Name: a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 31972651 ve 31101826), Jiangsu Yüksek Öğretim Bilim Vakfı (No.14KJB230002), Veteriner Biyoteknoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı (No.SKLVBF201509), Yangzhou Doğa Bilimleri Vakfı Hibesi (No.YZ2014019), Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) tarafından finanse edilen bir proje tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi. Yangzhou Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, hayvanlar üzerinde uygulanan tüm deney ve prosedürleri onayladı (SYXK2016-0020).
1. Bakteriyel suşlar, plazmidler ve kültür koşulları
<ol><li>Tablo 1'de listelenen bakteri ve plazmidleri kullanın.</li>
	<li>LB suyunda veya LB agar plakalarında 37 °C'de, uygun...

<ol>
	<li>J&#248;rgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-mediated+control+in+bacteria:+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms.">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).</li><li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea:+who+they+are,+what+they+do,+and+how+they+do+it.">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li><li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella.">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li><li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria:+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms.">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li><li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li><li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicC,+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli.">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li><li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation.">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li><li>Dam, S., Pag&#232;s, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli.">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).</li><li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains.">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li><li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure.">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li><li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin,+OmpD.">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li><li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells.">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis.">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Vander Velden, A. W., B&#228;umler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice.">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li><li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals:+Epidemiology,+pathogenesis,+and+control.">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).</li><li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal.">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li><li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella.">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li><li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence.">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li><li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice.">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors.">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).</li><li>H&#233;brard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li><li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane.">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li><li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay.">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li><li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA.">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level.">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li><li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riboregulation+in+Escherichia+coli:+DsrA+RNA+acts+by+RNA:RNA+interactions+at+multiple+loci.">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li><li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C/A-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites.">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li><li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism.">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li><li>Mass&#233;, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli.">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li><li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens.">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host &amp; Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li></ol>

S. Enteritidis, genç tavukları enfekte edebilen ve enteritten sistemik enfeksiyona ve ölüme kadar semptomlar üreten önemli bir fakültatif hücre içi patojendir17,18. Ek olarak, S. Enteritidis yetişkin tavuklarda gizli enfeksiyonlara neden olur ve kronik taşıyıcılar kümes hayvanı ürünlerini kirleterek insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden olur19. S. Enteritidis'in patojenik mekanizması daha fazl...

Kodlamayan küçük RNA'lar (sRNA'lar), genellikle proteinleri kodlamayan, ancak bakteri kromozomları 1,2,3'te bağımsız olarak kopyalanabilen 40-400 nükleotid uzunluğundadır. Çoğu sRNA, gen kodlayan bölgeler arasındaki intergenik bölgelerde (IGR'ler) kodlanır ve baz eşleştirme eylemleri yoluyla hedef mRNA'larla etkileşime girer ve hedef genlerin ekspresyonunu transkripsiyon sonrasıseviye 4,5'te düzenler. Madde metabolizmasında, dış membran protein sentezinde, çekirdek algılamada ve virülans gen ekspresyonunda önemli regülasyon rolleri oynarlar5.
MicC, Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium'da bulunan ve OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ve Omp36 6,7,8,9 gibi çoklu dış zar protein ekspresyonunu düzenleyebilen 109 nükleotid küçük RNA transkriptidir. MicC, in vitro ompC mRNA liderine ribozom bağlanmasını inhibe ederek OmpC ekspresyonunu düzenler ve Escherichia coli6'daki işlevi için Hfq RNA şaperonunu gerektirir. Salmonella Typhimurium'da MicC, ompD mRNA'yı kodlama dizisi içinde bir ≤12-bp RNA dubleks aracılığıyla susturur (kodonlar 23-26) ve daha sonra endonükleolitik mRNA7'nin dengesini bozar. Bu düzenleme süreci şaperon proteini Hfq10 tarafından desteklenir. OmpC, bağırsakta olduğu gibi besin ve toksin konsantrasyonlarının yüksek olduğu ortamlarda önemli olduğu düşünülen bol miktarda bir dış zar proteinidir6. OmpD porin, Salmonella Typhimurium'daki en bol dış zar proteinidir ve toplam hücre proteini11'in yaklaşık% 1'ini temsil eder. OmpD, insan makrofajlarına ve bağırsak epitel hücrelerine yapışmada rol oynar12. MicC ayrıca hem OmpC hem de OmpD porinlerinin ifadesini bastırır. MicC'nin virülansı düzenleyebileceği düşünülmektedir. MicC tarafından düzenlenen yeni hedef genleri keşfetmek ve micC'nin virülans düzenleme fonksiyonunu incelemek için, micC genini Salmonella Enteritidis (SE) suşu 50336'da klonladık ve daha sonra mutant 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / p micC'yi inşa ettik. Yeni hedef genler qRT-PCR ile tarandı. 50336ΔmicC'nin virülansı fareler ve tavuk enfeksiyonları tarafından tespit edildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>dextrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610219</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP214</td>
			<td>for DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex Taq</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR01A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10017608</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>20032116</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610071</td>
			<td>&#955;-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plasmid Kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>DP106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRR Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>for broth preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td>Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>for bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Epoch</td>
			<td>Absorbance detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR system</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500 system</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-coding small rna micc contributes to virulence in outer membrane proteins in salmonella enteritidis

