Name: a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית הסינית למדע (מס '31972651 ו -31101826), קרן המדע להשכלה גבוהה ג'יאנגסו (No.14KJB230002), מעבדת מפתח המדינה לביוטכנולוגיה וטרינרית (No.SKLVBF201509), מענק קרן מדעי הטבע של יאנגז'ו (No.YZ2014019), פרויקט הממומן על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD).

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המועצה הלאומית למחקר. ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת יאנגג'ואו אישרה את כל הניסויים והנהלים המיושמים על בעלי החיים (SYXK2016-0020).
1. זני חיידקים, פלסמידים ותנאי תרבית
<ol><li>השתמשו בחיידקים ובפלסמידים המפו?...

<ol>
	<li>J&#248;rgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-mediated+control+in+bacteria:+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms.">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).</li><li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea:+who+they+are,+what+they+do,+and+how+they+do+it.">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li><li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella.">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li><li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria:+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms.">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li><li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li><li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicC,+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli.">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li><li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation.">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li><li>Dam, S., Pag&#232;s, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli.">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains.">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li><li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure.">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li><li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin,+OmpD.">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li><li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells.">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis.">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Vander Velden, A. W., B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice.">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li><li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals:+Epidemiology,+pathogenesis,+and+control.">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).</li><li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal.">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li><li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella.">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li><li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence.">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors.">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).</li><li>H&#233;brard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li><li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane.">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li><li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay.">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li><li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA.">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level.">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li><li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboregulation+in+Escherichia+coli:+DsrA+RNA+acts+by+RNA:RNA+interactions+at+multiple+loci.">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li><li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C/A-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites.">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li><li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism.">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li><li>Mass&#233;, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli.">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens.">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host &amp; Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li></ol>

ס. Enteritidis הוא פתוגן תוך-תאי חשוב שיכול להדביק תרנגולות צעירות ומייצר תסמינים מדלקת מעיים ועד זיהום מערכתי ומוות17,18. בנוסף, S. Enteritidis גורם לזיהומים סמויים בתרנגולות בוגרות ונשאים כרוניים מזהמים מוצרי עופות, וכתוצאה מכך זיהומים המועברים במזון בבני אדם<sup cl...

RNA קטן שאינו מקודד (sRNAs) הוא באורך 40-400 נוקלאוטידים, אשר בדרך כלל אינם מקודדים חלבונים אך יכולים להיות משועתקים באופן עצמאי בכרומוזומי חיידקים 1,2,3. רוב ה-sRNAs מקודדים באזורים הבין-גניים (IGRs) בין אזורי קידוד גנים ומקיימים אינטראקציה עם mRNA מטרה באמצעות פעולות זיווג בסיסים, ומווסתים את ביטוי גני המטרה ברמהשלאחר השעתוק 4,5. הם ממלאים תפקידי ויסות חשובים במטבוליזם של חומרים, סינתזת חלבון בקרום החיצוני, חישת מניין וביטוי גנים אלימים5.
MicC הוא תעתיק RNA קטן של 109 נוקלאוטידים הקיים ב- Escherichia coli ו- Salmonella enterica serovar Typhimurium, אשר יכול לווסת ביטוי חלבון ממברנה חיצוני מרובים כגון OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ו- Omp36 6,7,8,9. MicC מווסת את הביטוי של OmpC על ידי עיכוב קשירת ריבוזום למוביל mRNA ompC במבחנה והוא דורש מלווה RNA Hfq עבור תפקודו ב- Escherichia coli6. בסלמונלה טיפימוריום, MicC משתיק mRNA ompD באמצעות דופלקס RNA של ≤12 bp בתוך רצף הקידוד (קודונים 23-26) ולאחר מכן מערער את היציבות של mRNA אנדונוקלאוליטי7. תהליך ויסות זה נעזר בחלבון מלווה Hfq10. ה-OmpC הוא חלבון מצוי בשפע בקרום החיצוני שנחשב חשוב בסביבות שבהן ריכוזי החומרים המזינים והרעלנים היו גבוהים, כמו במעי6. פורין OmpD הוא חלבון הממברנה החיצונית הנפוץ ביותר בסלמונלה טיפימוריום ומייצג כ -1% מכלל חלבון התא11. OmpD מעורב בהיצמדות למקרופאגים אנושיים ולתאי אפיתל מעיים12. MicC גם מדחיק את הביטוי של נקבוביות OmpC ו- OmpD. הוא חשב כי MicC עשוי לווסת אלימות. כדי לחקור גני מטרה חדשים המווסתים על ידי MicC ולחקור את פונקציית ויסות האלימות של micC, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis (SE) 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336ΔmicC ואת המוטציה המשלימה 50336ΔmicC/p micC. גני מטרה חדשים נבדקו על ידי qRT-PCR. האלימות של 50336ΔmicC זוהתה על ידי עכברים וזיהומי תרנגולות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>dextrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610219</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP214</td>
			<td>for DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR01A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10017608</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20032116</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610071</td>
			<td>&#955;-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRR Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td>Absorbance detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500 system</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis

רנ"א קטן שאינו מקודד (sRNA) הוא גורם חדש המווסת ביטוי גנים ברמה שלאחר השעתוק. סוג של sRNA MicC, הידוע ב- Escherichia coli ו- Salmonella Typhimurium, יכול לדכא את הביטוי של חלבוני הממברנה החיצונית. כדי להמשיך לחקור את פונקציית הבקרה של micC בסלמונלה אנטריטידיס, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336Δ micC על ידי מערכת הרקומבינציה λ Red והמוטנט המשלים 50336Δ micC/p micC הנושא פלסמיד רקומביננטי pBR322 המבטא micC. תוצאות qRT-PCR הראו כי התמלול של ompD ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 1.3 מזה שבזן מסוג פראי, בעוד שהתעתוק של ompA ו- ompC ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 2.2 ופי 3 מאלה בזן מסוג פראי. אלה הצביעו על כך ש-micC מדחיק את הביטוי של ompA ו-ompC. במחקר הבא, הפתוגני של 50336ΔmicC זוהה הן על ידי הדבקת עכברים בני 6 שבועות Balb/c והן על ידי תרנגולות בנות יום אחד. התוצאות הראו כי LD 50 של זן פראי מסוג 50336, המוטנטים 50336Δ micC ו-50336Δ micC/pmicC עבור עכברי Balb/c בני 6 שבועות היו 12.59 CFU, 5.01 CFU, ו-19.95 CFU, בהתאמה. LD50 של זנים עבור תרנגולות בנות יום אחד היו 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, ו 2.54 x 108 CFU, בהתאמה. הוא הצביע על כך שמחיקת micC הגבירה את האלימות של S. Enteritidis בעכברים ותרנגולות על ידי ויסות ביטוי של חלבונים הממברנה החיצונית.

בניית המוטציה 50336Δ micC וזן משלים 50336Δ micC /p micC תוצאת שיבוט הגן micC הצביעה על כך שגן זה מורכב מ- 109 bp המראים 100% זהות עם זו של S. טיפימוריום. בהתבסס על נתוני הרצף, מוטנט המחיקה 50336ΔmicC והמוטנט המשלים 50...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

מערכת רקומבינציה בתיווך λ-Red שימשה ליצירת מוטציית מחיקה של מיקרופון RNA קטן שאינו מקודד.

