Name: using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) og National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Committee (IACUC) i Virginia Tech og i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for pleje og brug af laboratoriedyr. Udførelse af denne protokol kræver tilladelse fra de relevante institutioner og overholdelse af alle relevante retningslinjer.
1. Cellekultur
<ol><li>Lav komplette kulturmedier (RPMI + 10% Føtal Bovine Serum +1% Pen Strep). 4T1 celler genoplives i henhold til AT...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Facts+&amp;+Figures.">Cancer Facts &amp; Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li><li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer:+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis.">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines.">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li><li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools.">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).</li><li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests.">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li><li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression.">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.T.C.C.+4T1+(ATCC+CRL2539)+Product+Sheet.">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li></ol>

Som påvist kan manuel optælling af metastatiske kolonier på hver lungeplade være en unøjagtig og upræcist metode til kvantificering af lungemetastase, hvilket viser behovet for et bedre middel til kvantificering (figur 2). Histopatologisk analyse afveg en smule fra både manuel optælling og Fiji-ImageJ analyse (Figur 2B og 4D), sandsynligvis fordi H & E dias ikke er et repræsentativt udsnit af hele organet. Protokollen høster en hel lun...

En ud af otte kvinder vil blive diagnosticeret med brystkræft i hendes levetid, og alligevel på trods af flere behandlingsmuligheder brystkræft er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald hos amerikanske kvinder1. Disse kvinder er ikke ved at dø af den primære tumor i deres bryst. I stedet, den metastatiske byrde er ansvarlig for dødeligheden af denne sygdom, da det almindeligvis breder sig til lungen, knogle, hjerne, lever, og lymfeknuder2. På grund af dette, brystkræft modeller nødt til at evaluere metastase til at bidrage til at bremse dødeligheden af denne sygdom. Den 4T1 murine brystkræft model er en fantastisk protokol til at opnå dette. Den metode, der er beskrevet her, giver en forbedring af 4T1-modellen ved at bruge Fiji-ImageJ til at kvantificere lungemetastase, hvilket giver konsekvente og hurtige resultater.
4T1-modellen er veletableret, og de fleste laboratorier bruger protokoller som dem, der er beskrevet af Pulaski og Ostrand-Rosenberg i 20013. Den 4T1 celle linje er 6-Thioguanin (6TG) resistente og repræsentative for fase IV, tredobbelt negativ brystkræft3,4,5. Det er klinisk relevant, da det er en ortopisk model og spontant metastaserer til de samme organer som i human brystkræft3,4. 4T1-cellerne metastaserer spontant med en forudsigelig hastighed baseret på mængden af indsprøjtedeceller 3,4. Det er vigtigt, at genetiske forskelle mellem mus, der anvendes her, forårsagede forventede interpersonelle variabiliteter i metastatisk byrde. For at evaluere metastase høstes væv for at indsamle og kvantificere kræftceller på fjerne steder ved hjælp af 6TG udvælgelse og methylenblå farvning. Resultatet er en samling af vævskulturplader med blå prikker, der repræsenterer metastatiske kolonier. Pulaski- og Ostrand-Rosenberg-protokollen kvantificerer imidlertid metastatiske kolonier ved manuelt at tælle dem, og derfor har dette været standardmetoden til vurdering af metastase i denne model. Mens dette er let for væv med lav metastatisk byrde, væv som lungerne er ofte lastet med metastaser. Da lungeplader kan være meget sammenflydende, præcist og præcist kvantificere metastatiske kolonier ved manuel optælling er vanskeligt og udsat for menneskelige fejl. For bedre at kvantificere metastatisk byrde, beskriver vi ved hjælp af Fiji-ImageJ for en computer-baseret løsning til menneskelig optælling fejl. Histopatologisk analyse med hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning er et andet middel til at kvantificere lungemetastaser, og interessant er også blevet forbedret med Fiji-ImageJ software6,7. Men fordi histopatologisk analyse observerer en enkelt skive af lungerne, kan det være unøjagtige og ikke repræsentative. Dette skyldes, at 4T1-modellen forårsager flere metastatiske læsioner i hele orglet, der ikke er jævnt fordelt. Mens de generelle tendenser mellem histopatologisk analyse og manuel optælling kan væreens 8, kan individuelle værdier variere, og derfor bør histopatologisk analyse ikke anvendes som det eneste middel til kvantificering. Vi demonstrerer fordelen i forhold til histopatologisk analyse og uoverensstemmelserne i manuel optælling mellem forskellige tællere, samtidig med at vi viser sammenhængen i brugen af Fiji-ImageJ. Derudover viser vi, at denne metode kan reducere inkubationstiden fra 10-14 dage til 5 dage, hvilket betyder, at forskere kan analysere data fra deres undersøgelse meget hurtigere, end når de er afhængige af manuel optælling.
Denne metode er en samling af enkle justeringer af Pulaski- og Ostrand-Rosenberg-protokollen3. Fordi 4T1-modellen er meget udbredt, og fordi lungemetastastase er en kritisk parameter at måle i prækliniske modeller, mener vi, at denne metode kan anvendes i vid udstrækning og er meget værdifuld for brystkræftforskere. De eneste ekstra forsyninger behov er et kamera og adgang til en computer med Fiji-ImageJ, en gratis software, der ofte anvendes i billedanalyse9. Denne metode fokuserer specifikt på lungemetastase, men det kunne bruges til andre væv med betydelig metastatisk byrde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic agent</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Female Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Minimum of 8 megapixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of 125 x g and 300 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 euthanasia setup</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold room, refrigerator, cold storage</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with Fiji-ImageJ</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of running Fiji-ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Needs to be capable of 5% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03978-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins or needles</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>For pinning down mice during necropsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic calipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25729-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker or rotating wheel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable filter with PES membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>568-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-cornered plastic beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td>Used to weigh mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm tissue culture plates</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3026802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 g 1/2 in needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 (ATCC&#174; CRL&#173;2539&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Thioguanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Dilute to 70% with DI water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model

