Name: a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами Китайского национального научного фонда (No 31972651 и 31101826), Научного фонда высшего образования провинции Цзянсу (No 14KJB230002), Государственной ключевой лаборатории ветеринарной биотехнологии (No SKLVBF201509), гранта Фонда естественных наук Янчжоу (No YZ2014019), проекта, финансируемого Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD).

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального исследовательского совета. Комитет по уходу за животными и их использованию Университета Янчжоу одобрил все эксперименты и процедуры, применяемые к животным (SYXK201...

<ol>
	<li>J&#248;rgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-mediated+control+in+bacteria:+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms.">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).</li><li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea:+who+they+are,+what+they+do,+and+how+they+do+it.">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li><li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella.">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li><li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria:+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms.">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li><li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li><li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicC,+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli.">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li><li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation.">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li><li>Dam, S., Pag&#232;s, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli.">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains.">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li><li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure.">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li><li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin,+OmpD.">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li><li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells.">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis.">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Vander Velden, A. W., B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice.">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li><li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals:+Epidemiology,+pathogenesis,+and+control.">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).</li><li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal.">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li><li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella.">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li><li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence.">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors.">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).</li><li>H&#233;brard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li><li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane.">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li><li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay.">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li><li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA.">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level.">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li><li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboregulation+in+Escherichia+coli:+DsrA+RNA+acts+by+RNA:RNA+interactions+at+multiple+loci.">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li><li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C/A-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites.">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li><li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism.">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li><li>Mass&#233;, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli.">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens.">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host &amp; Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li></ol>

С. Энтеритидис является важным факультативным внутриклеточным патогеном, который может инфицировать молодых цыплят и вызывает симптомы от энтерита до системной инфекции и смерти17,18. Кроме того, S. Enteritidis вызывает латентные инфекции у взрослых ц...

Некодирующие малые РНК (сРНК) имеют длину 40-400 нуклеотидов, которые обычно не кодируют белки, но могут быть транскрибированы независимо в бактериальных хромосомах 1,2,3. Большинство мРНК кодируются в межгенных областях (IGR) между областями, кодирующими гены, и взаимодействуют с целевыми мРНК посредством действий спаривания оснований и регулируют экспрессию генов-мишеней на посттранскрипционном уровне 4,5. Они играют важную роль в регуляции метаболизма веществ, синтезе белка внешней мембраны, восприятии кворума и экспрессии гена вирулентности5.
MicC представляет собой 109-нуклеотидный малый транскрипт РНК, присутствующий в сероварах Escherichia coli и Salmonella enterica Typhimurium, который может регулировать экспрессию нескольких белков внешней мембраны, таких как OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 и Omp36 6,7,8,9. MicC регулирует экспрессию OmpC путем ингибирования связывания рибосом с лидером мРНК ompC in vitro, и для его функции в Escherichia coli6 требуется шаперон РНК HfQ. В Salmonella Typhimurium MicC подавляет мРНК ompD через дуплекс РНК ≤12.н. в кодирующей последовательности (кодоны 23-26), а затем дестабилизирует эндонуклеолитическую мРНК7. Этому процессу регуляции помогает белок шаперона Hfq10. OmpC представляет собой обильный белок внешней мембраны, который, как считалось, важен в средах с высокими концентрациями питательных веществ и токсинов, например, в кишечнике6. Порин OmpD является наиболее распространенным белком наружной мембраны Salmonella Typhimurium и составляет около 1% от общего количества клеточного белка11. OmpD участвует в адгезии к макрофагам человека и эпителиальным клеткам кишечника12. MicC также подавляет экспрессию пор как OmpC, так и OmpD. Считается, что MicC может регулировать вирулентность. Чтобы исследовать новые гены-мишени, регулируемые MicC, и изучить функцию регуляции вирулентности micC, мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis (SE) 50336, а затем сконструировали мутант 50336ΔmicC и дополненный мутант 50336ΔmicC/p micC. Новые гены-мишени были проверены с помощью qRT-PCR. Вирулентность 50336ΔmicC была обнаружена мышами и куриными инфекциями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>dextrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610219</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP214</td>
			<td>for DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR01A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10017608</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20032116</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610071</td>
			<td>&#955;-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRR Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td>Absorbance detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500 system</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis

