Name: transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Academia da Finlândia [315948, 314387 a N.K.]; Fundação Sigrid Jusélius [para N.K., J.T.]; Fundação Emil Aaltonen [para J.-A.M., T.L.]; Programa de Doutorado em Medicina Molecular de Turku [S.C.-M., O.O.].

A manutenção de ratos de laboratório e todos os experimentos animais foi feita de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes para o cuidado e uso de animais de laboratório na Universidade de Turku.
1. Preparação de túbulos seminiferos para microdisseção
<ol><li>Sacrifique um camundongo adulto (≥8 semanas de idade, teste 80-120 mgs dependendo da cepa e idade) via asfixia de CO2 seguida de deslocamento cervical. NOTA: O rato deve ser sexualmente maduro, e de preferência com pelo menos 8 semanas de idade. O padrão de transilluminação de camundongos juvenis difere do adulto porque a onda do epitélio seminifero ainda não foi totalmente estabelecida, e o tempo da primeira onda de espermatogênese é distinto21,22. A falta de espermatozoides alongados em camundongos machos de 4 semanas de idade impede seu uso para microdisseção assistida por transilluminação. Todas as cepas de camundongos que têm espermatogênese normal podem ser usadas.</li>
	<li>Pulverize o abdômen ventral com 70% de etanol. Abra a cavidade abdominopela usando uma tesoura estéril, fazendo uma abertura em forma de V.</li>
	<li>Puxando a almofada de gordura epidídil com fórceps estéreis, localize os testículos, disseque-os usando uma tesoura e coloque-os em uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo PBS. NOTA: Para manter a esterilidade, certifique-se de que todos os labware e ferramentas cirúrgicas estejam estéreis.</li>
	<li>Usando tesouras finas decapsulam os testículos cortando uma fenda na tunica albuginea, a folha fibrosa grossa encapsulando o testículo. Em seguida, rasgar a tunica aberta usando um par de fórceps. Force os túbulos para fora pressionando com fórceps e descarte a tunica. NOTA: Ao descartar a tunica, pode ser benéfico para algumas aplicações a jusante que arteria testicularis seja removida juntamente com a tunica. Evite danificar os túbulos seminiferos.</li>
	<li>Mova os túbulos seminiferos para uma nova placa de Petri e despeje PBS estéril suficiente para cobrir o fundo da placa de Petri. Em seguida, puxe suavemente os túbulos, mas evite danificar os túbulos. NOTA: Muito estresse mecânico afetará o padrão de transilluminação e afetará a viabilidade do tecido e sua arquitetura celular. Os túbulos também podem ser processados para imunostainings de montagem inteira a partir deste ponto sem encenação (3B). Às vezes é suficiente definir o estágio retrospectivamente, incluindo anticorpos contra proteínas expressas na diferenciação de espermatogógonas, como SALL4, c-KIT e DNMT3A18,23. A densidade da espermatogonia é um indicador de estágio relativamente confiável(Figura 2).</li>
</ol>2. Microdisseção assistida por transilluminação
<ol><li>Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecção firmemente, gravando-a no palco. NOTA: É importante gravar bem a placa de Petri para evitar seu movimento que poderia causar a mistura dos segmentos de túbulos seminiferos coletados.</li>
	<li>Para revelar o padrão de absorção de luz dos túbulos seminiferos em foco, certifique-se de que a amostra esteja iluminada de baixo e a luz passe pela amostra,ou seja, é transilluminada. NOTA: A quantidade de luz absorvida/dispersa é relativa ao nível de condensação de cromatina em espermatóides alongados e seu agrupamento dentro do túbulo seminifero: quanto mais condensado, mais luz é absorvida, ou seja,mais escura parece mais escura.</li>
	<li>Conheça o padrão de absorção de luz de diferentes estágios, conforme descrito na Figura 2, Figura 5A e Figura S1, movendo cuidadosamente feixes de túbulos usando fórceps finos. NOTA: Os estágios sempre seguem-se em uma ordem lógica, formando a onda de epitélio seminifero. No entanto, é importante saber que a direção da onda espermatogênica ocasionalmente se inverte e depois volta novamente (também conhecida como modulações4,9 ), àsvezescomplicando o procedimento. Além disso, o comprimento de cada etapa, em termos de quantos mm de túbulo, varia consideravelmente.</li>
