Name: using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכללה לרפואה וטרינרית וירג'יניה-מרילנד (IA), המכון הטכנולוגי וירג'יניה לטכנולוגיה קריטית ומרכז מדע יישומי לבריאות מהונדסת (IA), והמונים הלאומיים לבריאות R21EB028429 (IA).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של וירג'יניה טק ובהתאם למדריך הלאומי של מכוני הבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. ביצוע פרוטוקול זה דורש אישור מהמוסדות המתאימים ודבקות בכל ההנחיות המתאימות.
1. תרבות התאים
<ol><li>הפוך מדיה ...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Facts+&amp;+Figures.">Cancer Facts &amp; Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li><li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer:+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis.">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines.">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li><li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools.">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).</li><li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests.">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li><li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression.">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.T.C.C.+4T1+(ATCC+CRL2539)+Product+Sheet.">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li></ol>

כפי שהוכח, ספירה ידנית של המושבות גרורתיות על כל לוח ריאות יכולה להיות שיטה לא מדויקת ולא מדויקת לכימות גרורות ריאות, המדגימה את הצורך באמצעי כימות טוב יותר (איור 2). הניתוח ההיסטופתולוגי היה שונה במקצת הן מספירה ידנית והן מניתוח פיג'י-ImageJ (איור 2B ו- 4D</strong...

אחת מכל שמונה נשים תאובחנו עם סרטן השד בחייה, ובכל זאת למרות אפשרויות טיפול מרובות סרטן השד הוא הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן אצל נשיםאמריקאיות 1. הנשים האלה לא מתות מהגידול העיקרי בשד שלהן. במקום זאת, הנטל גרורתי אחראי על התמותה של מחלה זו כפי שהוא מתפשט בדרך כלל לריאות, עצם, מוח, כבד, ובלוטותהלימפה 2. בגלל זה, מודלים סרטן השד צריך להעריך גרורות לתרום לריסון התמותה של מחלה זו. מודל סרטן השד 4T1 מורין הוא פרוטוקול מעולה כדי להשיג זאת. השיטה המתוארת כאן מציעה שיפור לדגם 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ לכימות גרורות ריאות, תוך הפקת תוצאות עקביות ומזרזות.
מודל 4T1 מבוסס היטב, כאשר רוב המעבדות משתמשות בפרוטוקולים כגון אלה שתוארו על ידי פולסקי ואוסטראן-רוזנברג בשנת 20013. קו התא 4T1 הוא 6-Thioguanine (6TG) עמיד ונציג של שלב IV, סרטן השדשלילי משולש 3,4,5. זה רלוונטי מבחינה קלינית כפי שהוא מודל אורתוטופי באופן ספונטני גרורות לאותם איברים כמו בסרטן השד האנושי3,4. תאי 4T1 שולחים גרורות באופן ספונטני בקצב צפוי בהתבסס על כמות התאים שהוזרקו3,4. חשוב לציין, הבדלים גנטיים בין עכברים המשמשים כאן גרמו שונות בין-אינדיבידואלית צפויה בנטל גרורתי. כדי להעריך גרורות, רקמות נקצרות כדי לאסוף ולכמת תאים סרטניים באתרים מרוחקים באמצעות בחירת 6TG וכתמים כחולים מתילן. התוצאה היא אוסף של צלחות תרבות רקמה עם נקודות כחולות המייצגות מושבות גרורתיות. עם זאת, פרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג מכמת מושבות גרורתיות על ידי ספירה ידנית שלהן, ולכן זה היה האמצעי הסטנדרטי להערכת גרורות במודל זה. אמנם זה קל עבור רקמות עם נטל גרורתי נמוך, רקמות כמו הריאות הם לעתים קרובות עמוס גרורות. כמו לוחות ריאות יכול להיות מאוד confluent, מדויק ובדיוק כימות מושבות גרורתיות על ידי ספירה ידנית קשה נוטה לטעות אנוש. כדי לכמת טוב יותר את העומס גרורתי, אנו מתארים שימוש בפיג'י-ImageJ לפתרון מבוסס מחשב לשגיאת ספירה אנושית. ניתוח היסטופתולוגי עם hematoxylin ו eosin (H&E) כתמים הוא אמצעי נוסף לכמת גרורות ריאות, ומעניין גם שופרה עם פיג'י-ImageJתוכנה 6,7. עם זאת, מכיוון שניתוח היסטופתולוגי מתבונן בפרוסה אחת של הריאה, הוא יכול להיות לא מדויק ולא מיוצג. הסיבה לכך היא כי מודל 4T1 גורם מספר נגעים גרורתיים לאורך האיבר כי הם לא מופצים באופן שווה. בעוד המגמות הכוללות בין ניתוח היסטופתולוגי וספירהידנית יכול להיות דומה 8, ערכים בודדים יכולים להיות שונים ולכן ניתוח היסטופתולוגי לא צריך לשמש כאמצעי היחיד לכמת. אנו מדגימים את התועלת בהשוואה לניתוח ההיסטופתולוגי ולאי העקביות בספירה ידנית בין מונים שונים, תוך הפגנת העקביות של השימוש בפיג'י-ImageJ. בנוסף, אנו מראים כי שיטה זו יכולה להפחית את זמן הדגירה מ 10-14 ימים עד 5 ימים, כלומר חוקרים יכולים לנתח נתונים מהמחקר שלהם הרבה יותר מוקדם מאשר כאשר מסתמכים על ספירה ידנית.
שיטה זו היא אוסף של התאמות פשוטות לפרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג3. מכיוון שמודל 4T1 נמצא בשימוש נרחב, ומכיוון שגרוריות ריאות הן פרמטר קריטי למדידה במודלים פרה-קליניים, אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה להיות בשימוש נרחב ובעלת ערך רב לחוקרי סרטן השד. האספקה הנוספים היחידה הדרושה היא מצלמה וגישה למחשב עם Fiji-ImageJ, תוכנה חופשית המשמשת לעתים קרובות בניתוח תמונה9. שיטה זו מתמקדת במיוחד גרורות ריאות, אבל זה יכול לשמש עבור רקמות אחרות עם נטל גרורתי משמעותי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic agent</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Female Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Minimum of 8 megapixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of 125 x g and 300 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 euthanasia setup</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold room, refrigerator, cold storage</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with Fiji-ImageJ</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of running Fiji-ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Needs to be capable of 5% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03978-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins or needles</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>For pinning down mice during necropsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic calipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25729-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker or rotating wheel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable filter with PES membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>568-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-cornered plastic beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td>Used to weigh mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm tissue culture plates</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3026802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 g 1/2 in needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 (ATCC&#174; CRL&#173;2539&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Thioguanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Dilute to 70% with DI water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model

