Name: transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами От Академии Финляндии (315948, 314387 до Н.К.); Фонд Сигрида Джуслиуса (В.К., Дж.Т.); Фонд Эмиля Аалтонена (J.-A.M., T.L.); Докторская программа Турку молекулярной медицины (S.C.-M., O.O.).

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Метод микродиссекции с помощью трансиллюминации, описанный выше, позволяет использовать сценический подход к изучению сперматогенеза. Сперматогенез является высоко синхронизированным процессом, и все ключевые шаги во время сперматогенной дифференциации регулируются и выполняются в стадии зависимой манеры, такие как дифференциация обязательств (на этапах VII-VIII), начало мейоза (VII-VIII), мейотических деления (XII), наступление сперматозоидов удлинение (VIII) и сперматозоидов (VIII)1,26,27. Сценический анализ является мощным инструментом для изучения этих конкретных событий, которые ограничиваются конкретными шагами сперматогенеза и поэтому находятся только на определенных стадиях семенного эпителиального цикла. Освоение метода занимает некоторую практику и использование хорошего качества рассечения микроскопа и надлежащего освещения условия являются ключом к успеху. Реализация этого метода в рамках повседневного инструментария имеет возможность значительно улучшить воздействие и биологическую значимость исследований мужских репродуктивных функций, позволяя более точное вскрытие молекулярных событий во время сперматогенеза.
Все штаммы WT мыши, которые мы изучали, отображают аналогичный рисунок трансиллюминации и демонстрируют сохраненные клеточные ассоциации на стадиях семенного эпителиального цикла. При условии, что спермиогенная дифференциация зародышевых клеток не сильно отличается от WT мышей, то же самое относится и ко всем нокаут-модели мыши, которые мы изучали. Кроме того, он может быть применен к другим видам, которые демонстрируют продольное сегментальное расположение этапов семенного эпителиального цикла7. Однако виды с не сегментатальными стадиями (например, человеческие) не могут быть использованы. Учитывая существенную роль конденсата хроматина в удлинению сперматозоидов в определении модели трансиллюминации, ясно, что любое неправильное регулирование этого процесса неизбежно посягает на реализацию этого метода. У несовершеннолетних мышей и молодых людей (5-6 недель) модель трансиллюминации еще не полностью установлена, и, следовательно, следует использовать только мышей старше 8 недель. Важно также иметь в виду, что сжатие и потянув трубочки неизбежно посягает на трансилюминации картины, поскольку она искажает клеточной архитектуры в семенной эпителия.
Изолированные семенные сегменты трубочки также могут быть культурно, что позволяет ex vivo наблюдения и манипуляции сперматозоидов связанных процессов, в том числе мейоз. Для обеспечения жизнеспособности тканей и предотвращения деградации РНК и белка, образцы должны быть собраны и обработаны не более чем через 2 часа после жертвоприношения мыши. Для культуры ex vivo семенных трубоубийств время от жертвоприношения до наступления культуры не должно превышать 1 часа. Целостность фрагментов труб, как правило, может поддерживаться до 72 часов в пробирке, если собраны должным образом.
Стадию семенного эпителиального цикла можно проверить и еще точнее определить с помощью фазо-контрастной микроскопии препаратов сквоша16. Микроскопия проводится на живых клетках, что обеспечивает дополнительное измерение в анализе и позволяет наблюдение органеллы или клеточных движений на определенных стадияхсперматогенеза 28,29,30. Фазово-контрастная микроскопия обеспечивает точную постановку для последующего иммуностимунизации, что позволяет очень детально анализировать экспрессию белка и динамику локализации при сперматогенезе, включая сценические изменения.
В то время как клетки высвобождаются из эпителиального контекста в препаратах сквоша, цельно-монтажные иммуностимулы трубчатых сегментов позволяют изучать сперматогенные клетки в их физиологической среде. Таким образом, цельно-монтажные препараты могут обеспечить лучшую визуализацию семенной трубчатой архитектуры и ее межклеточных контактов, чем иммуностимулирование на поперечных сечениях. Важно отметить, что трансиллюминация при содействии постановки сегментов трубоубий до иммуностения делает подход еще более мощным, включив информацию о конкретном этапе данного сегмента. Цельно-монтажное окрашивание является особенно полезным инструментом для изучения клеток на периферии семенных трубоубийств, таких как перитубубулярные миоидные клетки, перитубулярные макрофаги и сперматозоиды, но может также открыть новые идеи в исследованиях по мейотических и постмейотических зародышевых клеток.