	<li>Levante cuidadosamente o túbulo de interesse usando fórceps com ponta fisada e, em seguida, corte um segmento de comprimento apropriado usando uma tesoura de microdisseção (ver Vídeo Suplementar 1). Um gancho na ponta dos fórceps facilita o levantamento e a segurando um túbulo e ajuda a evitar espremê-lo. NOTA: O comprimento dos segmentos a serem cortados depende de aplicações a jusante. Para a coleta de pedaços de túbulos agrupados de um estágio específico para análise de proteína ou RNA12,13 (II-V, VII-VIII e IX-XI, Figura 5B) o comprimento é tipicamente de 2-5 mm. Quando a extração padrão de fenol-clorofórmio é usada, cerca de 200 ng de RNA podem ser derivados de 1 mm de túbulo. Para a coloração total dos segmentos de túbulos encenados, o comprimento dos segmentos deve ser de >5 mm. Para preparações de abóbora, o comprimento dos segmentos não deve exceder de 1 a 2 mm porque as células no meio do segmento podem não sair se for muito longo. Use uma balança mm sob a placa de Petri para uma medição precisa do comprimento do túbulo.</li>
</ol>3. Imunostaining de diferentes preparações
<ol><li>Preparação de abóbora: verificação de etapa e imunostaining NOTA: As peças de túbulos específicas do estágio podem ser esmagadas em um slide de microscópio com um vidro de cobertura para realizar análise morfológica de células vivas por microscopia de contraste de fase e imunostaining subsequente. Recomenda-se que um iniciante use esta abordagem para verificar as etapas ao se familiarizar com o método de microdissecção assistido pela transilluminação.<ol>
<li>Colete o segmento em um volume de 10 μL usando uma pipeta e mova-o para um slide de microscópio.</li>
		<li>Esmague o túbulo colocando um copo de cobertura (20 mm x 20 mm) cuidadosamente no túbulo. Como resultado, as células fluirão para fora do túbulo e formarão uma monocamada de célula viva. Coloque um papel filtro na borda do vidro de cobertura para facilitar a disseminação das células. Evite esmagar as células demais para mantê-las vivas.</li>
		<li>Monitore célula se espalhando sob um microscópio. Use um microscópio de contraste de fase em 40x objetivo para verificar o reconhecimento de estágio examinando os tipos de células presentes (Figura 2, Figura S2).</li>
		<li>Uma vez que as células tenham se espalhado para formar uma monocamada redonda de ambas as extremidades do túbulo, mergulhe o slide em um recipiente contendo nitrogênio líquido enquanto segura-o com fórceps. Mantenha-o submerso por 10 s. Alternativamente, coloque o slide em uma placa de gelo seca para congelar.</li>
		<li>Remova o vidro da tampa, desligando-o usando um bisturi.</li>
		<li>Sem demora, proceda com a fixação e coloque rapidamente o deslizamento em um recipiente com 90% de etanol por 2-5 min. NOTA: Certifique-se de que a preparação da abóbora não descongele antes de colocá-la em 90% de etanol. Outros fixativos também podem ser usados, como acetona, por 10 minutos.</li>
		<li>A seco ao ar e armazena à temperatura ambiente (RT) (até alguns dias) ou a -80 °C (longo prazo).</li>
		<li>Para imunostaining, pós-fixar as amostras em 4% de paraformaldeído (PFA) por 10 min na RT.</li>
		<li>Enxágüe em PBS e permeabilize com Triton X-100 de 0,1% em PBS por 5 min.</li>
		<li>Enxágüe em PBS e desenhe um anel de graxa em torno de cada amostra de abóbora.</li>
		<li>Adicione 50-100 μL de 10% BSA (albumina de soro bovino) em 0,1% Tween em PBS (PBST) dentro do anel de graxa e bloco amostras por 30 minutos na RT.</li>
		<li>Remova a solução BSA e incuba com um anticorpo primário diluído em 10% de BSA em PBST por 1 h no RT.</li>
		<li>Lave 3x por 5 min com PBST.</li>