סרטן השד הוא ממאירות הרסנית, המהווה 40,000 מקרי מוות של נשים ו -30% מאבחוני סרטן הנשים החדשים בארצות הברית בשנת 2019 בלבד. הגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן השד הוא הנטל גרורתי. לכן, מודלים פרה-קליניים לסרטן השד צריכים לנתח נטל גרורתי כדי להיות רלוונטיים מבחינה קלינית. מודל סרטן השד 4T1 מספק באופן ספונטני גרורות, מודל העכבר לכימות עבור שלב IV סרטן השד האנושי. עם זאת, רוב פרוטוקולי 4T1 לכמת את הנטל גרורתי על ידי ספירה ידנית מושבות מוכתמות על צלחות תרבות הרקמות. אמנם זה מספיק עבור רקמות עם נטל גרורתי נמוך יותר, טעות אנוש בספירה ידנית גורמת לתוצאות לא עקביות ומשתנות כאשר צלחות הן confluent וקשה לספור. שיטה זו מציעה פתרון מבוסס מחשב לשגיאת ספירה אנושית. כאן, אנו מעריכים את הפרוטוקול באמצעות הריאה, רקמה גרורתית מאוד במודל 4T1. תמונות של לוחות מוכתמים בכחול מתילן נרכשים ומועלים לניתוח בפיג'י-ImageJ. פיג'י-ImageJ קובע את אחוז האזור הנבחר בתמונה הכחול, המייצג את אחוז הלוח בעומס גרורתי. גישה מבוססת מחשב זו מציעה תוצאות עקביות ומזרזות יותר מאשר ספירה ידנית או הערכה היסטופתולוגית לרקמות גרורתיות ביותר. העקביות של תוצאות Fiji-ImageJ תלויה באיכות התמונה. ניתן לבצע שינויים קלים בתוצאות בין תמונות, ולכן מומלץ לנקוט במספר תמונות ולתוצאות ממוצעות. למרות המגבלות המינימליות שלה, שיטה זו היא שיפור לכמת נטל גרורתי בריאה על ידי מתן תוצאות עקביות ומהירות.