Kodlamayan küçük RNA (sRNA), transkripsiyon sonrası düzeyde gen ekspresyonunu düzenlemek için yeni bir faktördür. Escherichia coli ve Salmonella Typhimurium'da bilinen bir tür sRNA MicC, dış zar proteinlerinin ekspresyonunu baskılayabilir. Salmonella Enteritidis'te micC'nin regülasyon fonksiyonunu daha fazla araştırmak için, Salmonella Enteritidis suşu 50336'daki micC genini klonladık ve daha sonra λ Kırmızı bazlı rekombinasyon sistemi ve mikC eksprese eden rekombinant plazmid pBR322 taşıyan tamamlanmış mutant 50336Δ micC / p micC ile mutant 50336Δ micC / p micC oluşturduk. qRT-PCR sonuçları, 50336Δ micC'de ompD'nin transkripsiyonunun vahşi tip suşa göre 1.3 kat daha yüksek olduğunu, 50336Δ micC'de ompA ve ompC'nin transkripsiyonunun ise vahşi tip suştakilere göre 2.2 kat ve 3 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bunlar, micC'nin ompA ve ompC ekspresyonunu bastırdığını göstermiştir. Aşağıdaki çalışmada, 50336ΔmicC'nin patojenitesi, hem 6 haftalık Balb / c farelerini hem de 1 günlük tavukları enfekte ederek tespit edildi. Sonuç, 6 haftalık Balb / c fareler için vahşi tip suş 50336'nın LD 50'sinin, mutantların 50336ΔmicC ve 50336Δ micC / pmicC'nin sırasıyla 12.59 CFU, 5.01 CFU ve 19.95 CFU olduğunu göstermiştir. 1 günlük tavuklar için suşların LD 50'si sırasıyla 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU ve2.54 x 10 8 CFU idi. MicC'nin silinmesinin S'nin virülansını arttırdığını göstermiştir.Enteritidis, farelerde ve tavuklarda dış zar proteinlerinin ekspresyonunu düzenleyerek.

Mutant 50336Δ micC ve tamamlanmış gerinim 50336Δ micC /p micC'nin yapımı MicC gen klonu sonucu, bu genin S'ninkiyle %100 özdeşleştiğini gösteren 109 bp'den oluştuğunu gösterdi. Typhimurium. Sekans verilerine dayanarak, silme mutantı 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / pmicC başarıyla inşa edildi. Ay...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis at JoVE.com

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Küçük bir kodlamayan RNA micC'nin delesyon mutantını oluşturmak için λ-Kırmızı aracılı bir rekombinasyon sistemi kullanıldı.

