Name: a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الوطنية الصينية (رقم 31972651 و 31101826) ، ومؤسسة جيانغسو لعلوم التعليم العالي (رقم 14KJB230002) ، ومختبر الدولة الرئيسي للتكنولوجيا الحيوية البيطرية (رقم SKLVBF201509) ، ومنحة مؤسسة علوم الطبيعة في يانغتشو (رقم YZ2014019) ، وهو مشروع ممول من تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD).

أجريت جميع التجارب وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الصادر عن المجلس القومي للبحوث. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة يانغتشو على جميع التجارب والإجراءات المطبقة على الحيوانات (SYXK2016-0020).
1. السلالات البكتيرية والبلازميدات وظروف الثقافة
<ol><li>استخدم البكتيريا وا?...

<ol>
	<li>J&#248;rgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-mediated+control+in+bacteria:+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms.">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).</li><li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea:+who+they+are,+what+they+do,+and+how+they+do+it.">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li><li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella.">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li><li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria:+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms.">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li><li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li><li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicC,+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli.">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li><li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation.">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li><li>Dam, S., Pag&#232;s, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli.">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains.">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li><li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure.">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li><li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin,+OmpD.">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li><li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells.">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis.">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Vander Velden, A. W., B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice.">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li><li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals:+Epidemiology,+pathogenesis,+and+control.">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).</li><li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal.">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li><li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella.">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li><li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence.">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors.">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).</li><li>H&#233;brard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li><li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane.">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li><li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay.">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li><li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA.">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level.">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li><li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboregulation+in+Escherichia+coli:+DsrA+RNA+acts+by+RNA:RNA+interactions+at+multiple+loci.">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li><li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C/A-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites.">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li><li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism.">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li><li>Mass&#233;, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli.">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens.">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host &amp; Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li></ol>

س. Enteritidis هو أحد مسببات الأمراض الاختيارية المهمة داخل الخلايا التي يمكن أن تصيب الدجاج الصغير وتنتج أعراضا من التهاب الأمعاء إلى العدوى الجهازية والموت17,18. بالإضافة إلى ذلك ، تسبب S. Enteritidis التهابات كامنة في الدجاج البالغ والناقلات المزمنة تلوث من...

يبلغ طول الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sRNAs) 40-400 نيوكليوتيدات ، والتي لا تشفر البروتينات بشكل عام ولكن يمكن نسخها بشكل مستقل في الكروموسومات البكتيرية1،2،3. يتم تشفير معظم sRNAs في المناطق بين الجينات (IGRs) بين مناطق ترميز الجينات وتتفاعل مع mRNAs المستهدفة من خلال إجراءات إقران القواعد ، وتنظم التعبير الجيني المستهدف على مستوى ما بعد النسخ 4,5. يلعبون أدوارا تنظيمية مهمة في استقلاب المواد ، وتخليق بروتين الغشاء الخارجي ، واستشعار النصاب ، والتعبير الجيني للفوعة5.
MicC عبارة عن نسخة صغيرة من الحمض النووي الريبي مكونة من 109 نيوكليوتيد موجودة في الإشريكية القولونية والسالمونيلا المعوية المصلية التيفيموريوم ، والتي يمكن أن تنظم تعبير بروتين الغشاء الخارجي المتعدد مثل OmpC و OmpD و OmpN و Omp35 و Omp366،7،8،9. ينظم MicC التعبير عن OmpC عن طريق تثبيط ارتباط الريبوسوم بزعيم ompC mRNA في المختبر ويتطلب مرافقة Hfq RNA لوظيفته في الإشريكية القولونية6. في السالمونيلا التيفيموريوم ، يسكت MicC ompD mRNA عبر ازدواج الحمض النووي الريبي ≤12-bp داخل تسلسل الترميز (الكودونات 23-26) ثم يزعزع استقرار mRNA7 داخل النوكلية. يتم مساعدة عملية التنظيم هذه بواسطة بروتين المرافق Hfq10. OmpC هو بروتين غشاء خارجي وفير كان يعتقد أنه مهم في البيئات التي كانت فيها تركيزات المغذيات والسموم عالية ، كما هو الحال في الأمعاء6. بورين OmpD هو بروتين الغشاء الخارجي الأكثر وفرة في السالمونيلا التيفيموريوم ويمثل حوالي 1 ٪ من إجمالي بروتين الخلية11. يشارك OmpD في الالتزام بالبلاعم البشرية والخلايا الظهارية المعوية12. يقوم MicC أيضا بقمع التعبير عن كل من OmpC و OmpD porins. ويعتقد أن MicC قد ينظم الفوعة. لاستكشاف الجينات المستهدفة الجديدة التي ينظمها MicC ودراسة وظيفة تنظيم الفوعة ل micC ، قمنا باستنساخ جين micC في سلالة Salmonella Enteritidis (SE) 50336 ، ثم قمنا ببناء الطافر 50336ΔmicC والطافر المكمل 50336ΔmicC / p micC. تم فحص الجينات المستهدفة الجديدة بواسطة qRT-PCR. تم الكشف عن ضراوة 50336ΔmicC من قبل الفئران والتهابات الدجاج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>dextrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610219</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP214</td>
			<td>for DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR01A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10017608</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20032116</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610071</td>
			<td>&#955;-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRR Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td>Absorbance detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500 system</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis

