Name: using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00
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这项工作得到了弗吉尼亚-马里兰兽医学院（IA）、弗吉尼亚理工大学工程健康应用科学中心（IA）和国家卫生研究院R21EB028429（IA）的支持。

此处描述的所有方法都经过弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并符合美国国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南。执行此协议需要获得相应机构的许可并遵守所有适当的准则。
1. 细胞培养
<ol><li>制作完整的培养基（RPMI = 10% 胎儿牛血清 +1% 笔链） 。根据 ATCC 协议10 恢复 4T1 细胞，在 T-25 烧瓶中孵育 37 °C 和 5% CO2， ?...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Facts+&amp;+Figures.">Cancer Facts &amp; Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li><li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer:+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis.">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines.">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li><li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools.">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).</li><li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests.">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li><li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression.">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.T.C.C.+4T1+(ATCC+CRL2539)+Product+Sheet.">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li></ol>

如所示，手动计算每个肺板上的转移菌落可能是一种不准确和不精确的方法来量化肺转移，表明需要更好的定量方法（图2）。组织病理学分析与人工计数和斐济-ImageJ分析（图2B和4D）略有不同，可能是因为H&E幻灯片不是整个器官的代表性样本。该协议收获整个肺，因此更代表总肺转移，比手动计数更一致。尝试了几种不同的斐济-ImageJ分析?...

八分之一的女性将在有生之年被诊断出患有乳腺癌，尽管有多种选择治疗，但乳腺癌是美国女性癌症相关死亡的第二大原因。这些妇女不会死于乳房的原发性肿瘤。相反，转移性负担是导致这种疾病的死亡，因为它通常蔓延到肺，骨，脑，肝脏和淋巴结2。因此，乳腺癌模型需要评估转移，以有助于遏制这种疾病的死亡率。4T1乳腺癌模型是一个极好的协议，以做到这一点。此处描述的方法通过使用 Fiji-ImageJ 量化肺转移，从而产生一致和快速的结果，从而改进了 4T1 模型。
4T1模型是成熟的，大多数实验室使用的协议，如那些由普拉斯基和奥斯特朗德-罗森博格在2001年3。4T1细胞系为6-硫冠宁（6TG）耐药，代表四期，三重阴性乳腺癌3，4，5。它是临床上相关的，因为它是一个正畸模型和自发转移到相同的器官，在人类乳腺癌3，4。4T1细胞根据注入的3，4细胞的数量，以可预测的速率自发转移。重要的是，这里使用的小鼠之间的遗传差异导致了转移性负担的预期个体间变异。为了评估转移，组织被收获，以收集和量化癌细胞在遥远的地点使用6TG选择和甲基蓝染色。其结果是组织培养板的集合与蓝点代表转移菌落。然而，普拉斯基和奥斯特朗-罗森博格协议通过手动计算转移菌落来量化它们，因此，这是评估该模型中转移的标准方法。虽然这对于转移性负担低的组织来说很容易，但像肺这样的组织往往充满了转移。由于肺板可以高度汇合，通过人工计数准确和精确地量化转移菌落是困难的，并且容易出现人为错误。为了更好地量化转移性负担，我们描述使用 Fiji-ImageJ 作为基于计算机的人工计数误差解决方案。与血氧林和eosin（H&E）染色的组织病理学分析是量化肺转移的另一种手段，有趣的是，斐济-ImageJ软件6，7也改进了。然而，由于组织病理学分析观察肺的一片，它可以是不准确和不具代表性的。这是因为4T1模型导致整个器官的一些转移性病变，这些病变分布不均匀。虽然组织病理学分析和人工计数之间的总体趋势可能相似，但单个值可能不同，因此组织病理学分析不应作为唯一的量化手段。我们演示了与组织病理学分析相比的好处，以及不同计数器之间手动计数的不一致，同时也展示了使用 Fiji-ImageJ 的一致性。此外，我们表明，这种方法可以减少孵化时间从10-14天到5天，这意味着研究人员可以分析数据从他们的研究比当依靠手动计数更快。
此方法是普拉斯基和奥斯特朗-罗森博格协议3的简单调整的集合。由于4T1模型被广泛使用，并且肺转移是临床前模型中测量的关键参数，我们相信这种方法可以被广泛使用，对乳腺癌研究人员具有很高的价值。唯一需要的额外用品是一台照相机和访问计算机与斐济-ImageJ，一个自由软件经常使用的图像分析9。这种方法特别侧重于肺转移，但它可用于其他组织与严重的转移负担。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic agent</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Female Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Minimum of 8 megapixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of 125 x g and 300 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 euthanasia setup</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold room, refrigerator, cold storage</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with Fiji-ImageJ</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of running Fiji-ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Needs to be capable of 5% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03978-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins or needles</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>For pinning down mice during necropsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic calipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25729-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker or rotating wheel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable filter with PES membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>568-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-cornered plastic beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td>Used to weigh mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm tissue culture plates</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3026802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 g 1/2 in needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 (ATCC&#174; CRL&#173;2539&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Thioguanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Dilute to 70% with DI water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model

