Name: using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology och Applied Science Center for Engineered Health (IA), och National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) av Virginia Tech och i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur. För att utföra detta protokoll krävs tillstånd från lämpliga institutioner och anslutning till alla lämpliga riktlinjer.
1. Cellodling
<ol><li>Gör komplett kultur media (RPMI + 10% Fetala Bovin Serum +1% Pen Strep). Återuppliva 4T1-celler enligt ATCC-protokoll<s...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Facts+&amp;+Figures.">Cancer Facts &amp; Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li><li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer:+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis.">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+4T1+breast+tumor+model.">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines.">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li><li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools.">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).</li><li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests.">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li><li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression.">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.T.C.C.+4T1+(ATCC+CRL2539)+Product+Sheet.">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li></ol>

Som visats, manuellt räkna de metastaserande kolonierna på varje lungplatta kan vara en felaktig och oprecis metod för att kvantifiera lung metastasering, vilket visar behovet av ett bättre medel för kvantifiering (Figur 2). Histopatologisk analys skilde sig något från både manuell räkning och Fiji-ImageJ-analys (Figur 2B och 4D), sannolikt eftersom H&E-objektsglasen inte är ett representativt prov av hela organet. Protokollet skördar...

En av åtta kvinnor kommer att diagnostiseras med bröstcancer under sin livstid, och ändå trots flera behandlingsalternativ bröstcancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall hos amerikanska kvinnor1. Dessa kvinnor dör inte av den primära tumören i bröstet. Istället, den metastaserande bördan är ansvarig för dödligheten i denna sjukdom som det vanligen sprider sig till lunga, ben, hjärna, lever, och lymfkörtlar2. På grund av detta, bröstcancer modeller måste utvärdera metastasering att bidra till att bromsa dödligheten i denna sjukdom. Den 4T1 murine bröstcancer modell är ett utmärkt protokoll för att åstadkomma detta. Den metod som beskrivs här erbjuder en förbättring av 4T1-modellen genom att använda Fiji-ImageJ för att kvantifiera lung metastasering, producera konsekvent och snabba resultat.
4T1-modellen är väletablerad, där de flesta labb använder protokoll som de som beskrivs av Pulaski och Ostrand-Rosenberg 20013. Den 4T1 cellinje är 6-Thioguanine (6TG) resistenta och representativa för steg IV, trippel negativ bröstcancer3,4,5. Det är kliniskt relevant eftersom det är en ortopisk modell och spontant metastasizes till samma organ som i mänskliga bröstcancer3,4. 4T1-cellerna metastaserar spontant i en förutsägbar takt baserat på mängden celler som injiceras3,4. Viktigt, genetiska skillnader mellan möss som används här orsakade förväntade inter-individuella variationer i metastaserande börda. För att utvärdera metastasering, vävnader skördas för att samla in och kvantifiera cancerceller i avlägsna platser med hjälp av 6TG urval och metylenblått färgning. Resultatet är en samling vävnadskulturplattor med blå prickar som representerar metastaserande kolonier. Däremot kvantifierar Pulaski- och Ostrand-Rosenberg-protokollet metastatiska kolonier genom att manuellt räkna dem, och därför har detta varit standardmedlet för att utvärdera metastasering i denna modell. Även om detta är lätt för vävnader med låg metastaserande börda, vävnader som lungorna är ofta lastad med metastaser. Som lungplattor kan vara mycket sammanflytande, exakt och exakt kvantifiera ögonbevarande kolonier genom manuell räkning är svårt och benägna att mänskliga fel. För att bättre kvantifiera metastatisk börda, beskriver vi med fijianska-ImageJ för en datorbaserad lösning på mänskliga räkna fel. Histopatologisk analys med hematoxylin och eosin (H&E) färgning är ett annat medel för att kvantifiera lung metastaser, och intressant har också förbättrats med Fiji-ImageJ programvara6,7. Men eftersom histopatologisk analys observerar en enda del av lungan, kan det vara felaktiga och icke-representativa. Detta beror på att 4T1-modellen orsakar flera ögonbevarande skador i hela organet som inte är jämnt fördelade. Medan övergripande trender mellan histopatologisk analys och manuell räkning kan vara liknande8, kan enskilda värden skilja sig åt och därför bör inte histopatologisk analys användas som enda medel för kvantifiering. Vi visar nyttan jämfört med histopatologisk analys och inkonsekvenserna i manuell räkning mellan olika räknare, samtidigt som vi visar på konsekvensen i att använda Fiji-ImageJ. Dessutom visar vi att denna metod kan minska inkubationstiden från 10-14 dagar till 5 dagar, vilket innebär att forskare kan analysera data från sina studier mycket tidigare än när de förlitar sig på manuell räkning.
Denna metod är en samling enkla justeringar av Pulaski och Ostrand-Rosenbergsprotokoll3. Eftersom 4T1-modellen används i stor utsträckning, och eftersom lungmetastas är en kritisk parameter att mäta i prekliniska modeller, tror vi att denna metod kan användas i stor utsträckning och är mycket värdefull för bröstcancerforskare. Den enda ytterligare leveranser som behövs är en kamera och tillgång till en dator med Fiji-ImageJ, en fri programvara som används ofta i bildanalys9. Denna metod fokuserar specifikt på lung metastasering, men det skulle kunna användas för andra vävnader med betydande metastaserande börda.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic agent</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c Female Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Minimum of 8 megapixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of 125 x g and 300 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 euthanasia setup</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Use approved materials in your institution&#39;s policies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold room, refrigerator, cold storage</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer with Fiji-ImageJ</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Needs to be capable of running Fiji-ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>See comments</td>
			<td>See comments</td>
			<td>Needs to be capable of 5% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03978-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pins or needles</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>For pinning down mice during necropsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic calipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25729-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMPI-1640 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker or rotating wheel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposable filter with PES membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>568-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-126-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-cornered plastic beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td>Used to weigh mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type IV collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cm tissue culture plates</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30028FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3026802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 g 1/2 in needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 (ATCC&#174; CRL&#173;2539&#8482;)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Thioguanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>Dilute to 70% with DI water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using computer-based image analysis to improve quantification of lung metastasis in the 4t1 breast cancer model

