Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

Denne publikation blev støttet af Award Number K22 CA218462-03 fra NIH National Cancer Institute. HEK293-T-cellerne, der udtrykte R-Spondin1, var en generøs gave fra Dr. Michael P. Verzi.

Alle mus eksperimenter udført, herunder brugen af Tamoxifen og aktiv dødshjælp ved cervikal dislokation, havde godkendelse af den institutionelle Animal Care and Use Udvalg på Stevens Institute of echnology.
1. Mus
BEMÆRK: Produktionen af Smad4f/f; Fremstilling på grund af den anden 1000 og1980'ereog den10. Villin-CreERT2 mus er tidligere blevet beskrevet3. Voksne hunmus melle...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties.">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li><li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium.">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche.">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li><li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage.">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li><li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury.">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li><li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche.">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis.">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li><li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages.">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li><li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc(min)+mice+downstream+of+Wnt+signaling.">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2.">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes.">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding.">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li><li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine.">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).</li><li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm.">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li></ol>

Denne metode kan bekræfte selvfornyelseskapaciteten ved at dedifferentiere villi epitelium, der erhverver stamcellemarkører in vivo. Den normale intestinale epitel kan give anledning til organoider fra krypten, men ikke villi-rummet, når det dyrkes i 3D på grund af tilstedeværelsen af stamceller i krypterne1. Således bekræfter organoid dannelse fra dedifferentiated villi epitel dyrkes i 3D-kulturer stamcelledannelse fra celle skæbne vending. Rapporter om omvendt celle skæbne i ta...

Tarmklypterne, men ikke villi, danner organoider, når de dyrkes i Matrigel eller BME-R1 matrix. Disse organoider er selvorganiserende strukturer, ofte omtalt som "mini-gut" på grund af tilstedeværelsen af de forskellige differentierede slægter, stamfader og stamceller, der er til stede i tarmepilet in vivo. Potentialet til at danne organoider fra krypter tilskrivestilstedeværelsenaf stamceller 1 . Tarm villi på den anden side består kun af differentierede celler, og kan derfor ikke danne organoider. Mutationer2 eller tilstande, der tillader dedifferentiation af villus epitel, kan dog føre til stamceller i villi2,3. Denne skæbneændring, der resulterer i dængle i villi epitelet, kan bekræftes ved at plating den dedifferentierende villus epitel i 3D-matrix for at bestemme deres organoiddannende potentiale som en indikator for de-novo stilk i villus epitel. Derfor er det kritiske aspekt af denne procedure at sikre fravær af kryptforurening.
Smad4KO:β-cateninGOF betingede mutation forårsager dedifferentiation i tarmepilet, der er præget af udtrykket spredning og stamcellemarkører i villien, og til sidst dannelsen af kryptlignende strukturer i villi kaldet ektopiske krypter Tilstedeværelsen af stamceller disse dedifferentierede villi blev bestemt af ekspressionen af stamceller markører i de ektopiske krypter (in vivo) og mutant villiens evne til at danne organoider wh en forgyldt Matrigel3. Nedenstående procedure uddyber den metode, der anvendes til at bekræfte stammen af det dedifferentierende tarmepilet i Smad4KO: β-cateninGOF mutantmus. Et centralt element i denne metode til isolering af villi var brugen af skrabning af tarm lumen, i modsætning til EDTA kelation metode4. I modsætning til EDTA-kelationsmetoden bevarer villi isolation ved skrabning størstedelen af det underliggende mesenchyme og gør det muligt at justere skrabetrykket for at give villi uden tøjrede krypter. Skrabningens tryk er subjektivt for operatøren, og derfor skal det optimale tryk for at give villi uden krypter bundet bestemmes empirisk af operatøren. Det afgørende ved denne procedure er at sikre, at der ikke er tale om kryptforurening ved mikroskopisk undersøgelse af villien både før og efter plating i BME-R1-matrixen.
Intestinal villi skrabes af tarm lumen med glas dias og placeres i en 70 μm filter og vaskes med PBS at slippe af med løse celler eller krypter, hvis nogen, før plating i BME-R1 matrix. Metoden understreger følgende kriterier for at undgå kryptforurening: a) begrænsning af villihøsten den proksimale halvdel af duodenum, hvor villien er længst, b) minimering af antallet af villi-givende skrammer, c) vask af filteret, der indeholder villi gennem en række PBS i en seks-brønds skål, og d) bekræfter fraværet af kryptforurening ved mikroskopisk undersøgelse før og efter plating i BME-R1 matrix. Villi isolation ved skrabning, snarere end ved EDTA kelation, forhindrer det fuldstændige tab af den underliggende mesenchyme, der kan give nichesignaler5,6,7,8, hvis det kræves, for organoid indledning fra villus epitel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

