स्क्वैश तैयारी और बरकरार ट्यूबल सेगमेंट का इम्यूनोसटेनिंग करता है।

डाउनस्ट्रीम इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण के लिए माउस सेमीनिफेरस एपिथेलियल चक्र के विशिष्ट चरणों का ट्रांसिल्यूमिनेशन-असिस्टेड विच्छेदन

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

माउस के लिए एंडोमेट्रियल उपकला और stromal कोशिकाओं का अलगाव<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

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Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...