Bröstcancer är en förödande malignitet, står för 40.000 kvinnliga dödsfall och 30% av nya kvinnliga cancerdiagnoser i USA bara under 2019. Den främsta orsaken till bröstcancer relaterade dödsfall är den metastaserande bördan. Därför prekliniska modeller för bröstcancer behöver analysera metastaserande börda vara kliniskt relevant. 4T1 bröstcancer modellen ger en spontant-metastaserande, kvantifierbara mus modell för steg IV mänskliga bröstcancer. De flesta 4T1-protokoll kvantifierar dock den metastaserande bördan genom att manuellt räkna färgade kolonier på vävnadskulturplattor. Medan detta är tillräckligt för vävnader med lägre ögonbevarande börda, mänskliga fel i manuell räkning orsakar inkonsekvent och varierande resultat när plattorna är konfluenta och svåra att räkna. Den här metoden erbjuder en datorbaserad lösning på fel i mänskligt räknefel. Här utvärderar vi protokollet med hjälp av lungan, en mycket metastaserande vävnad i 4T1-modellen. Bilder av metylenblå-färgade plattor förvärvas och laddas upp för analys i Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bestämmer sedan procentandelen av det markerade området i bilden som är blått, vilket representerar den procentuella andelen av plattan med metastaserande börda. Denna datorbaserade metod erbjuder mer konsekventa och snabbt resultat än manuell räkning eller histopatologisk utvärdering för mycket metastaserande vävnader. Konsekvensen av Fiji-ImageJ resultat beror på kvaliteten på bilden. Små variationer i resultat mellan bilderna kan förekomma, alltså rekommenderas att flera bilder tas och resultat i genomsnitt. Trots dess minimala begränsningar, denna metod är en förbättring av kvantifiera ögonbevarande börda i lungan genom att erbjuda konsekvent och snabba resultat.

