Name: using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00
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この研究は、バージニア・メリーランド州獣医学部(IA)、バージニア工科大学臨界技術・応用医療センター(IA)、国立衛生研究所R21EB028429(IA)によって支援されました。

ここに記載されているすべての方法は、バージニア工科大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドに従って承認されています。このプロトコルを実行するには、適切な機関からの許可とすべての適切なガイドラインへの遵守が必要です。
1. 細胞培養
<ol><li>完全な培養培地(RPMI + 10%胎児血清 +1...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Facts+&amp;+Figures.">Cancer Facts &amp; Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li><li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer:+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis.">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines.">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li><li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools.">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).</li><li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests.">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li><li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression.">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.T.C.C.+4T1+(ATCC+CRL2539)+Product+Sheet.">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li></ol>

示されているように、各肺板上の転移コロニーを手動で数えることは、肺転移を定量する不正確で不正確な方法であり、より良い定量手段の必要性を示す(図2)。H&Eスライドは臓器全体の代表的なサンプルではないため、組織病理学的分析は手動計数とフィジー-ImageJ分析(図2Bおよび4D)の両方とは若干異なった。プロトコルは肺全体を収?...

女性の8人に1人は生涯に乳がんと診断されますが、複数の治療オプションにもかかわらず、乳癌はアメリカの女性における癌関連死の第2位の原因です。これらの女性は、彼らの胸の原発性腫瘍で死んでいない。その代わりに、転移性負担は、一般的に肺、骨、脳、肝臓、およびリンパ節2に広がるにつれて、この疾患の死亡率を担う。このため、乳がんモデルは転移を評価してこの疾患の死亡率を抑制する必要があります。4T1マウス乳癌モデルはこれを達成するためのすばらしいプロトコルである。ここで説明する方法は、フィジー-ImageJを使用して肺転移を定量化し、一貫した迅速な結果を生み出すことで、4T1モデルの改善を提供します。
4T1モデルは確立されており、ほとんどのラボでは、2001年にプラスキとオストランド・ローゼンバーグが記述したプロトコルを使用しています。4T1細胞株は、6-チオグアニン(6TG)耐性であり、ステージIV、トリプルネガティブ乳癌3、4、5の代表である。それは、直交性モデルであり、ヒト乳癌3,4と同じ器官に自発的に転移するので、臨床的に関連している。4T1細胞は、3,4を注入した細胞の量に基づいて予測可能な速度で自発的に転移する。重要なことに、ここで使用されるマウス間の遺伝的な違いは、転移性負担における予想される個人間変動を引き起こした。転移を評価するために、組織を採取して、6TG選択とメチレンブルー染色を用いて遠方の部位で癌細胞を採取し定量します。結果は、転移性コロニーを表す青い点を有する組織培養プレートの集合である。しかし、プラスキとオストランド・ローゼンバーグのプロトコルは、転移性コロニーを手動で数えることによって定量化するため、このモデルの転移を評価する標準的な手段となっています。これは転移性負担の少ない組織では容易であるが、肺のような組織はしばしば転移を伴う。肺プレートは非常にコンフルエントであり得るため、手動カウントによって転移性コロニーを正確かつ正確に定量化することは困難であり、人為的ミスを起こしやすい。転移性の負担をより良く定量化するために、人数カウントエラーに対するコンピュータベースのソリューションに Fiji-ImageJ を使用する方法について説明します。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色を用いた病理組織学的解析は、肺転移を定量するもう一つの手段であり、興味深いことにフィジー-ImageJソフトウェア6,7で改善された。しかし、組織病理学的分析は肺の単一のスライスを観察するので、不正確で非代表的である可能性があります。これは、4T1モデルが均一に分布していない器官全体でいくつかの転移性病変を引き起こすからです。組織病理学的解析と手動カウントの全体的な傾向は8と似ていますが、個々の値は異なるため、組織病理学的分析は定量の唯一の手段として使用しないでください。我々は、異なるカウンタ間の手動カウントにおける組織病理学的分析との比較に比べて利点を示し、同時にFiji-ImageJを使用する一貫性を実証する。さらに、この方法は、インキュベーション時間を10〜14日から5日に短縮できることを示し、研究者は手動カウントに頼るときよりもはるかに早く研究のデータを分析できることを示しています。
この方法は、プラスキとオストランド・ローゼンバーグプロトコル3に対する簡単な調整のコレクションです。4T1モデルは広く使用されており、肺転移は前臨床モデルで測定する重要なパラメータであるため、この方法は広く使用でき、乳がん研究者にとって非常に価値があると考えています。必要な追加の供給は、カメラとフィジー-ImageJ、画像解析9で頻繁に使用されるフリーソフトウェアを搭載したコンピュータへのアクセスです。この方法は特に肺転移に焦点を当てていますが、転移性の大きな負担を伴う他の組織に使用することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic agent</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Female Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Minimum of 8 megapixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of 125 x g and 300 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 euthanasia setup</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold room, refrigerator, cold storage</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with Fiji-ImageJ</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of running Fiji-ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Needs to be capable of 5% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03978-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins or needles</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>For pinning down mice during necropsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic calipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25729-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker or rotating wheel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable filter with PES membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>568-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-cornered plastic beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td>Used to weigh mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm tissue culture plates</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3026802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 g 1/2 in needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 (ATCC&#174; CRL&#173;2539&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Thioguanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Dilute to 70% with DI water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model