שיטה זו מכילה התאמות פשוטות מפרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג 4T13 ו ניתן לדמיין אותן איור 1. כאשר 3 חוקרים נפרדים ספרו ידנית מושבות גרורתיות עבור 12 צלחות ריאה (דילול של 1:10), התוצאות היו מאוד לא עקביות בין מונים שונים (איור 2A). כל החוקרים הופנו "לספו...

Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

אנו מתארים שיטה עקבית ומזרזת יותר לכמת גרורות ריאות במודל סרטן השד 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ.

שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

פרוטוקול זה מכמת גרורות ריאות, שהוא גורם אגרסיבי ונפוץ למוות הקשור לסרטן השד, עם דיוק ויעילות מוגברים במודל סרטן שד פרה-קליני. בהשוואה לטכניקה המקורית, פרוטוקול זה נותן לחוקרים תוצאות מהירות ועקביות יותר. זה מקל על טעות ספירה אנושית באמצעות טכנולוגיית מחשב קלה לשימוש.טכניקה זו בהחלט ניתן להאריך למחקר פרה-קליני לחקור את ההשפעות של טיפולים בסרטן השד על גרורות ריאות על ידי מתן אפשרות לחוקרים להדגים נטל גרורתי ירד לאחר טיפול מוצלח. התחל על ידי תיוג צינור חרוט 15 מיליליטר עבור מדגם הרקמה. לאחר מכן מוסיפים 2.5 מיליליטר של תערובת קולגן מסוג 4 ו -30 יחידות של אלסטאז לצינור.להעביר את הריאה נקי 1X HBSS היטב מערבולת אותו עם ממטרים כדי להסיר את כל הדם שנותר, ולאחר מכן להעביר אותו צלחת ריקה 3.5 סנטימטר רקמת רקמות. טחון את הריאה עם מספריים, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת עם 2.5 מיליליטר של HBSS ולהעביר את HBSS עם חתיכות הריאות לתוך צינור חרוט מוכן 15 מיליליטר עם קולגן וקוקטייל אלסטאז. דגירה הצינור במשך 75 דקות בארבע מעלות צלזיוס על נדנדה או גלגל מסתובב.בינתיים, תייג צינור צנטריפוגה אחד של 50 מיליליטר ולוחית תרבות רקמה אחת של 10 ס"מ לכל עכבר. אם עושים דילול, לתייג מספיק צלחות רקמה לדילול. להביא את נפח הצינור עד 10 מיליליטר עם 1X HBSS, ואז לשפוך את התוכן על מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך הצינור חרוט 50 מיליליטר.השתמש הבוכנה של מזרק מיליליטר אחד כדי לטחון בעדינות את המדגם דרך מסננת. צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 350 פעמים G ולהשליך את supernatant, ולאחר מכן לשטוף את גלולה פעמיים עם 10 מיליליטר של 1X HBSS. תן מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של 60 מיקרומולרי 6-thioguanine להשלים את המדיה התרבותית, צלחת הדגימות 10 ס"מ צלחות תרבות התא באמצעות ערכת דילול אם תרצה.הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמישה ימים. יוצקים מדיה תרבותית מהצלחות לתוך מיכל הפסולת המתאים. כדי לתקן את התאים, להוסיף חמישה מיליליטר של מתנול לא מזוהה לכל צלחת דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הקפדה על מערבולת מתנול כך שהוא מכסה את הצלחת כולה.יוצקים את מתנול מהצלחות לתוך מיכל הפסולת המתאים, ולאחר מכן לשטוף כל צלחת עם חמישה מיליליטר של מים מזוקקים. הוסיפו חמישה מיליליטר של 0.03% מתילן כחול לצלחת והדקרו אותה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ודאגו לסובב את הפתרון הכחול של המתילן כך שיכסה את הצלחת כולה. יוצקים את כחול המתילן לתוך מיכל הפסולת המתאים ושטיפת כל צלחת שוב עם חמישה מיליליטר של מים מזוקקים.