Brystkræft er en ødelæggende malignitet, der tegner sig for 40.000 kvindelige dødsfald og 30% af nye kvindelige kræftdiagnoser i USA i 2019 alene. Den hyppigste årsag til brystkræft relaterede dødsfald er den metastatiske byrde. Derfor, prækliniske modeller for brystkræft nødt til at analysere metastatisk byrde at være klinisk relevant. Den 4T1 brystkræft model giver en spontant metastaserende, kvantificerbare mus model for fase IV human brystkræft. Men de fleste 4T1 protokoller kvantificere metastatisk byrde ved manuelt at tælle farvede kolonier på væv kultur plader. Selv om dette er tilstrækkeligt til væv med lavere metastatisk byrde, menneskelige fejl i manuel optælling forårsager inkonsekvente og variable resultater, når pladerne er sammenløbet og vanskeligt at tælle. Denne metode tilbyder en computerbaseret løsning til menneskelig optællingsfejl. Her evaluerer vi protokollen ved hjælp af lungen, et meget metastatisk væv i 4T1-modellen. Billeder af methylenblåde plader erhverves og uploades til analyse i Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bestemmer derefter procentdelen af det valgte område af billedet, der er blåt, og repræsenterer pladeprocenten med metastatisk byrde. Denne computerbaserede tilgang giver mere ensartede og hurtige resultater end manuel optælling eller histopatologisk evaluering for meget metastatisk væv. Konsistensen af Fiji-ImageJ resultater afhænger af kvaliteten af billedet. Små variationer i resultaterne mellem billederne kan forekomme, og det anbefales derfor, at der tages flere billeder og resultaterne i gennemsnit. På trods af sine minimale begrænsninger, denne metode er en forbedring at kvantificere metastatisk byrde i lungerne ved at tilbyde konsekvente og hurtige resultater.