Denna metod innehåller enkla justeringar från protokollet Pulaski och Ostrand-Rosenberg 4T13 och kan visualiseras i figur 1. När 3 separata forskare manuellt räknade metastaserade kolonier för 12 lungplattor (1:10 utspädning) var resultaten mycket inkonsekventa mellan olika räknare (Figur 2A). Alla forskare var riktade att "räkna de metastaserande kolonierna som visas som blå prickar", men inkonsekvenserna visar problemet med att...

Watch this Scientific Journal Video about Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model at JoVE.com

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Vi beskriver en mer konsekvent och snabb metod för att kvantifiera lungcancer metastasering i 4T1 bröstcancer modellen genom att använda fijianska-ImageJ.

Använda datorbaserad bildanalys för att förbättra kvantifiering av lung metastasering i 4T1 Bröstcancermodellen

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Detta protokoll kvantifierar lung metastasering, som är en aggressiv och vanlig orsak till bröstcancer relaterade död, med ökad precision och effektivitet i en preklinisk bröstcancer modell. Jämfört med den ursprungliga tekniken ger detta protokoll forskarna snabbare, mer konsekventa resultat. Det lindrar mänskliga räkna fel genom lätt att använda datorteknik.Denna teknik kan absolut utvidgas till preklinisk forskning som studerar effekterna av bröstcancerterapier på lungmetastas genom att forskare kan visa minskad metastaserande börda efter framgångsrik behandling. Börja med att märka ett 15 milliliter koniskt rör för vävnadsprovet. Tillsätt sedan 2,5 milliliter av typ fyra kollagenasblandning och 30 enheter av elastase till röret.Flytta lungan till en ren 1X HBSS väl och snurra den med tuten för att ta bort eventuellt kvarvarande blod, överför den sedan till en tom 3,5 centimeter vävnad kulturplatta. Finhacka lungan med sax, skölj sedan plattan med 2,5 milliliter HBSS och överför HBSS med lungbitarna till ett förberett koniskt rör på 15 milliliter med kollagenas- och elastascocktailen. Inkubera röret i 75 minuter vid fyra grader Celsius på en vipp eller roterande hjul.Under tiden, etikett en 50 milliliter centrifugera röret och en 10 centimeter vävnad kulturplatta för varje mus. Om du gör en utspädning, märka tillräckligt med vävnadskulturplattor för spädningarna. Ta upp rörets volym till 10 milliliter med 1X HBSS, häll sedan innehållet över en 70 mikrometercellsil i det 50 milliliter koniska röret.Använd kolven på en en milliliterspruta för att försiktigt mala provet genom silen. Centrifugera röret i fem minuter vid 350 gånger G och kassera supernatanten, tvätta sedan pelleten två gånger med 10 milliliter 1X HBSS. Resuspend pelleten i 10 milliliter av 60 mikromolar 6-tioguanin komplett odlingsmedia, och platta proverna i 10 centimeter cell odlingsplattor med hjälp av en utspädningsschema om så önskas.Inkubera plattorna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i fem dagar. Häll odlingsmedia bort av plattorna i lämplig avfallsbehållare. För att fixera cellerna, tillsätt fem milliliter outspädd metanol till varje platta och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur, se till att snurra metanol så att den täcker hela plattan.Häll av metanol från plattorna i lämplig avfallsbehållare, skölj sedan varje platta med fem milliliter destillerat vatten. Tillsätt fem milliliter på 0,03% metylenblått per platta och inkubera den i fem minuter i rumstemperatur, se till att snurra metylenblått lösningen så att den täcker hela plattan. Häll metylenblått i lämplig avfallsbehållare och skölj varje platta igen med fem milliliter destillerat vatten.Vänd plattan upp och ner och blot den mot en pappershandduk för att avlägsna överflödig vätska. Placera plattan på locket och låt den lufttorka över natten. Metastatiska kolonier kommer att vara blå.När plattorna har torkat kan de förvaras i rumstemperatur på obestämd tid. Ta bort de märkta locken från plattorna, var försiktig för att säkerställa tydlig identifiering av proverna. Rada upp alla färgade lungplattor på en ren, lätt yta.Ta en bild av samlingen av plattor i ett väl upplyst område, se till att minimera reflektioner. Reflektioner i plattorna