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Bu protokol, gen fonksiyonu çalışması ve bakteriler için mutantları izole etmek üzere kromozomal genleri inaktive etmek için kullanılabilir. Homolog rekombinasyon işlemini basit, hızlı ve son derece verimli hale getirir. Bu tekniği kullanarak, zayıflatılmış aşı için aday olarak kullanılabilecek zayıflatılmış mutantı elde etmek için patojenin virülansla ilişkili genleri silinebilir.MicC geninin hemoloji parçalarını içeren kloramfenikol kasetini yükselterek başlayın. MikC geninin beş asal ve üç asal ucundan 50 baz çifti homoloji uzantısı da dahil olmak üzere plazmid PKD3'ten kloramfenikol kasetini yükseltmek için ileri ve geri primerler tasarlayın. Kloramfenikol kasetini yükseltmek için PKD3 plazmidini şablon olarak kullanarak metin makalesinde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirin.Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu belirleyin. Daha sonra ürünü bir DNA jeli geri kazanım kiti ile saflaştırın ve spektrofotometri ile DNA konsantrasyonunu belirleyin. PKD3 plazmidi tarafından daha fazla rekombinasyon girişimini ortadan kaldırmak için ikinci bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin.İlk PCR ürününü 1 ila 200 oranında seyreltin ve ikincil PCR için bir şablon olarak kullanın. İlk rekombinant suşu 50336 delta micC nokta kedisini oluşturmak için, 100 mikrolitre SE 50336 yetkin hücreyi beş mikrolitre PKD 46 plazmid ile karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Isı, karışımı 90 saniye boyunca 42 santigrat derecede şoklayın ve plazmidi hücrelere dönüştürmek için iki dakika boyunca hızla buz üzerinde geri aktarın.Hücreleri bir gecede 30 santigrat derecede ampisilin dirençli bir plaka üzerinde kültürleyerek pozitif kolonileri tarayın. Ertesi gün, SE 50336 PKD 46 sıvı kültürüne 30 mili daha fazla L arabinoz ekleyin ve sallanırken 30 santigrat derecede bir saatlik inkübasyonla rekombinaz ekspresyonunu indükleyin. Saflaştırılmış PCR ürününün 100 nanogramını ve 40 mikrolitre SE 50336 PKD 46 yetkin hücreyi bir elektrik çarpması kabında karıştırın.Daha sonra elektrik çarpması dönüşümü gerçekleştirin. Elektro dönüşümden sonra, karışımı bir mililitre SOC ortamına ve bir saat boyunca 150 RPM ve 30 santigrat derecede bir sallama kültürü inkübatörüne aktarın. Pozitif kolonileri taramak için karışımı kloramfenikol dirençli bir LB plakasına ve kültürüne gece boyunca 37 santigrat derecede yayın.Pozitif kolonileri iki saat boyunca 42 santigrat derecede kültürleyin. Daha sonra, PKD 46 olmadan ilk rekombinant suşu elde etmek için koloninin ampisilin'e duyarlılık ve kloramfenikol'e karşı direnç açısından gece boyunca 37 santigrat derecede taranması. PCR ve jel elektroforezi kullanılarak 50336 Delta micC nokta kedi genomik DNA'sını çıkardıktan sonra, elektroplaka 100 nanogram plazmid PCP 20, 40 mikrolitre 50336 Delta micC nokta kedi yetkin hücrelerine dönüştürüldü.Hem ampisilin hem de kloramfenikol dirençli plakalardaki pozitif transformantları 30 santigrat derecede tarayın. Pozitif dönüştürücüleri dirençli olmayan LB sıvı ortamına aktarın ve gece boyunca 42 santigrat derecede kültüre alın. Daha sonra tek kolonileri 37 santigrat derecede bir LB plakasında izole edin.Hem ampisilin hem de kloramfenikol'e duyarlı koloni seçin. Bu mutant, micC silme mutantı SE 50336 Delta micC'dir. Metin makalesinde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirerek 50336 Delta micC'yi doğrulayın.Bu protokol, iltifat edilen mutant 50336 Delta micC, pmicC'deki silme mutantı 50336 Delta micC'yi oluşturmak için kullanıldı. İlk rekombinant 50336 Delta micC nokta kedisi, vahşi tip suştaki 279 baz çiftine kıyasla, kloramfenikol yerleştirmeli yaklaşık 1200 baz çift PCR ürününün beklenen bant büyüklüğü ile PCR tarafından doğrulandı. İkinci rekombinasyonda, kloramfenikol kaseti PCP 20 tarafından elimine edildi.Dizileme ile birleştirilen PCR sonuçları, izojenik micC mutantının başarıyla inşa edildiğini doğruladı. 50336, 50336 Delta micC ve 50336 delta micC pmicC suşlarında ompA, ompC ve ompD genlerinin ekspresyonu gerçek zamanlı kantitatif PCR ile analiz edildi. OmpA ve ompC ve 50336 delta micC'nin transkripsiyonu, vahşi tip suşa kıyasla yaklaşık 2.2 kat ve üç kat artmıştır.OmpD'nin transkripsiyonu sadece biraz artarken. LD 50 tahlilleri, altı ila sekiz haftalık BALB / c farelerini üç suşun her biriyle enfekte ettikten sonra, 50336 Delta micC ile enfekte olmuş farelerin çoğunun, enfeksiyondan 48 saat sonra halsizlik, iştahsızlık veya ishal gösterdiğini ve 96 saat sonra öldüğünü göstermiştir. Vahşi tip suş ve 50336 delta micC pmicC ile enfekte olan fareler, enfeksiyondan 72 saat sonra aynı semptomları gösterdi ve 120 saat sonra öldü.Üç suşun LD 50'leri, mutant 50336 Delta micC'nin virülansının vahşi tipe kıyasla 2.5 kat arttığını gösterdi. Bu teknik, araştırmacıların bakteriyel genlerin işlevini incelemelerine ve hedef genleri silerek istenen mühendislik suşunu elde etmelerine yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...