Name: using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00
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이 작품은 버지니아 -메릴랜드 수의과 대학 (IA), 엔지니어링 건강을위한 중요한 기술 및 응용 과학 센터 (IA), 및 건강 R21EB028429 (IA)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

여기에 설명된 모든 방법은 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 치료 및 사용을위한 국립 보건 가이드에 따라 승인되었습니다. 이 프로토콜을 수행하려면 적절한 기관의 허가와 모든 적절한 지침을 준수해야 합니다.
1. 세포 배양
<ol><li>완전한 문화 매체를 만듭니다 (RPMI + 10 % 태아 소 혈청 +1 % 펜 스트렙). ATCC<sup class="xre...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Facts+&amp;+Figures.">Cancer Facts &amp; Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li><li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer:+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis.">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines.">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li><li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools.">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).</li><li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests.">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li><li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression.">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.T.C.C.+4T1+(ATCC+CRL2539)+Product+Sheet.">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li></ol>

입증된 바와 같이, 각 폐 판상에 전이성 콜로니를 수동으로 세는 것은 폐 전이를 정량화하는 부정확하고 부정확한 방법이 될 수 있으며, 더 나은 정량화 수단에 대한 필요성을 입증할 수있다(도 2). 히스토병학적 분석은 H&E 슬라이드가 전체 장기의 대표적인 샘플이 아니기 때문에 수동 계수와 피지-ImageJ분석(그림 2B 및 4D)과약간 차이가 있었...

8명의 여자에 대하여 1개는 그녀의 일생에 있는 유방암으로 진단될 것입니다, 그러나 다중 처리 선택권에도 불구하고 유방암은 미국 여자에 있는 암 관련 죽음의 두 번째 주요한 원인입니다 1. 이 여자는 그들의 유방에 있는 1 차적인 종양에서 정지하지 않습니다. 대신, 전이성 부담은 일반적으로 폐, 뼈, 두뇌, 간 및 림프절2로퍼지기 때문에 이 질병의 사망에 책임 있습니다. 이 때문에 유방암 모델은 이 질병의 사망률을 억제하는 데 기여하기 위해 전이를 평가해야합니다. 4T1 뮤린 유방암 모델은 이를 달성하기 위한 훌륭한 프로토콜입니다. 여기에 설명된 방법은 피지-ImageJ를 사용하여 폐 전이를 정량화하여 일관되고 신속한 결과를 생성함으로써 4T1 모델에 대한 개선을 제공합니다.
4T1 모델은 잘 확립되어 있으며, 대부분의 실험실은 2001년 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그가 설명한 프로토콜과 같은 프로토콜을 사용합니다. 4T1 세포주6-티오구아닌(6TG)은 내성 및 단계 IV, 삼중 음성 유방암3,4,5의대표이다. 그것은 정형 소 모델이며 인간 유방암3,4에서와같은 장기에 자발적으로 전이되기 때문에 임상적으로 관련이 있다. 4T1 세포는 주입된 세포의 양에 기초하여 예측 가능한 속도로 자발적으로 전이3,4. 중요한 것은, 여기에서 사용된 마우스 사이 유전다름은 전이성 부담에 있는 예상된 개별 간 가변성을 일으키는 원인이 되었습니다. 전이를 평가하기 위해, 조직은 6TG 선택 및 메틸렌 블루 스테인링을 사용하여 먼 부위의 암세포를 수집하고 정량화하기 위해 수확됩니다. 그 결과 전이성 식민지를 나타내는 파란색 점이 있는 조직 배양 판의 컬렉션이 생성됩니다. 그러나 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그 프로토콜은 이를 수동으로 계산하여 전이성 식민지를 정량화하므로 이 모델에서 전이를 평가하는 표준 수단이 되었습니다. 이것은 낮은 전이성 부담을 가진 조직에 대 한 쉬운, 폐 같은 조직은 종종 전이와 함께 라덴. 폐 판은 매우 수렴 될 수 있기 때문에 수동 계수로 전이성 식민지를 정확하고 정확하게 정량화하기가 어렵고 인간의 실수가 발생하기 쉽습니다. 전이성 부담을 더 잘 정량화하기 위해 피지-ImageJ를 사용하여 인간 카운팅 오류에 대한 컴퓨터 기반 솔루션을 설명합니다. 혈종실린및 에오신(H&E) 염색을 통해 조직병리학적 분석은 폐 전이를 정량화하는 또 다른 수단이며, 흥미롭게도 피지-ImageJ 소프트웨어6,7로개선되었다. 그러나, 조직 병리학 적 분석은 폐의 단일 조각을 관찰하기 때문에, 그것은 부정확하고 대표적이지 않을 수 있습니다. 이는 4T1 모델이 고르게 분포되지 않는 장기 전체에 여러 전이성 병변을 일으키기 때문이다. 조직 병리학 적 분석과 수동 계수 사이의 전반적인 추세는 유사 할 수 있지만8,개별 값은 다를 수 있으므로 조직 병리학 분석은 정량화의 유일한 수단으로 사용되어서는 안됩니다. 우리는 조직 병리학 적 분석과 다른 카운터 사이의 수동 계산의 불일치에 비해 이점을 입증하면서 피지 -ImageJ를 사용하는 일관성을 보여줍니다. 또한, 우리는이 방법은 수동 계산에 의존 할 때보다 훨씬 빨리 자신의 연구에서 데이터를 분석 할 수 있다는 것을 의미 10-14 일에서 5 일로 잠복기 시간을 줄일 수 있음을 보여줍니다.
이 방법은 풀라스키 및 오스트랜드-로젠버그 프로토콜3에대한 간단한 조정 모음입니다. 4T1 모델은 널리 사용되고 폐 전이가 전임상 모델에서 측정하는 중요한 매개 변수이기 때문에, 우리는 이 방법이 널리 사용될 수 있고 유방암 연구자에 매우 가치가 있다고 믿습니다. 필요한 유일한 추가 소모품은 카메라와 피지-ImageJ와 컴퓨터에 대 한 액세스, 이미지 분석에 자주 사용 하는 무료 소프트웨어9. 이 방법은 특히 폐 전이에 초점을 맞추고 있지만, 상당한 전이성 부담을 가진 다른 조직에 사용될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic agent</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Female Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Minimum of 8 megapixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of 125 x g and 300 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 euthanasia setup</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold room, refrigerator, cold storage</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with Fiji-ImageJ</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of running Fiji-ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Needs to be capable of 5% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03978-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins or needles</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>For pinning down mice during necropsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic calipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25729-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker or rotating wheel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable filter with PES membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>568-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-cornered plastic beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td>Used to weigh mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm tissue culture plates</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3026802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 g 1/2 in needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 (ATCC&#174; CRL&#173;2539&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Thioguanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Dilute to 70% with DI water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model

