Name: a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

이 연구는 중국 국립 과학 재단 (Nos. 31972651 및 31101826), 장쑤 고등 교육 과학 재단 (No.14KJB230002), 수의학 생명 공학 국가 핵심 연구소 (No.SKLVBF201509), 양저우 자연 과학 재단 보조금 (No.YZ2014019), 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)이 자금을 지원하는 프로젝트.

모든 실험은 국립연구위원회(National Research Council)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었다. Yangzhou University의 동물 관리 및 사용위원회는 동물에 적용된 모든 실험 및 절차를 승인했습니다 (SYXK2016-0020).
1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 조건
<ol><li>표 1에 열거된 박테리아 및 플라스미드를 사용한다.</li>
	<li>적...

<ol>
	<li>J&#248;rgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-mediated+control+in+bacteria:+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms.">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).</li><li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea:+who+they+are,+what+they+do,+and+how+they+do+it.">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li><li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella.">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li><li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria:+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms.">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li><li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li><li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicC,+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli.">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li><li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation.">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li><li>Dam, S., Pag&#232;s, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli.">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains.">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li><li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure.">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li><li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin,+OmpD.">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li><li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells.">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis.">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Vander Velden, A. W., B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice.">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li><li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals:+Epidemiology,+pathogenesis,+and+control.">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).</li><li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal.">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li><li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella.">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li><li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence.">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors.">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).</li><li>H&#233;brard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li><li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane.">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li><li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay.">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li><li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA.">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level.">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li><li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboregulation+in+Escherichia+coli:+DsrA+RNA+acts+by+RNA:RNA+interactions+at+multiple+loci.">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li><li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C/A-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites.">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li><li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism.">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li><li>Mass&#233;, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli.">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens.">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host &amp; Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li></ol>

에스. Enteritidis는 어린 닭을 감염시킬 수 있는 중요한 통성 세포 내 병원체이며 장염에서 전신 감염 및 사망에 이르기까지 증상을 유발합니다17,18. 또한, S. Enteritidis는 성충에게 잠복 감염을 일으키고 만성 보균자는 가금류 제품을 오염시켜 인간에게 식중독 감염을 일으킨다19. S. Enteritidis의 병원성 메커니즘은 더 자세히 ?...

비암호화 소형 RNA(sRNA)는 길이가 40-400 뉴클레오티드로, 일반적으로 단백질을 암호화하지 않지만 박테리아 염색체 1,2,3에서 독립적으로 전사될 수 있습니다. 대부분의 sRNA는 유전자 코딩 영역 사이의 유전자 간 영역(IGR)에 암호화되어 염기쌍 작용을 통해 표적 mRNA와 상호 작용하고 전사 후 수준에서 표적 유전자 발현을 조절합니다 4,5. 물질 대사, 외막 단백질 합성, 정족수 감지 및 독성 유전자 발현에서 중요한 조절 역할을 한다5.
MicC는 대장균 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움에 존재하는 109-뉴클레오티드 소RNA 전사체로, OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 및 Omp36 6,7,8,9와 같은 다중 외막 단백질 발현을 조절할 수 있습니다. MicC는 시험관 내에서 ompC mRNA 리더에 대한 리보솜 결합을 억제하여 OmpC의 발현을 조절하며 대장균6에서 기능을 위해 Hfq RNA 샤페론이 필요합니다. 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에서 MicC는 코딩 서열(코돈 23-26) 내의 ≤12-bp RNA 이중체를 통해 ompD mRNA를 침묵시킨 다음 내핵분해 mRNA7을 불안정화시킵니다. 이 조절 과정은 샤페론 단백질 Hfq10에 의해 지원됩니다. OmpC는 장과 같이 영양소와 독소 농도가 높은 환경에서 중요하다고 생각되는 풍부한 외막 단백질입니다6. OmpD 포린은 살모넬라 티피무리움에서 가장 풍부한 외막 단백질이며 전체 세포 단백질11의 약 1%를 차지합니다. OmpD는 인간 대식세포와 장 상피세포에 대한 순응에 관여한다12. MicC는 또한 OmpC 및 OmpD 포린 모두의 발현을 억제합니다. MicC는 독성을 조절할 수 있다고 생각됩니다. MicC에 의해 조절되는 새로운 표적 유전자를 탐색하고 micC의 독성 조절 기능을 연구하기 위해 살모넬라 엔테리티디스(SE) 균주 50336에서 micC 유전자를 복제한 다음 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p micC를 구성했습니다. 새로운 표적 유전자를 qRT-PCR로 스크리닝하였다. 50336ΔmicC의 독성은 생쥐 및 닭 감염에 의해 검출되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>dextrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610219</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP214</td>
			<td>for DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR01A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10017608</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20032116</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610071</td>
			<td>&#955;-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRR Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td>Absorbance detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500 system</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis

비코딩 소형 RNA(sRNA)는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 새로운 인자입니다. 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에 알려진 일종의 sRNA MicC는 외막 단백질의 발현을 억제할 수 있습니다. 살모넬라 엔테리티디스에서 micC의 조절 기능을 추가로 조사하기 위해, 우리는 살모넬라 엔테리티디스 균주 50336에서 micC 유전자를 클로닝한 다음, λ 적색 기반 재조합 시스템에 의해 돌연변이 50336Δ micC를 구성하고 micC를 발현하는 재조합 플라스미드 pBR322를 운반하는 보완된 돌연변이 50336Δ micC/p micC를 구성했습니다. qRT-PCR 결과는 50336Δ micC에서 ompD의 전사가 야생형 균주보다 1.3배 더 높은 반면, 50336ΔmicC에서 ompA 및 ompC의 전사 는 야생형 균주보다 2.2배 및 3배 더 높았다. 이들은 micC가 ompA 및 ompC의 발현을 억제한다는 것을 나타내었다. 다음 연구에서, 50336ΔmicC의 병원성은 6주령의 Balb/c 마우스와 1일령의 닭 모두를 감염시켜 검출되었다. 그 결과, 6주령 Balb/c 마우스에 대한 야생형 균주 50336의LD50, 돌연변이체 50336ΔmicC 및 50336Δ micC/pmicC가 각각 12.59 CFU, 5.01 CFU 및 19.95 CFU인 것으로 나타났다. 1 일 된 닭에 대한 균주의LD50은 각각 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU 및 2.54 x 108 CFU였다. micC의 결실이 S의 독성을 증가시킨다는 것을 나타내었다. Enteritidis는 외막 단백질의 발현을 조절하여 생쥐와 닭에서 발생합니다.

돌연변이 50336Δ micC 및 보완 균주 50336Δ micC /pmicC의 구성 micC 유전자 클론 결과는 이 유전자가 109 bp로 구성되어 S의 유전자와 100% 동일함을 나타내는 것으로 나타났다. 티피무리움. 서열 데이터를 기반으로 결실 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

λ-적색 매개 재조합 시스템을 사용하여 작은 비암호화 RNA micC의 결실 돌연변이를 생성했습니다.