乳腺癌是一种毁灭性的恶性肿瘤，仅2019年就导致美国4万名女性死亡，占新诊断女性癌症的30%。乳腺癌相关死亡的主要原因为转移性负担。因此，乳腺癌的临床前模型需要分析转移性负担，以临床相关。4T1乳腺癌模型为第四阶段人类乳腺癌提供了一个自发转移的、可量化的小鼠模型。然而，大多数 4T1 协议通过手动计算组织培养板上的染色菌落来量化转移性负担。虽然这足以使转移负担较低的组织使用，但人工计数中的人为错误会导致板汇合且难以计数时的结果不一致和可变。此方法为人工计数错误提供了基于计算机的解决方案。在这里，我们使用肺（4T1模型中的一种高度转移性组织）来评估协议。在斐济-ImageJ中获取并上传甲基蓝染色板的图像进行分析。然后，Fiji-ImageJ 确定图像选定区域的百分比为蓝色，表示具有转移性负担的板的百分比。这种基于计算机的方法比对高度转移组织的手动计数或组织病理学评估更一致和快速的结果。Fiji-ImageJ 结果的一致性取决于图像的质量。图像之间可能会发生细微的结果变化，因此建议拍摄多个图像并计算结果平均值。尽管其局限性最小，但这种方法通过提供一致和快速的结果，对量化肺转移性负担进行了改进。

此方法包含从普拉斯基和奥斯特朗德-罗森博格 4T1 协议3的简单调整，可在图1 中可视化。当3个独立的研究人员手动计算12个肺板的转移菌落（1：10稀释），结果非常不一致，不同的计数器之间（图2A）。所有研究人员都被指示"计算显示为蓝点的转移菌落"，然而这些不一致之处证明了手动计数高转移性板块的问题。研究人员对4T1模型有...

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Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