유방암은 2019년에만 미국에서 40,000명의 여성 사망과 30%의 새로운 여성 암 진단을 차지하는 파괴적인 악성 종양입니다. 유방암 관련 죽음의 주요 원인은 전이성 부담입니다. 따라서 유방암을 위한 전임상 모델은 전이성 부담을 임상적으로 관련시키기 위해 분석할 필요가 있다. 4T1 유방암 모델은 단계 IV 인간 유방암을 위한 자발적으로 전이되고 정량화 가능한 마우스 모델을 제공합니다. 그러나, 대부분의 4T1 프로토콜은 조직 배양 판에 스테인드 콜로니를 수동으로 계수함으로써 전이성 부담을 정량화한다. 이는 전이성 부담이 낮은 조직에 충분하지만 수동 계산의 인간의 오류는 플레이트가 혼잡하고 계산하기 어려운 경우 일관성이 없고 가변적인 결과를 초래합니다. 이 방법은 인간 계수 오류에 대한 컴퓨터 기반 솔루션을 제공합니다. 여기서, 우리는 4T1 모델에서 고전이성 조직인 폐를 이용한 프로토콜을 평가한다. 피지-ImageJ에서 분석을 위해 메틸렌 블루 스테인드 플레이트의 이미지를 획득하여 업로드합니다. 피지-ImageJ는 전이성 부담이 있는 플레이트의 백분율을 나타내는 파란색 이미지의 선택된 영역의 백분율을 결정합니다. 이 컴퓨터 기반 접근 방식은 고전이성 조직에 대한 수동 계수 또는 조직 병리학 평가보다 더 일관되고 신속한 결과를 제공합니다. 피지-ImageJ 결과의 일관성은 이미지의 품질에 따라 달라집니다. 이미지 간의 결과에 약간의 변화가 발생할 수 있으므로 여러 이미지를 촬영하고 결과를 평균화하는 것이 좋습니다. 최소한의 한계에도 불구하고,이 방법은 일관되고 신속한 결과를 제공함으로써 폐의 전이성 부담을 정량화하는 개선입니다.