Дифференциация мужских зародышевых клеток от диплоидной сперматогонии до зрелых гаплоидных сперматозоидов, т.е.сперматогенеза, является сложным процессом, который происходит в эпителии семенных трубочных трубок в яичках сексуально зрелогочеловека 1. Митотические потомки A1 сперматозоидов сначала разделить пять раз, чтобы расширить дифференциацию совершенных населения, а затем ввести мейоз, как сперматозоиды, которые в конечном итоге привести к гаплоидных сперматозоидов. Дифференциация круглых сперматозоидов на сперматозоиды, т.е.спермиогенез, включает в себя сложные изменения в клеточной морфологии, включая ядерную уплотнение и строительство сперматозоидов конкретных структур, таких как акросома и флагеллум. В мыши, весь процесс сперматогенеза занимает 35 дней, чтобы завершить2,3.
В любом месте, семенной эпителий хостов до пяти когорт дифференциации зародышевых клеток плюс зародышевой стволовых / прародителя клеток и соматических клетокСертоли 1. Дифференциация зародышевых клеток образуют концентрические слои, состав которых предсказуем, а гаплоидные клетки на данном этапе развития всегда ассоциируются с определенными типами сперматозоидов и сперматозоидов4,5. Поэтому в любом поперечном сечении трубоубийки находятся когорты зародышевых клеток постоянного состава. Эти специфические клеточные ассоциации определяются как стадии семенного эпителия. Этапы как таковые не представляют застойных контрольных точей, как государства, но постоянно развиваться, как дифференциация когорт зародышевыхклеток прогрессирует в синхронности 1,2,6. У мышей, Есть 12 этапов (I-XII)2, которые расположены в сегментной моды вдоль продольной оси семенной трубочки, и они следуют друг за другом в логическом порядке, таким образом образуя волну семенной эпителия, или сперматогеннойволны 7,8,9 (Рисунок 1). Завершение сперматогенеза занимает четыре цикла, а иерархические слои или когорты дифференциации зародышевых клеток в пределах любого семенного поперечного сечения трубочки являются временно одним семенным циклом отдельно друг от друга. Длина цикла зависит от вида и в мыши каждый цикл занимает 8,6 дней10.
Этапы можно определить на основе клеточного состава и организации семенного эпителия на гистологических секцияхяичка 5 (рисунок 1 и рисунок 2). Тем не менее, гистологический анализ является трудоемким, трудоемким и требует фиксации и окрашивания, и поэтому не может быть применен к живой ткани. Важно отметить, что постановка также может быть выполнена на живой ткани под микроскопом вскрытия, воспользовавшись различными схемами поглощения света/рассеяния, выставленными на различных стадиях цикла(рисунок 2). Способность каждого этапа поглощать и рассеивать свет относительно уровня хроматина конденсации поздних пост-мейотических сперматозоидов, что любой данной стадии хостов и упаковки этих клеток впучки 7,11. Дифференциация сперматозоидов, т.е.спермиогенез, далее делится на 16 этапов развития, включая 8 ступеней круглого сперматозоида (шаг 1-8) и 8 ступеней удлиненной сперматозоидов (шаги 9-16) дифференциации(рисунок 1). Шаг 9-11 удлинение сперматозоидов (этап IX-XI) отображать только низкий уровень конденсата хроматина в результате чего небольшое количество света поглощается. Конденсат хроматина начинается в шаге 11 сперматозоидов (этап XI), и шаг 15-16 удлиняющиеся сперматозоиды (этап IV-VIII) содержат полностью сгущенный хроматин, и поэтому обладают максимальным поглощением света(рисунок 3). Хроматин должен быть конденсирован для того, чтобы быть плотно упакованы в голову спермы. Дополнительными факторами, способствующими улучшению поглощения света, являются расположение удлиненных сперматозоидов в эпителии (базальный против апикал) и комплектация удлиненных сперматозоидов (произносится поэтапно II-V)11 (рисунок 3). Комплекты рассматриваются как пятна в середине трубоубивания и как полосы по краям под микроскопом вскрытия и более сжатый хроматин, тем темнее пятно / полоса11.
В этой статье описывается использование метода микродиссеции с помощью трансиллюминации для изоляции семенных сегментов труб, представляющих конкретные этапы семенного эпителиального цикла. После изоляции, постановочные сегменты трубчатых может быть предметом различных анализов вниз по течению, в том числе биохимических РНКи белковых анализов 12,13,14,15, потокцитометрии 16, ex vivo трубчатой культуры 17 и иммуностимулирования18. Здесь мы также предоставляем подробные протоколы вниз по течению для подготовки раздавленных монослой постановочных сегментов труб для живого клеточного морфологического анализа и последующего иммуностеинирования, а также цельно-монтажных иммуностементов сегментов труб. Рабочий процесс в двух словах, описанных на рисунке 4.