Denne metode indeholder enkle justeringer fra Pulaski og Ostrand-Rosenberg 4T1 protokol3 og kan visualiseres i figur 1. Når 3 separate forskere manuelt tælles metastatiske kolonier for 12 lungeplader (1:10 fortynding), resultaterne var meget inkonsekvent mellem forskellige tællere (Figur 2A). Alle forskere blev instrueret til at "tælle metastatiske kolonier, der vises som blå prikker", men uoverensstemmelser viser problemet med manue...

Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Vi beskriver en mere konsekvent og hurtig metode til at kvantificere lungemetastase i 4T1 brystkræft model ved hjælp af Fiji-ImageJ.

Brug computer-baseret billedanalyse til at forbedre kvantificeringen af lungemetastase i 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Denne protokol kvantificerer lungemetastastase, som er en aggressiv og almindelig årsag til brystkræft relateret død, med øget præcision og effektivitet i en præklinisk brystkræft model. Sammenlignet med den oprindelige teknik, denne protokol giver forskerne hurtigere, mere ensartede resultater. Det lindrer menneskelige tælle fejl gennem nem at bruge computerteknologi.Denne teknik kan absolut udvides til præklinisk forskning studere virkningerne af brystkræft behandlinger på lunge metastase ved at tillade forskere at påvise nedsat metastatisk byrde efter vellykket behandling. Begynd med at mærke et konisk rør på 15 milliliter til vævsprøven. Derefter tilsættes 2,5 milliliter af type fire kollagenase blanding og 30 enheder af elastase til røret.Flyt lungen til en ren 1X HBSS brønd og hvirvle det med scelinned for at fjerne eventuelle resterende blod, derefter overføre det til en tom 3,5 centimeter væv kultur plade. Hakke lungen med en saks, derefter skylles pladen med 2,5 milliliter HBSS og overføre HBSS med lungestykker i en forberedt 15 milliliter konisk rør med kollagenase og elastase cocktail. Inkuber røret i 75 minutter ved fire grader Celsius på en rocker eller roterende hjul.I mellemtiden, mærke en 50 milliliter centrifuge rør og en 10 centimeter væv kultur plade for hver mus. Hvis du laver en fortynding, etiket nok væv kultur plader til fortyndinger. Rørvolumenet bringes op til 10 milliliter med 1X HBSS, hvor indholdet hældes over en 70 mikrometercellesting i det koniske rør på 50 milliliter.Brug stemplet på en 1 millilitersprøjte til forsigtigt at slibe prøven gennem semestret. Centrifuge røret i fem minutter ved 350 gange G og kassér supernatanten, og vask derefter pellet to gange med 10 milliliter 1X HBSS. Opslæm pellet i 10 milliliter af 60 mikromolar 6-thioguanin komplet kultur medier, og plade prøverne i de 10 centimeter cellekultur plader ved hjælp af en fortynding ordning, hvis det ønskes.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i fem dage. Hæld kulturmediet af pladerne i den relevante affaldsbeholder. For at fastgøre cellerne tilsættes fem milliliter ufortyndet methanol til hver plade og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur, og sørg for at hvirvle methanolen, så den dækker hele pladen.Methanolen hældes af pladerne i den relevante affaldsbeholder, og skyl derefter hver plade med fem milliliter destilleret vand. Tilsæt fem milliliter 0,03% methylenblåt pr. plade og inkuber den i fem minutter ved stuetemperatur, og sørg for at hvirvle den methylenblåde opløsning, så den dækker hele pladen. Hæld methylenblåt i den relevante affaldsbeholder og skyl hver plade igen med fem milliliter destilleret vand.Vend pladen på hovedet og skamplet den mod en køkkenrulle for at fjerne overskydende væske. Anlæt pladen på låget, og lad den lufttørre natten over. Metastatiske kolonier vil være blå.Når pladerne er tørret, kan de opbevares ved stuetemperatur på ubestemt tid. Fjern de mærkede låg fra pladerne, og sørg for, at prøverne er klar. Line up alle farvede lungeplader på en ren, lys overflade.Tag et billede af samlingen af plader i et godt oplyst område, og sørg for at minimere refleksioner. Refleksioner i pladerne vil påvirke billedanalysen og bør undgås. Vær meget opmærksom på de fotografier, der er taget, og tag flere billeder