Некодирующая малая РНК (сРНК) является новым фактором регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Разновидность sRNA MicC, известная в Escherichia coli и Salmonella Typhimurium, может подавлять экспрессию белков внешней мембраны. Для дальнейшего изучения функции регуляции micC в Salmonella Enteritidis мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis 50336, а затем сконструировали мутант 50336Δ micC с помощью системы рекомбинации на основе λ Red и комплементированного мутанта 50336Δ micC/p micC, несущего рекомбинантную плазмиду pBR322, экспрессирующую micC. Результаты qRT-ПЦР показали, что транскрипция ompD в 50336Δ micC была в 1,3 раза выше, чем у штамма дикого типа, в то время как транскрипция ompA и ompC у 50336ΔmicC была в 2,2 раза и 3 раза выше, чем у штамма дикого типа. Они указывали на то, что micC подавляет экспрессию ompA и ompC. В следующем исследовании патогенность 50336ΔmicC была обнаружена как у 6-недельных мышей Balb/c, так и у 1-дневных цыплят. Результат показал, что LD 50 штамма дикого типа 50336, мутанты 50336Δ micC и 50336Δ micC/pmicC для 6-недельных мышей Balb/c составляли 12,59 КОЕ, 5,01 КОЕ и 19,95 КОЕ соответственно. LD50 штаммов для 1-дневных цыплят составляли 1,13 x 109 КОЕ, 1,55 x 10 8 КОЕ и 2,54 x 108 КОЕ соответственно. Он указал, что удаление micC повышает вирулентность S. Энтеритидис у мышей и цыплят путем регулирования экспрессии белков наружной мембраны.

Построение мутанта 50336Δ micC и дополненного штамма 50336Δ micC /p micC Результат клонирования гена micC показал, что этот ген состоял из 109.н., демонстрируя 100% идентичность с геном S. Тифимурий. На осн?...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Система рекомбинации, опосредованная λ-красным, была использована для создания мутанта делеции небольшой некодирующей РНК micC.