이 방법은 풀라스키 및 오스트랜드-로젠버그 4T1 프로토콜3에서 간단한 조정을 포함하고 그림 1에서시각화할 수 있다. 3명의 별도 연구원이 12개의 폐판(1:10 희석)에 대해 수동으로 전이성 콜로니를 계산했을 때, 결과는 다른카운터(그림 2A)간에매우 일치하지 않았다. 모든 연구자들은 "푸른 점으로 나타나는 전이성 식민지를 계산"하도?...

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Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

우리는 피지-ImageJ를 사용하여 4T1 유방암 모델에서 폐 전이를 정량화하는 보다 일관되고 신속한 방법을 설명합니다.

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

이 프로토콜은 전임상 유방암 모델에서 정밀도와 효율성을 증가, 유방암 관련 죽음의 공격적이고 일반적인 원인인 폐 전이를 정량화합니다. 원래 기술에 비해,이 프로토콜은 연구원에게 더 빠르고 일관된 결과를 제공합니다. 사용하기 쉬운 컴퓨터 기술을 통해 사람의 계산 오류를 완화합니다.이 기술은 연구원이 성공적인 처리 다음 감소 전이성 부담을 입증하는 것을 허용해서 폐 전이에 유방암 치료의 효력을 연구하는 전임상 연구로 절대적으로 확장될 수 있습니다. 조직 샘플을 위해 15 밀리리터 원원튜브를 라벨링하여 시작합니다. 그런 다음 4형 콜라게나아제 혼합물의 2.5밀리리터와 30단위의 엘라스타아제를 튜브에 첨가한다.깨끗한 1X HBSS로 폐를 잘 이동시키고 남은 혈액을 제거하기 위해 집게로 소용돌이치고 빈 3.5 센티미터 조직 배양 판으로 옮춥시다. 가위로 폐를 다진 다음, HBSS2.5 밀리리터로 플레이트를 헹구고 폐 조각으로 HBSS를 콜라게나아제와 엘라스타제 칵테일로 준비된 15 밀리리터 원뿔 튜브로 옮습니다. 로커 또는 회전 휠에서 섭씨 4도에서 75분 동안 튜브를 배양합니다.한편, 각 마우스에 대해 50밀리리터 원심분리기 튜브와 10센티미터 조직 배양 플레이트 1개를 라벨로 지정합니다. 희석을 하는 경우 희석을 위해 충분한 조직 배양 판을 라벨로 지정합니다. 1X HBSS로 튜브의 부피를 최대 10 밀리리터로 가져온 다음 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원유형 튜브에 내용물을 붓습니다.1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 샘플을 부드럽게 갈아냅니다. 350회 G에서 5분간 튜브를 원심분리하고 상류제를 폐기한 다음 1X HBSS 10밀리리터로 펠릿을 두 번 세척합니다. 펠릿을 60 마이크로몰라 6-티오구아닌 완전 배양 배지의 10밀리리터로 재보중단하고, 원하는 경우 희석 체계를 이용하여 10cm 세포 배양판에서 샘플을 플레이트한다.5일 동안 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 접시에서 배양 미디어를 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 세포를 고치려면 각 플레이트에 희석되지 않은 메탄올 5밀리리터를 넣고 실온에서 5분 동안 배양하여 메탄올전체를 덮도록 합니다.메탄올을 접시에서 적절한 폐기물 용기에 붓고 각 접시에 증류수 5밀리리터로 헹구습니다. 플레이트당 0.03%의 메틸렌 블루 5밀리리터를 추가하고 실온에서 5분간 배양하여 메틸렌 블루 용액을 소용돌이시켜 전체 플레이트를 덮습니다. 메틸렌 블루를 적절한 폐기물 용기에 붓고 5밀리리터의 증류수로 각 접시를 다시 헹구십시오.접시를 거꾸로 뒤집어 종이 타월에 얼룩을 두어 여분의 액체를 제거합니다. 접시를 뚜껑에 놓고 밤새 공기를 건조시키십시오. 전이성 식민지는 파란색이 될 것입니다.