يعد الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sRNA) عاملا جديدا لتنظيم التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ. يمكن لنوع من sRNA MicC ، المعروف في الإشريكية القولونية والسالمونيلا التيفيموريوم ، قمع التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي. لمزيد من التحقيق في وظيفة تنظيم micC في Salmonella Enteritidis ، قمنا باستنساخ جين micC في سلالة Salmonella Enteritidis 50336 ، ثم قمنا ببناء micC المتحور 50336Δ بواسطة نظام إعادة التركيب القائم على λ Red والطافر المكمل 50336Δ micC / p micC الذي يحمل البلازميد المؤتلف pBR322 الذي يعبر عن micC. أظهرت نتائج qRT-PCR أن نسخ ompD في 50336Δ micC كان أعلى بمقدار 1.3 مرة من ذلك في سلالة النوع البري ، في حين أن نسخ ompA و ompC في 50336ΔmicC كان أعلى بمقدار 2.2 ضعف و 3 أضعاف من تلك الموجودة في سلالة النوع البري. أشارت هذه إلى أن micC يقمع تعبير ompA و ompC. في الدراسة التالية ، تم الكشف عن إمراضية 50336ΔmicC من قبل كل من الفئران المصابة Balb / c البالغة من العمر 6 أسابيع والدجاج البالغ من العمر 1 يوم. أظهرت النتائج أن LD 50 من سلالة النوع البري 50336 ، والطافرات 50336Δ micC و 50336Δ micC / pmicC للفئران Balb / c البالغة من العمر 6 أسابيع كانت 12.59 CFU و 5.01 CFU و 19.95 CFU على التوالي. كانت LD 50 من سلالات الدجاج البالغ من العمر يوما واحدا 1.13 × 109 CFU و 1.55 × 10 8 CFU و2.54 × 10 8 CFU ، على التوالي. وأشارت إلى أن حذف الميكروفون يعزز ضراوة S. Enteritidis في الفئران والدجاج عن طريق تنظيم التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي.

بناء ميكروفون 50336Δ المتحور والسلالة المكملة 50336Δ micC / pmicC أشارت نتيجة استنساخ جين micC إلى أن هذا الجين يتكون من 109 bp تظهر هوية 100٪ مع هوية S. التيفيموريوم. استنادا إلى بيانات التسلسل ، تم إنشاء ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

تم استخدام نظام إعادة التركيب بوساطة λ-Red لإنشاء متحولة حذف لميكروفون RNA صغير غير مشفر.

يساهم ميكروفون الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر في الفوعة في بروتينات الغشاء الخارجي في السالمونيلا المعوية