		<li>Incubar com um anticorpo secundário diluído em 10% de BSA em PBST. NOTA: Para manchar os acroosos, as amostras podem ser incubadas com anticorpo de aglutina de amendoim rotulado por Rhodamina (PNA, 1:1000) em 10% BSA em PBST por 1 h na RT(Figura S3) em vez de anticorpos primários e secundários específicos.</li>
		<li>Lave 3x por 5 min cada com PBST, enxágue com PBS e monte com um montador contendo DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunostaining integral de túbulos seminiferos NOTA: O protocolo abaixo descreve a coloração de montagem total para os segmentos de túbulos encenados (a partir da etapa 2.4). Se um pesquisador quiser realizar coloração de montagem integral sem encenação (a partir da etapa 1.5), preste atenção às notas em 3.2.1 e 3.2.7.<ol>
<li>Usando uma pipeta, transfira os segmentos de túbulos (da etapa 2.4) em PBS gelado para um tubo cônico de 15 mL e permita-lhes sedimentar no gelo. NOTA: Se usar túbulos não encenados a partir de 1,5., separe os túbulos em uma placa de Petri, pipetting para cima e para trás em uma placa inclinada várias vezes. Use uma pipeta de 1 mL com uma ponta de corte. Esta etapa visa abrir a estrutura do tecido. No entanto, evite muita tubulação, pois pode danificar os túbulos. A sedimentação dos túbulos levará algumas dezenas de segundos. Pequenos fragmentos de túbulos, células intersticiais e detritos celulares permanecem no supernante.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o supernatante (SN) por pipetação ou com um aspirador. Adicione 10 mL de PBS gelado e misture por inversão.</li>
		<li>Deixe sedimentar e, em seguida, remova o SN como antes.</li>
		<li>Adicione 5 mL de 4% PFA e fixe por 5h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) a +4 °C. NOTA: O tempo de fixação depende das proteínas de interesse e de sua localização subcelular. Para proteínas nucleares e citoplasmáticas, uma fixação de 2 h é tipicamente suficiente, no entanto, marcadores de membrana, como GFRα1 (receptor da família GDNF alfa 1; Figura 6A,B), beneficiar de uma fixação mais longa, até 6 h.</li>
		<li>Deixe sedimentar, remova o SN (PFA) como antes e enxágue brevemente adicionando 10 mL de PBS e invertendo o tubo.</li>
		<li>Deixe sedimentar, remova o SN como antes e repita a etapa de lavagem do PBS três vezes por pelo menos 10 minutos cada em uma mesa rotativa a +4 °C e continue com a coloração ou armazene a +4 °C. NOTA: Se as condições de trabalho forem estéreis e limpas, as amostras podem ser armazenadas e usadas por pelo menos algumas semanas. Alternativamente, adicione azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (c/v) de uma solução de estoque de 2% para ajudar a preservar os túbulos antes de armazenar a +4 °C.</li>
		<li>Usando uma pipeta de 1 mL, mova 10-20 segmentos de túbulos fixos para um tubo de fundo redondo de 2 mL. Deixe sedimentar e remova o SN. NOTA: Se trabalhar com túbulos longos que não foram encenados, despeje os túbulos em uma placa de Petri e usando tesouras de microdisseção e segmentos de corte de fórceps de cerca de 5 a 20 mm. Segmentos muito longos se emaranharão durante o procedimento de coloração, enquanto segmentos muito curtos são facilmente perdidos.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 2% BSA + 10% FBS (soro bovino fetal) em 0,3% Triton X-100 em PBS (PBSX). Bloqueie por pelo menos 1h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT.</li>
		<li>Enxágüe com 1 mL de PBSX, remova o SN por pipetação e adicione 250 μL de anticorpo primário diluído em 1% de BSA em PBSX (1:100-1:2000 diluição). Incubar por 2 h no RT ou durante a noite a +4 °C em uma mesa rotativa (20-30 rpm).</li>
		<li>Remova a solução de anticorpos por pipetação e enxágue os túbulos com 1 mL de PBSX como acima. Lave três vezes por 1h em PBSX em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT. NOTA: Após esta primeira lavagem, a amostra pode ser deixada durante a noite a +4 °C, se necessário.</li>
