Name: using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), het Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) en National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Het uitvoeren van dit protocol vereist toestemming van de juiste instellingen en naleving van alle juiste richtlijnen.
1. Celcultuur
<ol><li>Maak complete kweekmedia (RPMI + 10% Foetale Runder Serum +1% Pen Strep). Herleef 4T1 cellen volgens ATCC Protocol<su...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Facts+&amp;+Figures.">Cancer Facts &amp; Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li><li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer:+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis.">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines.">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li><li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools.">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).</li><li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests.">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li><li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression.">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.T.C.C.+4T1+(ATCC+CRL2539)+Product+Sheet.">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li></ol>

Zoals aangetoond, kan het handmatig tellen van de gemetastaseerde kolonies op elke longplaat een onnauwkeurige en onnauwkeurige methode zijn om longmetastase te kwantificeren, wat de noodzaak van een beter kwantificeringsmiddel aantoont (figuur 2). Histopathologische analyse verschilde enigszins van zowel handmatig tellen als Fiji-ImageJ-analyse(figuur 2B en 4D),waarschijnlijk omdat de H&E-dia's geen representatief monster van het hele orgaan zi...

Een op de acht vrouwen zal worden gediagnosticeerd met borstkanker in haar leven, en toch ondanks meerdere behandeling opties borstkanker is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen bij Amerikaanse vrouwen1. Deze vrouwen sterven niet aan de primaire tumor in hun borst. In plaats daarvan is de uitgezaaide last verantwoordelijk voor de mortaliteit van deze ziekte omdat deze zich vaak verspreidt naar de longen, het bot, de hersenen, de lever en de lymfeklieren2. Daarom moeten borstkankermodellen metastase evalueren om bij te dragen aan het terugdringen van de sterfte van deze ziekte. De 4T1 murine borstkanker model is een prachtig protocol om dit te bereiken. De hier beschreven methode biedt een verbetering van het 4T1-model door Fiji-ImageJ te gebruiken om longmetastase te kwantificeren, wat consistente en snelle resultaten oplevert.
De 4T1 model is goed ingeburgerd, met de meeste laboratoria met behulp van protocollen zoals die beschreven door Pulaski en Ostrand-Rosenberg in 20013. De 4T1-cellijn is 6-Thioguanine (6TG) resistent en representatief voor stadium IV, drievoudig negatief borstkanker3,4,5. Het is klinisch relevant omdat het een orthotopisch model is en spontaan uitzaait naar dezelfde organen als bij borstkanker bij de mens3,4. De 4T1-cellen metastaseren spontaan in een voorspelbaar tempo op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde cellen3,4. Belangrijk is dat genetische verschillen tussen muizen die hier worden gebruikt, de verwachte inter-individuele variabiliteit in gemetastasaire lasten veroorzaakten. Om metastase te evalueren, worden weefsels geoogst om kankercellen in verre gebieden te verzamelen en te kwantificeren met behulp van 6TG-selectie en methyleenblauwe vlekken. Het resultaat is een verzameling weefselkweekplaten met blauwe stippen die uitgezaaide kolonies vertegenwoordigen. Het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg-protocol kwantificeert echter gemetastaseerde kolonies door ze handmatig te tellen, en daarom is dit het standaardmiddel geweest om metastase in dit model te evalueren. Hoewel dit gemakkelijk is voor weefsels met een lage uitgezaaide belasting, weefsels zoals de longen zijn vaak beladen met uitzaaiingen. Aangezien longplaten zeer vloeiend kunnen zijn, is het nauwkeurig en nauwkeurig kwantificeren van uitgezaaide gemetastaseerde kolonies door handmatig tellen moeilijk en gevoelig voor menselijke fouten. Om gemetastaseerde lasten beter te kwantificeren, beschrijven we het gebruik van Fiji-ImageJ voor een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Histopathologische analyse met hematoxylin en eosine (H&E) kleuring is een ander middel om longmetastasen te kwantificeren, en interessant is ook verbeterd met Fiji-ImageJ software6,7. Echter, omdat histopathologische analyse een enkel stukje van de long observeert, kan het onjuist en niet representatief zijn. Dit komt omdat het 4T1-model verschillende uitgezaaide laesies door het hele orgaan veroorzaakt die niet gelijkmatig verdeeld zijn. Hoewel de algemene trends tussen histopathologische analyse en handmatig tellen vergelijkbaar kunnen zijn8, kunnen de individuele waarden verschillen en mag histopathologische analyse daarom niet worden gebruikt als enig kwantificeringsmiddel. We tonen het voordeel ten opzichte van histopathologische analyse en de inconsistenties in handmatig tellen tussen verschillende tellers, terwijl ook de consistentie van het gebruik van Fiji-ImageJ aantoont. Bovendien tonen we aan dat deze methode de incubatietijd kan verminderen van 10-14 dagen tot 5 dagen, wat betekent dat onderzoekers gegevens uit hun studie veel eerder kunnen analyseren dan wanneer ze vertrouwen op handmatig tellen.
Deze methode is een verzameling eenvoudige aanpassingen aan het Pulaski en Ostrand-Rosenberg protocol3. Omdat het 4T1-model veel wordt gebruikt en omdat longmetastase een kritieke parameter is om te meten in preklinische modellen, geloven we dat deze methode op grote schaal kan worden gebruikt en zeer waardevol is voor borstkankeronderzoekers. De enige extra benodigdheden die nodig zijn een camera en toegang tot een computer met Fiji-ImageJ, een gratis software die vaak wordt gebruikt in beeldanalyse9. Deze methode richt zich specifiek op longmetastase, maar het kan worden gebruikt voor andere weefsels met een aanzienlijke uitgezaaide last.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic agent</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Female Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Minimum of 8 megapixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of 125 x g and 300 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 euthanasia setup</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold room, refrigerator, cold storage</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with Fiji-ImageJ</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of running Fiji-ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Needs to be capable of 5% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03978-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins or needles</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>For pinning down mice during necropsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic calipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25729-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker or rotating wheel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable filter with PES membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>568-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-cornered plastic beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td>Used to weigh mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm tissue culture plates</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3026802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 g 1/2 in needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 (ATCC&#174; CRL&#173;2539&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Thioguanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Dilute to 70% with DI water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model