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتعطيل جينات الكروموسومات لعزل الطفرات لدراسة وظائف الجينات والبكتيريا. يجعل عملية إعادة التركيب المتماثل بسيطة وسريعة وعالية الكفاءة. باستخدام هذه التقنية ، يمكن حذف الجينات المرتبطة بالفوعة للممرض للحصول على الطافر الموهن الذي يمكن استخدامه كمرشح للقاح الموهن.ابدأ بتضخيم شريط الكلورامفينيكول الذي يحتوي على شظايا دموية من جين micC. صمم بادئات أمامية وخلفية لتضخيم كاسيت الكلورامفينيكول من البلازميد PKD3 ، بما في ذلك 50 امتدادا لزوج التماثل الأساسي من الأطراف الأولية الخمسة والثلاثة الأولية لجين micC. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في المخطوطة النصية باستخدام بلازميد PKD3 كقالب لتضخيم كاسيت الكلورامفينيكول.تحديد حجم المنتج PCR مع هلام الاغاروز الكهربائي. ثم قم بتنقية المنتج باستخدام مجموعة أدوات استعادة هلام الحمض النووي وتحديد تركيز الحمض النووي عن طريق القياس الطيفي. قم بإجراء تفاعل PCR ثان للقضاء على تداخل إعادة التركيب الإضافي بواسطة بلازميد PKD3.قم بتخفيف أول منتج PCR بنسبة 1 إلى 200 واستخدمه كقالب ل PCR الثانوي. لبناء أول سلالة مؤتلفة 50336 دلتا ميك دوت كات ، امزج 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة SE 50336 مع خمسة ميكرولترات من بلازميد PKD 46 واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. صدم الخليط حراريا عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، وانقله بسرعة مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين لتحويل البلازميد إلى خلايا.فحص المستعمرات الإيجابية عن طريق زراعة الخلايا طوال الليل عند 30 درجة مئوية على لوحة مقاومة للأمبيسيلين. في اليوم التالي ، أضف 30 مللي من L arabinose إلى الثقافة السائلة SE 50336 PKD 46 وحث على التعبير المؤتلف مع حضانة لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية أثناء الهز. امزج 100 نانوجرام من منتج PCR المنقى و 40 ميكرولتر من الخلايا المختصة SE 50336 PKD 46 في كوب صدمة كهربائية.ثم نفذ تحويل الصدمة الكهربائية. بعد التحول الكهربائي ، انقل الخليط إلى ملليلتر واحد من وسط SOC وحاضنة ثقافة الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. انشر الخليط على طبق LB مقاوم للكلورامفينيكول واستزرعه عند 37 درجة مئوية طوال الليل لفحص المستعمرات الإيجابية.استزرع المستعمرات الموجبة عند 42 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم قم بفحص المستعمرة بحثا عن حساسية للأمبيسيلين ومقاومة الكلورامفينيكول عند 37 درجة مئوية طوال الليل للحصول على أول سلالة مؤتلفة بدون PKD 46. بعد استخراج الحمض النووي الجينومي للقطط 50336 Delta micC dot باستخدام PCR والرحلان الكهربائي الهلامي ، قم بتزويد 100 نانوجرام من البلازميد PCP 20 بالكهرباء إلى 40 ميكرولتر من 50336 Delta micC dot cat.فحص المحولات الموجبة على كل من الألواح المقاومة للأمبيسيلين والكلورامفينيكول عند 30 درجة مئوية. انقل المحولات الموجبة إلى وسط سائل LB غير مقاوم واستزرعها طوال الليل عند 42 درجة مئوية. ثم اعزل المستعمرات المفردة على صفيحة LB عند 37 درجة مئوية.حدد المستعمرة الحساسة لكل من الأمبيسلين والكلورامفينيكول. هذا المسخ هو متحولة حذف micC SE 50336 Delta micC. تحقق من 50336 Delta micC عن طريق إجراء PCR كما هو موضح في المخطوطة النصية.تم استخدام هذا البروتوكول لإنشاء متحولة الحذف 50336 Delta micC في متحولة 50336 Delta micC ، pmicC. تم التحقق من صحة أول قطة منقوصة 50336 Delta micC dot المؤتلفة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم نطاق متوقع يبلغ حوالي 1200 زوج أساسي من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع إدخال الكلورامفينيكول مقارنة ب 279 زوجا أساسيا في سلالة النوع البري. في إعادة التركيب الثانية ، تم التخلص من كاسيت الكلورامفينيكول بواسطة PCP 20.أكدت نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل جنبا إلى جنب مع التسلسل أن طفرة الميكروفون إيزوجينيك قد تم بناؤها بنجاح. تم تحليل التعبير عن جينات ompA و ompC و ompD في السلالات 50336 و 50336 Delta micC و 50336 delta micC pmicC بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. زاد نسخ ompA و ompC و 50336 delta micC بحوالي 2.2 ضعف وثلاثة أضعاف مقارنة بسلالة النوع البري.في حين أن نسخ ompD زاد قليلا فقط. أظهرت فحوصات LD 50 أنه بعد إصابة الفئران BALB / c البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع بكل من السلالات الثلاث ، أظهرت معظم الفئران المصابة ب 50336 Delta micC التراخي أو عدم الشهية أو الإسهال بعد 48 ساعة من الإصابة وتوفيت بعد 96 ساعة. أظهرت الفئران المصابة بسلالة من النوع البري و 50336 delta micC pmicC نفس الأعراض بعد 72 ساعة من الإصابة وماتت بعد 120 ساعة.أشارت LD 50s من السلالات الثلاث إلى أن ضراوة 50336 Delta micC المتحولة عززت 2.5 ضعف مقارنة بالنوع البري. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة وظيفة الجينات البكتيرية والحصول على السلالة المهندسة المطلوبة عن طريق حذف الجينات المستهدفة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

وPCR لتحديد Allelotyping السالمونيلا enterica serovars الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

تأمين تدفق الأحماض النووية الخلوي ومضان في الموقع التهجين (LNA تدفق FISH) : طريقة لاكتشاف الحمض النووي الريبي البكتيرية الصغيرة

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; استخدام الأصباغ نيون

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

بروتوكول لتصيب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; مع<em&gt; السالمونيلا التيفية الفأرية</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...