		<li>Remova o SN e adicione 250 μL de anticorpo secundário diluído em 1% de BSA em PBSX (tipicamente diluição de 1:500 de um anticorpo rotulado fluorescente). Cubra em papel alumínio e incuba em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT por 1h.</li>
		<li>Repita 3.2.10.</li>
		<li>Por fim, remova o SN e despeje os túbulos em um slide de microscópio. Separe suavemente e organize os túbulos em tiras lineares usando pontas de carregamento de gel. Escorra o excesso de tampão e adicione o meio de montagem e uma mancha de cobertura. NOTA: Evite secar os túbulos enquanto os organiza. A contra-coloração dos núcleos com DAPI não é necessária na maioria dos casos. Sele a borda da tampa com esmalte para evitar a secagem e a deterioração da amostra. Os slides podem ser armazenados por 1-2 semanas a +4 °C antes da imagem.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método de microdissecção assistido pela transilluminação que descrevemos acima permite uma abordagem orientada para o estágio para o estudo da espermatogênese. A espermatogênese é um processo altamente sincronizado, e todas as etapas-chave durante a diferenciação espermatogênica são reguladas e executadas de forma dependente de etapas, como comprometimento de diferenciação (nas etapas VII-VIII), início da meiose (VII-VIII), divisões meioticas (XII), início de alongamento esperscopado (VIII) e espermicidade (VIII)1,26,27. A análise orientada ao palco fornece uma ferramenta poderosa para estudar esses eventos particulares que se restringem a etapas específicas da espermatogênese e, portanto, encontradas apenas em estágios definidos do ciclo epitelial seminiferous. Dominar o método requer alguma prática e o uso de um microscópio de dissecção de boa qualidade e condições de iluminação adequadas são fundamentais para o sucesso. Implementar este método como parte do kit de ferramentas cotidiana tem a capacidade de melhorar muito o impacto e a relevância biológica da pesquisa sobre funções reprodutivas masculinas, permitindo uma dissecção mais precisa de eventos moleculares durante a espermatogênese.
Todas as cepas de camundongos WT que estudamos exibem um padrão de transilaminação semelhante e exibem associações celulares conservadas em estágios do ciclo epitelial seminiferous. Na condição de que a diferenciação espersiogênica das células germinativas não seja grosseiramente diferente dos camundongos WT, o mesmo também se aplica a todos os modelos de camundongos eliminados que estudamos. Além disso, pode ser aplicado a outras espécies que exibem arranjo segmentar longitudinal de etapas do ciclo epitelial seminifero7. No entanto, espécies com estágios não segmentais (como o humano) não podem ser utilizadas. Dado o papel essencial da condensação da cromatina na alongamento dos espermatóides na definição do padrão de transilluminação, é evidente que qualquer má regulação desse processo inevitavelmente implicará na implementação deste método. Em camundongos juvenis e adultos jovens (5-6 semanas) o padrão de transilluminação ainda não foi totalmente estabelecido e, portanto, apenas camundongos com mais de 8 semanas devem ser usados. Também é importante ter em mente que apertar e puxar os túbulos inevitavelmente implicará no padrão de transilluminação porque distorce a arquitetura celular dentro do epitélio seminiferous.
Os segmentos isolados de túbulos seminiferos também podem ser cultivados permitindo a observação ex vivo e a manipulação de processos acoplados à espermatogênese, incluindo a meiose. Para garantir a viabilidade do tecido e para evitar a degradação do RNA e da proteína, as amostras devem ser coletadas e processadas no máximo 2 horas após o sacrifício do camundongo. Para a cultura ex vivo de túbulos seminiferos, o tempo do sacrifício ao início da cultura não deve exceder 1 hora. A integridade dos fragmentos de túbulos pode normalmente ser mantida até 72 horas in vitro se colhida corretamente.