我们描述了一种更一致和快速的方法，通过使用 Fiji-ImageJ 来量化 4T1 乳腺癌模型中的肺转移。

利用计算机图像分析提高4T1乳腺癌模型中肺转移的定量

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

该协议量化肺转移，这是乳腺癌相关死亡的一个积极和常见的原因，在临床前乳腺癌模型的精度和效率更高。与原始技术相比，该协议为研究人员提供了更快、更一致的结果。它通过易于使用的计算机技术来减轻人工计数错误。这项技术绝对可以推广到临床前研究，研究乳腺癌疗法对肺转移的影响，让研究人员在成功治疗后证明转移负担减轻了。首先为组织样本标记 15 毫升锥形管。然后加入2.5毫升的四型胶原酶混合物和30单位的弹性酶到管。将肺移动到一个干净的1X HBSS井，用钳子旋转它，以去除任何剩余的血液，然后转移到一个空的3.5厘米组织培养板。用剪刀将肺切碎，然后用2.5毫升的HSSS冲洗盘子，然后用肺片将HSS转移至准备好的15毫升锥形管中，并含有胶原酶和弹性酶鸡尾酒。在摇轮或旋转轮上，在4摄氏度下孵育管子75分钟。同时，为每只小鼠贴上一个50毫升离心管和一个10厘米组织培养板的标签。如果进行稀释，标记足够的组织培养板进行稀释。使用 1X HBSS 将管的体积调至 10 毫升，然后将 70 微米细胞过滤器中的内装物倒入 50 毫升锥形管中。使用一毫升注射器的柱塞通过过滤器轻轻研磨样品。在350倍G下离心管5分钟，丢弃上当液，然后用10毫升1X HBSS洗涤颗粒两次。将颗粒重新在 10 毫升 60 微摩尔 6-硫瓜氨酸完整培养基中，如果需要，使用稀释方案将 10 厘米细胞培养板中的样品进行板状。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育5天。将培养介质从盘子中倒入适当的废物容器中。要修复细胞，在每个盘子中加入五毫升未稀释的甲醇，并在室温下孵育五分钟，确保甲醇旋转，使其覆盖整个盘子。将甲醇从盘子中倒入适当的废物容器中，然后用五毫升蒸馏水冲洗每个盘子。每盘加入五毫升0.03%甲苯蓝，在室温下孵育五分钟，确保使甲基蓝溶液旋转，使其覆盖整个板。将甲基蓝倒入适当的废物容器中，然后用五毫升蒸馏水再次冲洗每个盘子。将盘子倒置，用纸巾盖住，以去除多余的液体。将盘子放在盖子上，让它在一夜之间风干。转移性菌落将是蓝色的。一旦板干燥，它们可以无限期地储存在室温下。从盘子上取下贴有标签的盖子，注意确保样品的清晰识别。将所有染色的肺板放在干净、轻盈的表面上。在光线充足的区域拍摄板集合的照片，确保尽量减少反射。板中的反射会影响图像分析，应避免。密切关注拍摄的照片，从多个角度拍摄几张照片。拍摄板后，裁剪图像以排除盖子或背景中的任何东西。在斐济 ImageJ 中打开图像，然后通过单击图像、调整和颜色阈值将图像更改为黑白。然后选择默认的阈值方法，黑白的阈值颜色，以及颜色空间的实验室。确保未选择深色背景框。图像现在应该是黑白的。黑色表示浅色背景，白色表示蓝色转移菌落。使用圆工具选择要分析的区域。绘制一个圆圈用于所有板，以确保每个板都分析为相同大小的区域。选择可最大化板上分析区域的大小，同时最大限度地减少板边缘的背景噪音。绘制时，工具栏中将显示大小。分析所选圆以确定白色区域的百分比。单击分析和分析粒子，然后选择零到无穷大的大小，零到一的圆形，没有显示。选中汇总框并击打正常。将圆圈移动到图片中的下一个板，抓住它居中并重复分析。将结果复制并粘贴到电子表格中。百分比区域（即所选区域的白色百分比）表示转移性负担。分析所有板和图像后，平均每个板的不同图像之间的百分比区域结果，以减轻图片之间的任何不一致。将斐济 ImageJ 分析与人工计数和组织病理学分析进行比较。当三个独立的研究人员手动计算转移菌落时，结果在计数器之间是不一致的。斐济 ImageJ 结果在三个图像的计数器之间是一致的。三个图像和三个计数器的结果合并在每个肺板。每个板的结果是平均的，以考虑图像之间的变化，这提供了计数器之间的一致结果。当排名板从最到最不转移，手动计数同意在最汇合板，但所有以下排名是不一致的。从平均斐济 ImageJ 结果的排名在计数器之间更加一致。为了证明避免图像中反射的重要性，将显示具有手反射的图像及其随后的 Fiji ImageJ 分析，以及没有反射的同一板的图像。来自脏背景表面的暗瑕疵或血型板上的血液样本残留物也会对斐济 ImageJ 分析产生负面影响。这个血盘只有两个转移菌落，但黑暗残留物导致斐济图像J认为它作为31.6%转移。尝试此协议时，请记住仔细检查图片进行反射，对图像中每个板使用相同的尺寸圆，并在至少三个单独的图像之间对每个板的结果进行平均。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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癌症研究

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该<em&gt;果蝇</em&gt;成虫盘瘤模型：基因的表达与肿瘤侵袭性的可视化和定量遗传马赛克

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肝大肠癌转移的高级动物模型：成像技术和转移性克隆性质

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