Некодирующая малая РНК MicC способствует вирулентности белков наружной мембраны Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Этот протокол может быть использован для инактивации хромосомных генов для выделения мутантов для изучения функции генов и бактерий. Это делает процесс гомологичной рекомбинации простым, быстрым и высокоэффективным. Используя этот метод, гены, связанные с вирулентностью патогена, могут быть удалены для получения аттенуированного мутанта, который может быть использован в качестве кандидата для аттенуированной вакцины.Начните с амплификации кассеты с хлорамфениколом, содержащей гемологические фрагменты гена micC. Разработка прямых и обратных праймеров для амплификации кассеты хлорамфеникола из плазмиды PKD3, включая 50 расширений гомологии пар оснований из пяти простых и трех простых концов гена micC. Проведите ПЦР, как описано в текстовой рукописи, используя плазмиду PKD3 в качестве шаблона для амплификации кассеты с хлорамфениколом.Определяют размер продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Затем очистите продукт с помощью набора для восстановления геля ДНК и определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометрии. Проводят повторную ПЦР-реакцию для устранения помех дальнейшей рекомбинации плазмидой PKD3.Разбавьте первый продукт ПЦР в соотношении 1 к 200 и используйте его в качестве шаблона для вторичной ПЦР. Чтобы сконструировать первый рекомбинантный штамм 50336 delta micC dot cat, смешайте 100 микролитров компетентных клеток SE 50336 с пятью микролитрами плазмиды PKD 46 и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Тепловой шок смеси при температуре 42 градуса Цельсия в течение 90 секунд и быстрый перенос ее обратно на лед в течение двух минут, чтобы превратить плазмиду в клетки.Скрининг положительных колоний путем культивирования клеток в течение ночи при 30 градусах Цельсия на пластине, устойчивой к ампициллину. На следующий день добавьте еще 30 миллилитров арабинозы в жидкую культуру SE 50336 PKD 46 и индуцируйте экспрессию рекомбиназы с помощью часовой инкубации при 30 градусах Цельсия при встряхивании. Смешайте 100 нанограммов очищенного продукта ПЦР и 40 микролитров компетентных клеток SE 50336 PKD 46 в чашке для электрошока.Затем проведите электрошоковую трансформацию. После электротрансформации перенесите смесь в один миллилитр среды SOC и встряхните культуральный инкубатор при 150 об/мин и 30 градусах Цельсия в течение одного часа. Распределите смесь на устойчивой к хлорамфениколу пластине LB и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия на ночь, чтобы выявить положительные колонии.Культивируйте положительные колонии при температуре 42 градуса Цельсия в течение двух часов. Затем проверьте колонию на чувствительность к ампициллину и устойчивость к хлорамфениколу при 37 градусах Цельсия в течение ночи, чтобы получить первый рекомбинантный штамм без PKD 46. После экстракции геномной ДНК кошки 50336 Delta micC dot с помощью ПЦР и гель-электрофореза гальванизировать 100 нанограммов плазмиды PCP 20 в 40 микролитров 50336 точечных клеток кошек Delta micC.Экранируйте положительные трансформаторы на пластинах, устойчивых к ампициллину и хлорамфениколу, при 30 градусах Цельсия. Перенесите положительные трансформаторы в нерезистентную жидкую среду LB и культивируйте их в течение ночи при температуре 42 градуса Цельсия. Затем изолируйте отдельные колонии на пластине LB при температуре 37 градусов по Цельсию.Выберите колонию, которая чувствительна как к ампициллину, так и к хлорамфениколу. Этот мутант является делеционным мутантом micC SE 50336 Delta micC. Проверьте 50336 Delta micC, выполнив ПЦР, как описано в текстовой рукописи.Этот протокол был использован для построения делеционного мутанта 50336 Delta micC в комплиментированном мутанте 50336 Delta micC, pmicC. Первая рекомбинантная кошка 50336 Delta micC dot была проверена методом ПЦР с ожидаемым размером полосы около 1200 пар оснований продуктов ПЦР с введением хлорамфеникола по сравнению с 279 парами оснований в штамме дикого типа. Во второй рекомбинации кассета с хлорамфениколом была устранена PCP 20.Результаты ПЦР в сочетании с секвенированием подтвердили, что изогенный мутант micC был успешно построен. Экспрессию генов ompA, ompC и ompD в штаммах 50336, 50336 Delta micC и 50336 delta micC pmicC анализировали методом количественной ПЦР в реальном времени. Транскрипция ompA и ompC и 50336 delta micC увеличилась примерно в 2,2 раза и в три раза по сравнению со штаммом дикого типа.В то время как транскрипция ompD увеличилась лишь незначительно. Анализы LD 50 показали, что после заражения мышей BALB/c в возрасте от шести до восьми недель каждым из трех штаммов большинство мышей, инфицированных 50336 Delta micC, проявляли усталость, отсутствие аппетита или диарею через 48 часов после заражения и умирали через 96 часов. Мыши, инфицированные штаммом дикого типа и 50336 delta micC pmicC, проявили те же симптомы через 72 часа после заражения и умерли через 120 часов.LD 50 трех штаммов показали, что вирулентность мутанта 50336 Delta micC увеличилась в 2,5 раза по сравнению с диким типом. Этот метод помогает исследователям изучить функцию бактериальных генов и получить желаемый инженерный штамм путем удаления генов-мишеней.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Allelotyping ПЦР для выявления Salmonella enterica Сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Закрытые нуклеиновых кислот цитометрии потока флуоресценции На месте Гибридизация (LNA поток-FISH): Метод бактериального Малый обнаружения РНК

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Мониторинг изменения мембранного полярность, мембраны целостности и внутриклеточных концентрации ионов в<em&gt; Пневмококк</em&gt; Использование флуоресцентных красителей

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em&gt; Хламидиоз</em&gt; Вакуоли Динамика роста в живых клетках

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Протокол заразить<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; С<em&gt; Сальмонелла Typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Высокая пропускная Анализ фенотипу<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...