O estágio do ciclo epitelial seminifero pode ser verificado e ainda mais precisamente definido utilizando microcopia de contraste de fase das preparações de abóbora16. A microscopia é realizada em células vivas, o que fornece uma dimensão adicional na análise e permite a observação de organela ou movimentos celulares em estágios específicos de espermatogênese28,29,30. A microscopia de contraste de fase fornece um estágio exato para a imunossuagem subsequente, que permite uma análise muito detalhada da expressão proteica e da dinâmica de localização durante a espermatogênese, incluindo alterações específicas do estágio.
Enquanto as células são liberadas do contexto epitelial em preparações de abóbora, imunossuagens de montagem total de segmentos de túbulos permitem o estudo de células espermatogênicas em seu ambiente fisiológico. Portanto, os preparativos de montagem inteira podem fornecer uma melhor visualização da arquitetura do túbulo seminiferante e seus contatos intercelulares do que imunostaining em seções transversais. É importante ressaltar que a encenação assistida pela transilação dos segmentos de túbulos antes da imunossuagem torna a abordagem ainda mais poderosa, incluindo informações sobre o estágio específico de um determinado segmento. A coloração de montagem total é uma ferramenta particularmente útil para o estudo de células na periferia de túbulos seminiferos, como células myoid peritubulares, macrófagos peritubulares e espermatogonia, mas também pode abrir novas percepções sobre pesquisas sobre células germinativas médias e pós-meióticas.

A diferenciação das células germinativas masculinas da espermatogonia diploide para a espermatozoide haploide madura, ou seja,a espermatogênese, é um processo complexo que ocorre no epitélio dos túbulos seminiferos nos testículos de um indivíduo sexualmente maduro1. Descendentes mitóticos da espermatogonia A1 primeiro dividem-se cinco vezes para expandir a população comprometida com a diferenciação, em seguida, entram em meiose como espermatocitotas que, em última análise, dão origem a espermatoides haploides. A diferenciação de espermatozoides redondos em espermatozoides, ou seja,espermagênese, envolve mudanças complexas na morfologia celular, incluindo compactação nuclear e construção de estruturas específicas de esperma, como o acrossomo e o flagelo. No camundongo, todo o processo de espermatogênese leva 35 dias para completar2,3.
Em qualquer local, o epitélio seminifero hospeda até cinco coortes de células germinativas diferenciadoras, além das células germinais/progenitoras e as células somáticas sertoli1. As células germinativas diferenciadoras formam camadas concêntricas da composição da qual é previsível, e as células haploides em um dado passo de desenvolvimento sempre associam-se a certos tipos de espermatotocrócitos e espermatogonia4,5. Portanto, qualquer seção transversal de um túbulo hospeda coortes de células germinativas de uma composição constante. Essas associações celulares específicas são definidas como os estágios do epitélio seminifero. Os estágios em si não apresentam estados estagnados como pontos de verificação, mas desenvolvem-se continuamente à medida que a diferenciação das coortes de células germinativas progride em sincronia1,2,6. Em camundongos, existem 12 estágios (I-XII)2 que são dispostos de forma segmental ao longo do eixo longitudinal do túbulo seminifero, e seguem-se em uma ordem lógica formando assim a onda de epitélio seminifero, ou onda espermatogênica7,8,9 (Figura 1). A conclusão da espermatogênese leva quatro ciclos, e camadas hierárquicas ou coortes de células germinativas diferenciadas dentro de qualquer seção transversal de túbulo seminiferou são temporalmente um ciclo seminiferous separados um do outro. O comprimento do ciclo é dependente de espécies e no camundongo cada ciclo leva 8,6 dias10.