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

פרוטוקול זה יכול לשמש להשבתת גנים כרומוזומליים כדי לבודד מוטנטים לחקר תפקודי גנים וחיידקים. זה הופך את תהליך הרקומבינציה ההומולוגית לפשוט, מהיר ויעיל ביותר. באמצעות טכניקה זו, ניתן למחוק את הגנים הקשורים לאלימות של הפתוגן כדי להשיג את המוטציה המוחלשת אשר יכולה לשמש כמועמד לחיסון מוחלש.התחל על ידי הגברת קלטת chloramphenicol המכילה קטעי hemology של הגן micC. תכננו פריימרים קדימה ואחורה כדי להגביר את קסטת הכלוראמפניקול מפלסמיד PKD3, כולל 50 הרחבות הומולוגיה של זוג בסיסים מחמשת הקצוות הראשוניים ושלושת הקצוות הראשוניים של הגן micC. בצע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט באמצעות פלסמיד PKD3 כתבנית להגברת קלטת כלורמפניקול.לקבוע את הגודל של מוצר PCR עם אלקטרופורזה ג'ל agarose. לאחר מכן לטהר את המוצר עם ערכת התאוששות ג'ל DNA ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטריה. בצע תגובת PCR שנייה כדי למנוע את ההפרעה של רקומבינציה נוספת על ידי פלסמיד PKD3.לדלל את מוצר ה- PCR הראשון ביחס של 1 עד 200 ולהשתמש בו כתבנית עבור PCR משני. כדי לבנות את הזן הרקומביננטי הראשון 50336 delta micC dot cat, ערבבו 100 מיקרוליטר של תאים מוסמכים SE 50336 עם חמישה מיקרוליטרים של פלסמיד PKD 46 ודגרו על קרח במשך 30 דקות. מחממים את התערובת בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, ומעבירים אותה במהירות חזרה על קרח למשך שתי דקות כדי להפוך את הפלסמיד לתאים.מסך מושבות חיוביות על ידי תרבית התאים במשך הלילה ב 30 מעלות צלזיוס על צלחת עמידה אמפיצילין. למחרת, הוסיפו 30 מילי ליטר ארבינוז נוספים לתרבית הנוזלית SE 50336 PKD 46 וגרמו לביטוי רקומבינאז עם דגירה של שעה ב-30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידה. ערבבו 100 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר ו-40 מיקרוליטר של SE 50336 PKD 46 תאים מוסמכים בכוס הלם חשמלי.לאחר מכן לבצע טרנספורמציה הלם חשמלי. לאחר טרנספורמציה חשמלית, מעבירים את התערובת למיליליטר אחד של מדיום SOC ואינקובטור תרבית מטלטלת ב-150 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס למשך שעה. מורחים את התערובת על צלחת LB עמידה לכלוראמפניקול ותרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לסנן מושבות חיוביות.תרבית את המושבות החיוביות ב 42 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן בדקו את המושבה לרגישות לאמפיצילין ועמידות לכלורמפניקול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקבל את הזן הרקומביננטי הראשון ללא PKD 46. לאחר חילוץ הדנ"א הגנומי של החתול 50336 Delta micC dot באמצעות אלקטרופורזה של PCR וג'ל, אלקטרופלטה 100 ננוגרם של פלסמיד PCP 20 לתוך 40 מיקרוליטר של 50336 תאים מוסמכים של Delta micC dot cat.שנאי מסך חיוביים על לוחות עמידים בפני אמפיצילין וכלוראמפניקול בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. מעבירים את הטרנספורמטורים החיוביים למדיום נוזלי LB שאינו עמיד ומתרבתים אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן בודדו מושבות בודדות על צלחת LB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.בחר את המושבה הרגישה הן אמפיצילין ו chloramphenicol. מוטנט זה הוא מוטנט מחיקת micC SE 50336 Delta micC. אמת 50336 Delta micC על ידי ביצוע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט.פרוטוקול זה שימש לבניית מוטנט המחיקה 50336 Delta micC במוטנט המחמאה 50336 Delta micC, pmicC. חתול הנקודות הרקומביננטי הראשון 50336 Delta micC דוט חתול אומת על ידי PCR עם גודל פס צפוי של כ -1200 זוגות בסיסים של מוצרי PCR עם החדרת כלוראמפניקול בהשוואה ל -279 זוגות בסיסים בזן מסוג פראי. ברקומבינציה השנייה, קלטת chloramphenicol בוטל על ידי PCP 20.תוצאות ה-PCR בשילוב עם ריצוף אישרו כי מוטציית micC איזוגנית נבנתה בהצלחה. ביטוי הגנים ompA, ompC ו-ompD בזנים 50336, 50336 Delta micC ו-50336 delta micC pmicC נותחו על ידי PCR כמותי בזמן אמת. התעתיק של ompA ו-ompC ו-50336 delta micC גדל בערך פי 2.2 ופי שלושה בהשוואה לזן מסוג Wild.בעוד תמלול של ompD רק גדל מעט. בדיקות LD 50 הראו כי לאחר שהדביקו עכברי BALB/c בני שישה עד שמונה שבועות בכל אחד משלושת הזנים, רוב העכברים שנדבקו במיקרופון דלתא 50336 הפגינו רפיון, חוסר יכולת או שלשול 48 שעות לאחר ההדבקה ומתו לאחר 96 שעות. העכברים שנדבקו בזן פראי וב-50336 delta micC pmicC הציגו את אותם תסמינים 72 שעות לאחר ההדבקה ומתו לאחר 120 שעות.ה-LD 50s מבין שלושת הזנים הצביע על כך שהאלימות של ה-50336 Delta micC המוטנטי השתפרה פי 2.5 בהשוואה לסוג הפראי. טכניקה זו מסייעת לחוקרים לחקור את תפקודם של גנים חיידקיים ולהשיג את הזן המהונדס הרצוי על ידי מחיקת גני מטרה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו</emהכלאה> (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

פרוטוקול להדביק<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; Typhimurium סלמונלה</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...