암호화되지 않은 작은 RNA MicC는 살모넬라 엔테리티디스의 외막 단백질에서 독성에 기여합니다

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

이 프로토콜은 유전자 기능 연구 및 박테리아를 위한 돌연변이를 분리하기 위해 염색체 유전자를 비활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 상동 재조합 과정을 간단하고 빠르며 매우 효율적으로 만듭니다. 이 기술을 사용하여 병원체의 독성 관련 유전자를 결실하여 약독화 백신의 후보로 사용할 수 있는 약독화 돌연변이를 얻을 수 있습니다.micC 유전자의 헤모로지 단편을 함유하는 클로람페니콜 카세트를 증폭하는 것으로 시작한다. micC 유전자의 5개 프라임 말단과 3개의 프라임 말단에서 50개의 염기쌍 상동성 확장을 포함하여 플라스미드 PKD3에서 클로람페니콜 카세트를 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다. PKD3 플라스미드를 주형으로 사용하여 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 PCR을 수행하여 클로람페니콜 카세트를 증폭한다.아가로스 겔 전기영동으로 PCR 산물의 크기를 결정합니다. 그런 다음 DNA 겔 회수 키트로 제품을 정제하고 분광 광도계로 DNA 농도를 결정합니다. PKD3 플라스미드에 의한 추가 재조합의 간섭을 제거하기 위해 두 번째 PCR 반응을 수행합니다.첫 번째 PCR 산물을 1 : 200의 비율로 희석하여 2차 PCR의 주형으로 사용합니다. 첫 번째 재조합 균주 50336 델타 micC 도트 캣을 구성하기 위해, 100 마이크로리터의 SE 50336 컴피턴트 세포와 5 마이크로리터의 PKD 46 플라스미드를 혼합하고, 30분 동안 얼음 상에서 배양한다. 혼합물을 섭씨 42도에서 90초 동안 열 충격을 가하고 2분 동안 얼음 위에서 빠르게 다시 옮겨 플라스미드를 세포로 변형시킵니다.암피실린 내성 플레이트에서 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다. 다음날, SE 50336 PKD 46 액체 배양액에 30 밀리 L 아라비노스를 더 첨가하고 진탕하면서 섭씨 30도에서 1시간 배양하여 재조합효소 발현을 유도한다. 정제된 PCR 산물 100나노그램과 SE 50336 PKD 46 컴피턴트 셀 40마이크로리터를 전기 충격 컵에 혼합합니다.그런 다음 감전 변환을 수행하십시오. 전기변환 후, 혼합물을 1밀리리터의 SOC 배지로 옮기고 150RPM 및 섭씨 30도에서 1시간 동안 진탕 배양 배양기에서 배양한다. 혼합물을 클로람페니콜 내성 LB 플레이트에 바르고 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다.양성 콜로니를 섭씨 42도에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 암피실린에 대한 민감성 및 클로람페니콜에 대한 내성에 대해 콜로니를 섭씨 37도에서 밤새 스크리닝하여 PKD 46이 없는 첫 번째 재조합 균주를 얻습니다. PCR 및 겔 전기영동을 이용하여 50336 델타 micC 도트 캣 게놈 DNA를 추출한 후, 100 나노그램의 플라스미드 PCP 20을 40 마이크로리터의 50336 델타 micC 도트 캣 컴피턴트 세포에 전기도금하였다.섭씨 30도에서 암피실린과 클로람페니콜 내성 플레이트 모두에서 양성 형질전환체를 스크리닝합니다. 양성 형질전환체를 비내성 LB 액체 배지로 옮기고 섭씨 42도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 LB 플레이트에서 단일 콜로니를 분리합니다.암피실린과 클로람페니콜 모두에 민감한 식민지를 선택하십시오. 이 변이체는 micC 델타 SE 50336 결실 변이체 micC이다. 텍스트 원고에 설명된 대로 PCR을 수행하여 50336 Delta micC를 확인합니다.이 프로토콜은 보완된 돌연변이 50336 델타 micC, pmicC에서 결실 돌연변이 50336 델타 micC를 구축하는데 사용되었다. 최초의 재조합 50336 델타 micC 도트 캣은 야생형 균주의 279개 염기쌍과 비교하여 클로람페니콜이 삽입된 PCR 산물의 약 1200개 염기쌍의 예상 밴드 크기를 갖는 PCR에 의해 검증되었습니다. 두 번째 재조합에서, 클로람페니콜 카세트는 PCP 20에 의해 제거되었다.염기서열 분석과 결합된 PCR 결과는 동종 micC 돌연변이가 성공적으로 구성되었음을 확인했습니다. 균주 50336, 50336 Delta micC 및 50336 delta micC pmicC에서 ompA, ompC 및 ompD 유전자의 발현을 실시간 정량적 PCR로 분석했습니다. ompA 및 ompC 및 50336 델타 micC의 전사는 야생형 균주에 비해 약 2.2배 및 3배 증가하였다.ompD의 전사는 약간만 증가했습니다. LD 50 분석에 따르면 6 내지 8주령 BALB/c 마우스를 3개의 균주 각각으로 감염시킨 후, 50336 Delta micC에 감염된 대부분의 마우스는 감염 후 48시간 후에 권태감, 식욕 부진 또는 설사를 나타내고 96시간 후에 사망하는 것으로 나타났다. 야생형 균주 50336 델타 micC와 pmicC에 의해 감염된 마우스는 감염 후 72시간 후에 동일한 증상을 나타내었고 120시간 후에 사망하였다.3개 균주의 LD50s는 돌연변이체 50336 델타 micC의 독성이 야생형에 비해 2.5배 향상되었음을 나타내었다. 이 기술은 연구자들이 박테리아 유전자의 기능을 연구하고 표적 유전자를 삭제하여 원하는 조작된 균주를 얻는 데 도움이 됩니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

연구

면역학 및 감염병학

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

감염 프로토콜<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt;와<em&gt; 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...