kommer att påverka bildanalys och bör undvikas. Var uppmärksam på de fotografier som tagits, och ta flera bilder från flera vinklar.Efter fotografering av plattorna, beskär bilden för att utesluta locken eller något i bakgrunden. Öppna bilden i Fiji ImageJ och ändra den till svartvitt genom att klicka på bild, justera och färgtröskel. Välj sedan standard för thresholding-metoden, svartvitt för tröskelfärg och labb för färgrymd.Kontrollera att rutan för mörk bakgrund inte är markerad. Bilden ska nu vara svartvit. Svart representerar den ljusa bakgrunden, och vitt representerar de blå metastaserade kolonierna.Använd cirkelverktyget för att välja det område som ska analyseras. Rita en cirkel att använda för alla plattor för att säkerställa att varje platta analyseras för samma storlek område. Välj en storlek som maximerar det analyserade området på plattorna samtidigt som du minimerar bakgrundsljudet som visas på plattornas kant.Storleken visas i verktygsfältet när den ritas. Analysera den valda cirkeln för att bestämma hur stor procent av området som är vitt. Klicka på analysera och analysera partiklar, välj sedan noll till oändlighet för storlek, noll till en för cirkuläritet, och ingenting för show.Kolla den sammanfattade rutan och slå okej. Flytta cirkeln till nästa platta på bilden genom att ta tag i den i mitten och upprepa analysen. Kopiera och klistra in resultatet i ett kalkylblad.Procentområdet, som är procentandelen av det markerade området som är vitt, representerar den metastaserande bördan. När alla plattor och bilder har analyserats, genomsnitt procentytan resultat mellan olika bilder för varje platta för att mildra eventuella inkonsekvenser mellan bilder. Fiji ImageJ analys jämfördes med manuell räkning och histopatologisk analys.När tre separata forskare manuellt räknade metastaserande kolonier var resultaten inkonsekventa mellan räknarna. Fiji ImageJ resultaten var konsekvent mellan räknare för var och en av de tre bilderna. Resultaten från de tre bilderna och de tre räknarna kombinerades för varje lungplatta.Resultaten var i genomsnitt för varje platta för att ta hänsyn till variationerna mellan bilderna, vilket gav konsekventa resultat mellan räknarna. När ranking plattorna från de flesta till minst ögonbevarande, manuell räkna överens om den mest konfluenta plattan men alla följande led var inkonsekvent. Leden från den genomsnittliga Fiji ImageJ resultat var mycket mer konsekvent mellan räknare.För att visa vikten av att undvika reflektioner i bilderna visas en bild med reflektion av en hand och dess efterföljande Fiji ImageJ-analys tillsammans med en bild av samma platta utan reflektion. Mörka fläckar från en smutsig bakgrundsyta eller ett blodprovsrester på plattorna kan också påverka Fiji ImageJ-analysen negativt. Denna blodplatta har bara två metastaserande kolonier men de mörka rester orsakade Fiji ImageJ att betrakta det som 31,6%metastaserande.När du försöker detta protokoll, kom ihåg att noggrant undersöka bilder för eftertanke, använda samma storlek cirkel för varje platta i bilden, och medelvärde resultaten för varje platta mellan minst tre separata bilder.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliaca Injection för effektiv och selektiv Modellering av Mikroskopisk skelettmetastaser

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Advanced djurmodell av Colorectal metastas i Lever: avbildningsmetoder och egenskaper av metastaserande kloner

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

En portådern Injection modell för att studera levermetastaser av bröstcancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiska överväganden studera metastaserande lungcancer kolonisationen i osteosarkom med pulmonell metastas-analys

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellulärt och cellulära Lung modell att studera tumör metastasering

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studera Triple negativ bröstcancer med ortopotopic bröstcancer modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Modellering av bröstcancer i bröstvävnad hos människa med hjälp av ett mikrofysiskt system

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...