乳癌は壊滅的な悪性腫瘍であり、2019年だけで米国で40,000人の女性死亡と新しい女性癌診断の30%を占めています。乳癌関連死の主な原因は転移性負担である。したがって、乳癌の前臨床モデルは、臨床的に関連する転移性負担を分析する必要があります。4T1乳癌モデルはステージIVのヒト乳癌のための自然転移、定量化可能なマウスモデルを提供する。しかし、ほとんどの4T1プロトコルは、組織培養プレート上の染色されたコロニーを手動でカウントすることによって、転移性負担を定量化する。これは転移負担の少ない組織では十分ですが、手動カウントの人為的ミスは、プレートがコンフルでカウントが困難な場合に矛盾した可変結果を引き起こします。この方法は、人間のカウントエラーに対するコンピュータベースのソリューションを提供します。ここでは、4T1モデルにおける転移性の高い組織である肺を用いてプロトコルを評価する。フィジー-ImageJで分析のためにメチレンブルー染色プレートの画像を取得し、アップロードします。フィジー-ImageJは、画像の選択された領域の青の割合を、転移性負担を持つプレートの割合を表す割合を決定します。このコンピュータベースのアプローチは、転移性の高い組織に対する手動カウントや組織病理学的評価よりも、より一貫した迅速な結果を提供します。フィジー-ImageJの結果の一貫性は、画像の品質に依存します。画像間の結果のわずかな変化が発生する可能性があるため、複数の画像を撮影し、結果を平均化することをお勧めします。その制限は最小限に抑え、この方法は、一貫した迅速な結果を提供することにより、肺の転移性負担を定量化するための改善である。

この方法には、プラスキおよびオストランド-ローゼンバーグ 4T1 プロトコル3からの簡単な調整が含まれ、図 1に表示できます。3人の別々の研究者が12個の肺プレート(1:10希釈)の転移コロニーを手動で数えた場合、結果は異なるカウンター間で非常に矛盾していた(図2A)。研究者は全員「青い点として現れる転移性コロニーを数える...

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Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