fra flere vinkler.Når du har fotograferet pladerne, skal du beskære billedet for at udelade lågene eller noget i baggrunden. Åbn billedet i Fiji ImageJ, og skift det til sort-hvid ved at klikke på billede, juster og farvegrænse. Vælg derefter standard for tærskelmetode, sort-hvid for tærskelfarve og laboratorium for farverum.Sørg for, at den mørke baggrundsboks ikke er markeret. Billedet skulle nu være sort og hvidt. Sort repræsenterer den lyse baggrund, og hvid repræsenterer de blå metastatiske kolonier.Brug cirkelværktøjet til at markere det område, der skal analyseres. Tegn en cirkel, der skal bruges til alle pladerne for at sikre, at hver plade analyseres for samme størrelsesområde. Vælg en størrelse, der maksimerer det analyserede område på pladerne, samtidig med at baggrundsstøjen, der vises på kanten af pladerne, minimeres.Størrelsen vises på værktøjslinjen, mens den tegnes. Analysér den valgte cirkel for at bestemme den procentdel af området, der er hvidt. Klik på analysere og analysere partikler, og vælg derefter nul til uendeligt for størrelse, nul til en for cirkularitet, og intet for show.Tjek den opsummerede boks og ramte okay. Flyt cirklen til den næste plade på billedet ved at tage fat i den i midten, og gentag analysen. Kopiere og indsætte resultatet i et regneark.Procentområdet, som er den procentdel af det valgte område, der er hvidt, repræsenterer den metastatiske byrde. Når alle plader og billeder er blevet analyseret, gennemsnit procenten område resultater mellem forskellige billeder for hver plade til at afbøde eventuelle uoverensstemmelser mellem billeder. Fiji ImageJ analyse blev sammenlignet med manuel optælling og histopatologisk analyse.Når tre separate forskere manuelt tælles metastatiske kolonier, resultaterne var inkonsekvente mellem tællere. Fiji ImageJ resultater var konsekvent mellem tællere for hver af de tre billeder. Resultaterne fra de tre billeder og de tre tællere blev kombineret for hver lungeplade.Resultaterne blev gennemsnit for hver plade for at tage højde for variationerne mellem billederne, hvilket gav ensartede resultater mellem tællere. Når ranking pladerne fra de fleste til mindst metastatisk, manuel optælling aftalt på den mest sammenløb plade, men alle følgende rækker var inkonsekvent. Rækken fra den gennemsnitlige Fiji ImageJ resultater var langt mere konsekvent mellem tællere.For at demonstrere vigtigheden af at undgå refleksioner i billederne vises et billede med refleksion af en hånd og dens efterfølgende Fiji ImageJ-analyse sammen med et billede af den samme plade uden refleksion. Mørke pletter fra en snavset baggrundsoverflade eller en blodprøve rest på pladerne kan også have en negativ indvirkning Fiji ImageJ analyse. Denne blodplade har kun to metastatiske kolonier, men de mørke rester forårsaget Fiji ImageJ at betragte det som 31,6% metastatisk.Når du forsøger denne protokol, skal du huske omhyggeligt at undersøge billeder til refleksion, bruge den samme størrelse cirkel for hver plade i billedet, og gennemsnit resultaterne for hver plade mellem mindst tre separate billeder.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliaca Artery Injection til effektiv og selektiv Modellering af mikroskopiske knoglemetastaser

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Advanced Animal Model af kolorektal Metastase i Lever: Imaging teknikker og Ejendomsstyrelsen mod metastatiske kloner

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En Portal Vein Injection Model at studere levermetastaser af brystkræft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiske overvejelser i studere metastatisk lunge kolonisering i Osteosarcoma ved hjælp af pulmonale metastaser Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulær og cellulære Lung Model til at studere Tumor metastaser

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere Triple Negative Breast Cancer Brug Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Modellering af brystkræft i humant brystvæv ved hjælp af et mikrofysiologisk system

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...