Os estágios podem ser identificados com base na composição celular e organização do epitélio seminifero nas seções de testítio histológico5 (Figura 1 e Figura 2). No entanto, a análise histológica é trabalhosa, demorada e requer fixação e coloração, e não pode, portanto, ser aplicada ao tecido vivo. É importante ressaltar que o estadiamento também pode ser realizado em tecido vivo sob um microscópio de dissecção, aproveitando padrões distintos de absorção/dispersão de luz exibidos por diferentes estágios do ciclo(Figura 2). A capacidade de cada estágio de absorver e dispersar a luz é relativa ao nível de condensação de cromatina de espermatâmicos pós-meioticos tardios que qualquer estágio hospeda e a embalagem dessas células em feixes7,11. A diferenciação de espermatozoides, ou seja,a espermagogênese, é ainda dividida em 16 etapas de desenvolvimento, incluindo 8 passos de espermatização redonda (passo 1-8) e 8 passos de alongamento da espermicidade (passos 9-16) de diferenciação(Figura 1). Os espermatozoides alongados do passo 9-11 (estágio IX-XI) exibem apenas um baixo nível de condensação de cromatina, resultando em baixa quantidade de luz sendo absorvida. A condensação da cromatina começa na etapa 11 de espermatozoides (estágio XI), e os espermatóides alongados do passo 15-16 (estágio IV-VIII) contêm cromatina totalmente condensada e, portanto, exibem absorção máxima de luz(Figura 3). A cromatina precisa ser condensada para ser bem embalada na cabeça do esperma. Fatores adicionais que contribuem para o padrão de absorção de luz são a localização de espermatozoides alongados dentro do epitélio (basal vs. apical) e agrupamento de espermatóides alongados (pronunciados nos estágios II-V)11 (Figura 3). Os feixes são vistos como pontos no meio dos túbulos e como listras nas bordas sob um microscópio de dissecção e quanto mais condensado a cromatina, mais escura a mancha/listra11.
Este artigo descreve o uso do método de microdisseção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero. Uma vez isolados, os segmentos de túbulos encenados podem estar sujeitos a diversas análises a jusante, incluindo análises bioquímicas de RNA e proteínas12,13,14,15,citometria de fluxo16,cultura do túbulo ex vivo 17 e imunostaining18. Aqui também fornecemos protocolos detalhados a jusante para preparar monocamadas esmagadas de segmentos de túbulos encenados para análise morfológica de células vivas e imunostainings subsequentes, bem como imunostainings de montagem inteira de segmentos de túbulos. O fluxo de trabalho em poucas palavras descrita na Figura 4.
O método de microdisseção assistido pela transilluminação permite identificação e isolamento precisos de células germinativas em etapas específicas de diferenciação graças à composição celular sincronizada dos estágios. É importante ressaltar que também permite o estudo de eventos dependentes de estágio durante a espermatogênese no tecido vivo. Dada a falta de modelos in vitro escaláveis para espermatogênese, este método também tem uma vantagem única de permitir estudos de desenvolvimento e toxicológicos direcionados a curto prazo em segmentos de túbulos específicos do palco ex vivo12,17. Embora descrevamos o método aqui para o camundongo, o mesmo procedimento pode ser aplicado a qualquer espécie de mamífero com arranjo longitudinal e segmental de estágios epiteliais seminiferosos, como o rato4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

A espermatogênese é um processo de diferenciação único que, em última análise, dá origem a um dos tipos celulares mais distintos do corpo, o espermatozoide. A diferenciação das células germinativas ocorre nos bolsões citoplasmáticos de células somáticas de Sertoli que hospedam de 4 a 5 gerações de células germinativas simultaneamente e coordenam e sincronizam seu desenvolvimento. Portanto, a composição dos tipos de células germinativas dentro de uma seção transversal é constante, e essas associações celulares também são conhecidas como estágios (I-XII) do ciclo epitelial seminiferous. É importante ressaltar que os estágios também podem ser identificados a partir de túbulos seminiferos intactos com base em suas características diferenciais de absorção/dispersão de luz reveladas pela transilação, e o fato de que os estágios se seguem ao longo do túbulo em uma ordem numérica. Este artigo descreve um método de microdissecção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero do rato. O padrão de absorção de luz de túbulos seminiferos é primeiro inspecionado sob um microscópio de dissecção, e, em seguida, segmentos de túbulos representando estágios específicos são cortados e usados para aplicações a jusante. Aqui descrevemos protocolos de imunossuagem para preparações de abóbora específicas para o estágio e para segmentos de túbulos intactos. Este método permite que um pesquisador se concentre em eventos biológicos que ocorrem em fases específicas da espermatogênese, fornecendo assim uma ferramenta única para estudos de desenvolvimento, toxicológicos e citológicos de espermatogênese e mecanismos moleculares subjacentes.

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

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