Borstkanker is een verwoestende maligniteit, goed voor 40.000 vrouwelijke sterfgevallen en 30% van de nieuwe vrouwelijke kankerdiagnoses in de Verenigde Staten alleen al in 2019. De belangrijkste oorzaak van borstkanker gerelateerde sterfgevallen is de uitgezaaide last. Daarom moeten preklinische modellen voor borstkanker gemetastaseerde belasting analyseren om klinisch relevant te zijn. Het 4T1 borstkankermodel biedt een spontaan metastaserend, kwantificeerbaar muismodel voor stadium IV borstkanker bij de mens. Echter, de meeste 4T1 protocollen kwantificeren de uitgezaaide last door handmatig te tellen gekleurde kolonies op weefselkweek platen. Hoewel dit voldoende is voor weefsels met een lagere uitgezaaide belasting, veroorzaakt menselijke fout in handmatig tellen inconsistente en variabele resultaten wanneer platen samenvloeiend en moeilijk te tellen zijn. Deze methode biedt een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Hier evalueren we het protocol met behulp van de long, een zeer uitgezaaid weefsel in het 4T1-model. Afbeeldingen van methyleen blauw bevlekte platen worden verworven en geüpload voor analyse in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bepaalt vervolgens het percentage van het geselecteerde gebied van de afbeelding dat blauw is, wat het percentage van de plaat met uitgezaaide last vertegenwoordigt. Deze computergebaseerde aanpak biedt consistentere en snellere resultaten dan handmatig tellen of histopathologische evaluatie voor zeer uitgezaaide weefsels. De consistentie van fiji-ImageJ resultaten hangt af van de kwaliteit van het beeld. Kleine variaties in de resultaten tussen beelden kunnen optreden, dus het wordt aanbevolen dat meerdere beelden worden genomen en resultaten gemiddeld. Ondanks de minimale beperkingen is deze methode een verbetering van het kwantificeren van uitgezaaide belasting in de longen door consistente en snelle resultaten te bieden.