我々は、フィジー-ImageJを用いて4T1乳癌モデルにおける肺転移を定量化するためのより一貫した迅速な方法を記述する。

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

このプロトコルは、前臨床乳癌モデルにおける精度と効率の向上により、乳癌関連死の積極的かつ一般的な原因である肺転移を定量化する。元の技術と比較して、このプロトコルは研究者により速く、より一貫した結果を与える。使いやすいコンピュータ技術により、人数の誤りを軽減します。この技術は、研究者が治療に成功した後に転移負担の減少を実証できるようにすることで、乳癌療法が肺転移に及ぼす影響を研究する前臨床研究に絶対に拡張することができる。まず、組織サンプル用の15ミリリットル円錐形チューブにラベルを付けます。その後、4種類のコラゲターゼ混合物の2.5ミリリットルとエラスターゼの30単位をチューブに加えます。肺をきれいな1X HBSSウェルに移動し、鉗子で渦巻いて残りの血液を取り除き、空の3.5センチメートルの組織培養プレートに移します。はさみで肺をミンチし、HBSSの2.5ミリリットルでプレートをすすい、コラゲナーゼとエラスターゼカクテルで準備された15ミリリットルの円錐形チューブに肺片でHBSSを移します。ロッカーまたは回転ホイールで摂氏4度で75分間チューブをインキュベートします。一方、1つのマウスに対して50ミリリットルの遠心管と1つの10センチメートルの組織培養プレートにラベルを付ける。希釈を行う場合は、希釈のための十分な組織培養プレートをラベル付けします。1X HBSSでチューブの体積を最大10ミリリットルにし、70マイクロメートルのセルストレーナーの上に内容物を50ミリリットルの円錐チューブに注ぎます。1ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーを通してサンプルを軽く粉砕します。チューブを350倍Gで5分間遠心し、上清を捨て、10ミリリットルの1X HBSSでペレットを2回洗浄する。ペレットを60マイクロモル6-チオグアニン完全培養培地の10ミリリットルに再懸濁し、必要に応じて希釈スキームを使用して10センチメートルの細胞培養プレートにサンプルをプレートします。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%5%で5日間インキュベートします。適切な廃棄物容器にプレートから培養培地を注ぎます。細胞を固定するには、希釈されていないメタノールを5ミリリットルずつ各プレートに加え、室温で5分間インキュベートし、プレート全体を覆えるようにメタノールを旋回させます。プレートから適切な廃棄物容器にメタノールを注ぎ、各プレートを5ミリリットルの蒸留水ですすぎます。1皿あたり0.03%メチレンブルーの5ミリリットルを加え、室温で5分間インキュベートし、メチレンブルー溶液を回転させ、プレート全体を覆います。適切な廃棄物容器にメチレンブルーを注ぎ、蒸留水を5ミリリットルで再び各プレートをすすいだ。プレートを逆さまにし、余分な液体を取り除くためにペーパータオルにスロを入れます。蓋の上にプレートを置き、一晩空気を乾燥させます。転移性コロニーは青色になります。プレートが乾燥したら、室温で無期限に保存することができます。ラベル付きの蓋をプレートから取り外し、サンプルの識別を明確にするように注意してください。きれいな、軽い表面にすべての染色された肺の版を並べます。明るい領域にプレートのコレクションの写真を撮り、反射を最小限に抑えます。プレート内の反射は画像解析に影響を与え、避ける必要があります。撮影した写真に細心の注意を払い、いくつかの角度からいくつかの写真を撮ります。プレートを撮影した後、背景に蓋や何かを除外するために画像をトリミングします。フィジー ImageJ で画像を開き、画像、調整、および色のしきい値をクリックして白黒に変更します。次に、しきい値の方法に既定を選択し、しきい値の色には白黒、色空間のラボを選択します。暗い背景ボックスが選択されていないかどうかを確認します。イメージは白黒になります。黒は明るい背景を表し、白は青い転移性コロニーを表します。円ツールを使用して、解析する領域を選択します。すべてのプレートに使用する円を 1 つ描き、各プレートが同じサイズの領域で確実に分析されるようにします。プレートのエッジに表示されるバックグラウンドノイズを最小限に抑えながら、プレート上の解析領域を最大化するサイズを選択します。サイズは、描画時にツールバーに表示されます。選択した円を分析して、白い領域の割合を決定します。パーティクルをクリックして解析し、サイズとして 0 から無限大、円形の場合は 0 から 1、表示には何も選択しません。要約ボックスをチェックし、大丈夫ヒット。中央に移動して、写真の次のプレートに円を移動し、解析を繰り返します。結果をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。選択した領域の白い割合であるパーセント領域は、転移性の負担を表します。すべてのプレートとイメージを分析したら、各プレートの異なる画像間の面積の結果の割合を平均して、画像間の不一致を軽減します。フィジー ImageJ 分析は、手動カウントおよび病理組織学的分析と比較されました。3人の別々の研究者が手動で転移性コロニーを数えた場合、結果はカウンター間で矛盾していた。フィジー ImageJ の結果は、3 つのイメージの各カウンター間で一貫していました。3つの画像と3つのカウンターの結果を各肺プレートに合わせた。結果は、カウンター間で一貫した結果を提供し、画像間の変動を考慮するために、各プレートの平均化されました。ほとんどの転移性から最も少ない転移性のプレートにプレートをランク付けすると、手動カウントは最もコンフルエントプレートに同意しましたが、次のすべてのランクは矛盾していました。平均的なフィジー ImageJ の結果からのランクは、カウンター間ではるかに一貫していました。画像内の反射を避けることの重要性を示すために、手の反射とその後のフィジーImageJ分析を持つ画像が、反射のない同じプレートの画像と共に示されています。汚れた背景表面からの暗い傷やプレート上の血液サンプル残渣もフィジーImageJ分析に悪影響を与える可能性があります。この血板は2つの転移コロニーしか持たなかったが、暗い残留物はフィジーImageJがそれを31.6%転移と考える原因となった。このプロトコルを試みるときは、反射のために画像を注意深く調べ、画像の各プレートに同じサイズの円を使用し、少なくとも3つの別々の画像の間で各プレートの結果を平均することを忘れないでください。

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