플레이트가 건조되면 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다. 샘플의 명확한 식별을 보장하기 위해 주의, 플레이트에서 라벨 된 뚜껑을 제거합니다. 깨끗하고 밝은 표면에 얼룩진 모든 폐 판을 정렬합니다.조명이 잘 된 공간에서 플레이트 컬렉션을 촬영하여 반사를 최소화하십시오. 플레이트의 반사는 이미지 분석에 영향을 미치며 피해야 합니다. 찍은 사진에 주의를 기울이고 여러 각도에서 여러 장의 사진을 찍습니다.플레이트를 촬영한 후 이미지를 자르면 뚜껑이나 백그라운드에서 아무것도 제외합니다. 피지 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지를 클릭하여 흑백으로 변경, 조정 및 색상 임계값. 그런 다음 임계값 에 대한 기본값, 임계값 색상에 대한 흑백 및 색상 공간에 대한 랩을 선택합니다.어두운 배경 상자가 선택되지 않았는지 확인합니다. 이제 이미지가 흑백이어야 합니다. 검은색은 밝은 배경을 나타내고 흰색은 파란색 전이성 콜로니를 나타냅니다.원 도구를 사용하여 분석할 영역을 선택합니다. 각 플레이트가 동일한 크기의 영역에 대해 분석되도록 모든 플레이트에 사용할 원 1개를 그립니다. 플레이트 가장자리에 나타나는 배경 잡음을 최소화하면서 플레이트의 분석 영역을 최대화하는 크기를 선택합니다.크기가 그릴 때 도구 모음에 나타납니다. 선택한 원을 분석하여 흰색 영역의 백분율을 결정합니다. 파티클을 분석하고 분석한 다음 크기에 대해 0에서 무한대로, 원형에 대해 0에서 1로 선택하고 표시할 수 없습니다.요약 된 상자를 확인하고 괜찮아. 원을 중앙에 잡고 해석을 반복하여 그림의 다음 플레이트로 이동합니다. 결과를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.선택한 영역의 백분율인 백분율 영역은 전이성 부담을 나타냅니다. 모든 플레이트와 이미지를 분석한 결과 각 플레이트의 서로 다른 이미지 간의 백분율 영역 결과를 평균하여 사진 간의 불일치를 완화합니다. 피지 ImageJ 분석은 수동 계수 및 조직 병리학 적 분석과 비교되었다.3명의 개별 연구원이 수동으로 전이성 식민지를 계산했을 때, 결과는 카운터 사이에서 일치하지 않았습니다. 피지 ImageJ 결과는 세 이미지 각각에 대한 카운터 사이에 일관성이 있었다. 3개의 심상및 3개의 카운터에서 결과는 각 폐 판에 대해 결합되었습니다.결과는 카운터 사이의 일관된 결과를 제공하는 이미지 사이의 변형을 설명하기 위해 각 플레이트에 대해 평균화되었습니다. 대부분의 전이성에서 가장 적은 전이성까지 플레이트를 순위를 매길 때 수동 계산은 가장 혼잡한 플레이트에 동의했지만 다음 순위는 모두 일치하지 않았습니다. 평균 피지 ImageJ 결과에서 순위는 카운터 사이 훨씬 더 일관성 했다.이미지의 반사를 피하는 것의 중요성을 입증하기 위해 손의 반사와 후속 피지 ImageJ 분석이 반사되지 않은 동일한 플레이트의 이미지와 함께 표시됩니다. 더러운 배경 표면이나 플레이트의 혈액 샘플 잔류물에서 어두운 결점이 피지 ImageJ 분석에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 혈액 판은 두 개의 전이성 식민지를 가지고 있지만 어두운 잔류물은 피지 ImageJ가 31.6 %의 전이성으로 간주하게했습니다.이 프로토콜을 시도할 때는 반사를 위해 사진을 주의 깊게 검사하고, 이미지의 각 플레이트에 대해 동일한 크기의 원을 사용하고, 각 플레이트의 결과를 적어도 세 개의 개별 이미지 간에 평균화해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

연구

암 연구학

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...