Deze methode bevat eenvoudige aanpassingen van het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg 4T1-protocol3 en kan worden gevisualiseerd in figuur 1. Wanneer 3 afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde gemetastaseerde kolonies voor 12 longplaten (1:10 verdunning), de resultaten waren zeer inconsistent tussen de verschillende tellers (Figuur 2A). Alle onderzoekers werden gericht om "tellen de gemetastaseerde kolonies die verschijnen als blau...

Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

We beschrijven een meer consistente en snelle methode om longmetastase te kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met behulp van Fiji-ImageJ.

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Dit protocol kwantificeert longmetastase, dat is een agressieve en veel voorkomende oorzaak van borstkanker gerelateerde dood, met verhoogde precisie en efficiëntie in een preklinische borstkanker model. In vergelijking met de oorspronkelijke techniek, dit protocol geeft onderzoekers snellere, meer consistente resultaten. Het verlicht de fout bij het tellen van mensen door gebruiksvriendelijke computertechnologie.Deze techniek kan absoluut worden uitgebreid tot preklinisch onderzoek naar de effecten van borstkankertherapieën op longmetastase door onderzoekers toe te staan een verminderde uitgezaaide last aan te tonen na een succesvolle behandeling. Begin met het labelen van een 15 milliliter conische buis voor het weefselmonster. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van het collagenasemengsel van het type vier en 30 eenheden elastase toe aan de buis.Verplaats de long naar een schone 1X HBSS goed en wervel het met tangen om het resterende bloed te verwijderen, dan overbrengen naar een lege 3,5 centimeter weefsel kweekplaat. Hak de long met een schaar, spoel de plaat met 2,5 milliliter HBSS en breng de HBSS met de longstukken in een bereide 15 milliliter conische buis met de collagenase en elastase cocktail. Broed de buis gedurende 75 minuten bij vier graden Celsius op een tuimelschakelaar of roterend wiel.Ondertussen, label een 50 milliliter centrifuge buis en een 10 centimeter weefsel cultuur plaat voor elke muis. Als het doen van een verdunning, etiket genoeg weefsel kweekplaten voor de verdunningen. Breng het volume van de buis tot 10 milliliter met 1X HBSS en giet de inhoud vervolgens over een 70 micrometer celzeef in de 50 milliliter conische buis.Gebruik de zuiger van een een milliliter spuit om het monster voorzichtig te malen door de zeef. Centrifuge de buis gedurende vijf minuten op 350 keer G en gooi de supernatant weg en was de pellet twee keer met 10 milliliter 1X HBSS. Resuspend de pellet in 10 milliliter van 60 micromolar 6-thioguanine volledige cultuur media, en plaat de monsters in de 10 centimeter celkweek platen met behulp van een verdunningsschema indien gewenst.Broed de platen vijf dagen lang in op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Giet cultuurmedia van de platen in de aangewezen afvalcontainer. Om de cellen te bevestigen, voeg vijf milliliter onverdunde methanol aan elke plaat en uitbroeden gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat de methanol wervelen, zodat het de hele plaat bedekt.Giet de methanol van de platen in de juiste afvalcontainer en spoel vervolgens elke plaat af met vijf milliliter gedestilleerd water. Voeg vijf milliliter 0,03% methyleenblauw per plaat toe en broed het vijf minuten bij kamertemperatuur uit, zodat de methyleenblauwe oplossing zo wordt gewerveld dat de hele plaat bedekt. Giet het methyleenblauw in de juiste afvalcontainer en spoel elke plaat opnieuw af met vijf milliliter gedestilleerd water.Draai de plaat ondersteboven en dep het tegen een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Leg de plaat op het deksel en laat het 's nachts drogen. Uitgezaaide kolonies zullen blauw zijn.Zodra de platen zijn gedroogd, kunnen ze worden opgeslagen bij kamertemperatuur voor