הופכים את הצלחת ומנפחים אותה על מגבת נייר כדי להסיר נוזל עודף. מניחים את הצלחת על המכסה שלה ולתת לו אוויר יבש לילה. מושבות גרורתיות יהיו כחולות.לאחר שהצלחות התייבשו, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן. הסר את המכסים המסווים מהצלחות, תוך הקפדה על זיהוי ברור של הדגימות. בשורה את כל לוחות הריאות מוכתמים על משטח נקי וקל.צלם תמונה של אוסף הצלחות באזור מואר היטב, הקפד למזער השתקפויות. השתקפויות בצלחות ישפיעו על ניתוח התמונה ויש להימנע מהן. שימו לב לתמונות שצולמו וצילמו מספר תמונות מכמה זוויות.לאחר צילום הצלחות, חותכים את התמונה כדי לא לכלול את המכסים או כל דבר ברקע. פתח את התמונה ב- Fiji ImageJ ושנה אותה לשחור-לבן על-ידי לחיצה על סף תמונה, התאמה וצבע. לאחר מכן בחרו באפשרות 'ברירת מחדל' לשיטת סף, בשחור-לבן לצבע סף ובמעבדה למרחב צבע.ודא שתיבת הרקע הכהה לא נבחרה. התמונה צריכה להיות עכשיו שחור ולבן. שחור מייצג את רקע האור, ולבן מייצג את המושבות גרורתיות כחולות.השתמש בכלי עיגול כדי לבחור את האזור שיש לנתח. ציירו עיגול אחד לשימוש עבור כל הלוחות כדי להבטיח שכל לוח ינותח עבור אותו אזור בגודל. בחר גודל המגדיל את האזור שנותח על הלוחות תוך מזעור רעשי הרקע המופיעים בקצה הלוחות.הגודל מופיע בסרגל הכלים בעת ציורו. נתח את העיגול הנבחר כדי לקבוע את אחוז האזור הלבן. לחץ על לנתח ולנתח חלקיקים, ולאחר מכן לבחור אפס עד אינסוף לגודל, אפס לאחד עבור מעגליות, ושום דבר להצגה.בדוק את התיבה המסוכמת ופגע בסדר. הזז את העיגול לצלחת הבאה בתמונה על-ידי תפיסתה במרכז וחזרה על הניתוח. העתק והדבק את התוצאה בגיליון אלקטרוני.אזור האחוזים, שהוא האחוז מהאזור שנבחר שהוא לבן, מייצג את הנטל גרורתי. לאחר שניתחו את כל הלוחות והתמונות, ממוצע תוצאות אזור האחוזים בין תמונות שונות עבור כל לוח כדי לצמצם את חוסר העקביות בין התמונות. ניתוח פיג'י ImageJ הושווה לספירה ידנית וניתוח היסטופתולוגי.כאשר שלושה חוקרים נפרדים ספרו באופן ידני מושבות גרורתיות, התוצאות לא היו עקביות בין מונים. תוצאות פיג'י ImageJ היו עקביות בין מונים עבור כל אחת משלוש התמונות. התוצאות משלוש התמונות ושלושת המונים שולבו עבור כל צלחת ריאות.התוצאות היו ממוצעות עבור כל לוח כדי להסביר את הווריאציות בין התמונות, אשר סיפק תוצאות עקביות בין מונים. כאשר דירוג הצלחות מרוב למטה-סטטי לפחות, ספירה ידנית הסכימה על הצלחת הנפוצה ביותר, אך כל השורות הבאות לא היו עקביות. השורות מהתוצאות הממוצעות של פיג'י ImageJ היו הרבה יותר עקביות בין מונים.כדי להדגים את החשיבות של הימנעות השתקפויות בתמונות, תמונה עם השתקפות של יד וניתוח פיג'י ImageJ הבאים שלה מוצג יחד עם תמונה של אותו לוח ללא השתקפות. פגמים כהים ממשטח רקע מלוכלך או שאריות דגימת דם על הצלחות יכולים גם להשפיע לרעה על ניתוח פיג'י ImageJ. לוחית דם זו כוללת רק שתי מושבות גרורתיות, אך השאריות הכהות גרמו לפיג'י ImageJ לשקול זאת כ-31.6% גרורתי.בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לבחון בקפידה תמונות להשתקפות, להשתמש באותו עיגול גודל עבור כל לוח בתמונה, ולתזמן את התוצאות עבור כל לוח בין שלוש תמונות נפרדות לפחות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

הזרקת עורק Intra-כסל עבור דוגמנות יעילה וסלקטיבי של מיקרוסקופיים עצם גרור

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...