Метод микродиссекции с помощью трансиллюминации позволяет точно идентифицировать и изоляцию зародышевых клеток на определенных этапах дифференциации благодаря синхронизированному клеточному составу этапов. Важно отметить, что он также позволяет изучать сценические события во время сперматогенеза на живой ткани. Учитывая отсутствие масштабируемых моделей in vitro для сперматогенеза, этот метод также имеет уникальное преимущество, позволяя целевых краткосрочных исследований развития и токсикологических исследований на стадии конкретных сегментов трубоубий ex vivo12,17. Хотя мы описываем метод здесь для мыши, та же процедура может быть применена к любому виду млекопитающих с продольным и сегментальным расположением семенных эпителиальных стадий, таких каккрыса 4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Сперматогенез является уникальным процессом дифференциации, что в конечном итоге приводит к одному из самых различных типов клеток тела, спермы. Дифференциация зародышевых клеток происходит в цитоплазмических карманах соматических клеток Сертоли, которые одновременно принимают от 4 до 5 поколений зародышевых клеток и координируют и синхронизируют их развитие. Таким образом, состав типов зародышевых клеток в поперечном сечении является постоянным, и эти клеточные ассоциации также известны как этапы (I-XII) семенного эпителиального цикла. Важно отметить, что этапы могут быть также определены из нетронутых семенных трубок на основе их дифференциального поглощения света / рассеяния характеристики, выявленные трансилюминации, и тот факт, что этапы следуют друг за другом вдоль трубочки в численном порядке. В этой статье описывается метод микродиссекции с помощью трансиллюминации для изоляции семенных сегментов труб, представляющих конкретные этапы семенного эпителиального цикла мыши. Схема поглощения света семенных трубочки сначала проверяется под микроскопом вскрытия, а затем сегменты труб, представляющие конкретные этапы, вырезаются и используются для нисходящего применения. Здесь мы описываем иммуностимулирование протоколов для стадии конкретных препаратов сквош и для нетронутых сегментов труб. Этот метод позволяет исследователю сосредоточиться на биологических событиях, происходящих на определенных этапах сперматогенеза, обеспечивая тем самым уникальный инструмент для развития, токсикологических и цитологических исследований сперматогенеза и лежащих в основе молекулярных механизмов.

Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Этот протокол описывает трансиллюминации при содействии микроперепись сегментов взрослых мыши семенной трубочки, представляющие конкретные этапы семенной эпителиального цикла, и типы клеток в нем, и последующее иммуностеление сквош препаратов и нетронутых сегментов труб.

Трансиллюминация-помощь рассечение конкретных этапов мыши seminiferous эпителиального цикла для downstream иммуностенсивных анализов

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Шаг конкретных сортировка мыши сперматидах цитометрическим

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Выделение мыши Эндометриальный эпителиальных и стромальных клеток для<em&gt; In Vitro</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Вскрытие Личинки данио гонадная ткани

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Диссекция и культура мышей эмбриональной почки

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Вскрытие и подготовка корональных срез развития гипофиза мыши

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Семенных канальцах Сквош техника для цитологического анализа с помощью мыши модель сперматогенеза

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Анализ одной ячейки транскриптомики эндокринных клеток поджелудочной железы мыши

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Ткань Подготовка и иммуностоирование мыши Craniofacial тканей и недекализированных костей

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Рассечение, культура и анализ первичных черепных нейронных клеток от мыши для изучения нейронных клеток Креста Delamination и миграции

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...