onbepaalde tijd. Verwijder de gelabelde deksels van de platen, zorg ervoor dat de monsters duidelijk worden geïdentificeerd. Zet alle gekleurde longplaten op een schoon, licht oppervlak.Maak een foto van de verzameling platen in een goed verlichte ruimte, om reflecties te minimaliseren. Reflecties in de platen beïnvloeden de beeldanalyse en moeten worden vermeden. Besteed veel aandacht aan de genomen foto's, en neem verschillende foto's vanuit verschillende hoeken.Na het fotograferen van de platen, bijsnijden van de afbeelding om de deksels of iets op de achtergrond uit te sluiten. Open de afbeelding in Fiji ImageJ en wijzig deze in zwart-wit door op afbeelding, aanpassing en kleurdrempel te klikken. Selecteer vervolgens standaard voor drempelmethode, zwart-wit voor drempelkleur en lab voor kleurruimte.Controleer of het donkere achtergrondvak niet is geselecteerd. Het beeld moet nu zwart-wit zijn. Zwart vertegenwoordigt de lichte achtergrond, en wit vertegenwoordigt de blauwe uitgezaaide kolonies.Gebruik het gereedschap Cirkel om het te analyseren gebied te selecteren. Teken een cirkel te gebruiken voor alle platen om ervoor te zorgen dat elke plaat wordt geanalyseerd voor hetzelfde formaat gebied. Kies een grootte die het geanalyseerde gebied op de platen maximaliseert terwijl het minimaliseren van het achtergrondgeluid dat op de rand van de platen verschijnt.De grootte wordt weergegeven op de werkbalk terwijl deze wordt getekend. Analyseer de geselecteerde cirkel om het percentage wit te bepalen. Klik op analyseren en analyseren van deeltjes, selecteer vervolgens nul tot oneindig voor grootte, nul tegen een voor circulariteit, en niets voor show.Controleer het samengevatte vakje en druk op oke. Verplaats de cirkel naar de volgende plaat in de afbeelding door het midden te grijpen en de analyse te herhalen. Kopieer en plak het resultaat in een spreadsheet.Het percentagegebied, het percentage van het geselecteerde gebied dat wit is, vertegenwoordigt de uitgezaaide last. Zodra alle platen en afbeeldingen zijn geanalyseerd, gemiddeld het percentage gebied resultaten tussen verschillende beelden voor elke plaat om eventuele inconsistenties tussen foto's te beperken. Fiji ImageJ analyse werd vergeleken met handmatig tellen en histopathologische analyse.Toen drie afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde uitgezaaide kolonies, de resultaten waren inconsistent tussen tellers. Fiji ImageJ resultaten waren consistent tussen tellers voor elk van de drie beelden. De resultaten van de drie beelden en de drie tellers werden voor elke longplaat gecombineerd.De resultaten werden gemiddeld voor elke plaat om rekening te houden met de variaties tussen de beelden, die consistente resultaten tussen tellers. Bij het rangschikken van de platen van de meeste tot minst gemetastaseren, handmatig tellen overeengekomen op de meest confluente plaat, maar alle volgende rangen waren inconsistent. De rangen van de gemiddelde Fiji ImageJ resultaten waren veel meer consistent tussen tellers.Om het belang aan te tonen van het vermijden van reflecties in de beelden, wordt een beeld met de reflectie van een hand en de daaropvolgende Fiji ImageJ-analyse getoond, samen met een afbeelding van dezelfde plaat zonder reflectie. Donkere vlekken van een vuil achtergrondoppervlak of een bloedmonster residu op de platen kan ook een negatieve invloed Fiji ImageJ analyse. Deze bloedplaat heeft slechts twee uitgezaaide kolonies, maar het donkere residu veroorzaakt Fiji ImageJ te beschouwen als 31,6%uitgezaaid.Bij het proberen van dit protocol, vergeet niet om zorgvuldig te onderzoeken foto's voor reflectie, gebruik maken van dezelfde grootte cirkel voor elke plaat in de afbeelding, en de gemiddelde resultaten voor elke plaat tussen ten minste drie afzonderlijke beelden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulair en cellulaire Lung Model studie Tumor uitzaaiingen

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...