Clonogenicitet af organoider fra tarmepilem tilskrives tilstedeværelsen af stamceller deri. Musens lille tarmepilem er opdelt i krypter og villi: stammen og de spredte celler er begrænset til krypterne, mens villi epitelet kun indeholder differentierede celler. Derfor kan de normale tarmkrypter, men ikke villi, give anledning til organoider i 3D-kulturer. Den procedure, der er beskrevet her, gælder kun for villus epitel under dedifferentiation, der fører til dængle. Den beskrevne metode anvender Smad4-tab-af-funktion:β-catenin gain-of-funktion (Smad4KO:β-cateninGOF)betinget mutant mus. Mutationen får tarm villi til at dedifferentiate og generere stamceller i villi. Intestinal villi under dedifferentiation skrabes af tarmen ved hjælp af glas dias, placeret i en 70 μm si og vaskes flere gange for at filtrere eventuelle løse celler eller krypter før plating i BME-R1 matrix til at bestemme deres organoid-dannende potentiale. To hovedkriterier blev anvendt for at sikre, at de resulterende organoider blev udviklet fra dedifferentierende villus-rum og ikke fra krypterne: 1) mikroskopisk evaluering af den isolerede villi for at sikre fravær af tøjrede krypter, både før og efter plating i 3D-matrixen, og 2) overvågning af tidspunktet for organoidudvikling fra villi. Organoid indledning fra villi forekommer kun to til fem dage efter plating og vises uregelmæssigt formet, mens krypt-afledte organoider fra samme intestinale epitel er synlige inden for seksten timer efter plating og synes sfærisk. Begrænsningen af metoden er imidlertid, at antallet af organoider dannet, og den tid, der kræves for organoid indledning fra villi varierer afhængigt af graden af dedifferentiation. Afhængigt af mutationens specificitet eller den fornærmelse, der forårsager dedifferentiationen, skal det optimale stadium, hvor villi kan høstes for at analysere deres organoiddannende potentiale, derfor bestemmes empirisk.

Den afgørende faktor for procedurens succes er at forhindre kryptforurening. Organoidudvikling fra villien (og ikke fra nogen kontaminerende krypter) sikres ved at bekræfte fire hovedkriterier: 1) at sikre renheden af den høstede villi ved mikroskopisk undersøgelse før og efter plating af villi i BME-R1, 2) plating begrænset antal villi pr. brønd for at muliggøre visualisering af alle de belagt villi individuelt, 3) omitoring af udviklingen af organoid dagligt; billeder af tidskurset viser udviklingen af organoid...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Proceduren beskriver isolering af villi fra musen tarm epitel under dedifferentiation at bestemme deres organoid danner potentiale.

3D Dyrkning af organoider fra Intestinal Villi Epithelium under dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Denne metode kan bekræfte organoid-dannende kapacitet af af-differentiere villi epitelium, der erhverver stamcelle markører in vivo. Indsamlingen af villi udføres via skrabning snarere end EDTA kelationsmetoden, der forhindrer fuldstændig tab af det underliggende mesenchyme, der kan give nichesignalerne, hvis det er nødvendigt for organoidinitiering. Denne metode anvendes i epitelvæv, hvor proliferative og differentierede rum er fysisk afgrænset, og de af-differentierende celler udtrykker stamceller i vivo.Nogle faktorer i denne protokol skal bestemmes empirisk, herunder det optimale stadium for høst af villi og det optimale tryk til skrabning af villi, som vil tage tid og praksis. Fremkalde Smad4 knockout og beta-catenin gevinst af funktion mutation i mutant mus med intraperitoneal injektion af tamoxifen og majsolie i fire på hinanden følgende dage. Efter aflivningen af musen, spray maven med 70% ethanol for at forhindre musepels i at komme ind i bughulen.Åbn bughulen med dissektion saks til at udsætte tarmen og isolere tarmen ved hjælp af saks og sammenkævninger. Dissekere den proksimale halvdel af duodenum, derefter skylle duodenum med fem milliliter iskold PBS i en 10 milliliter sprøjte til at rydde det lysende indhold. Åbn tolvfingertarmen langsgående med en vinklet saks og læg tolvfingertarmen fladt på en 15 centimeter petriskål på is med lumen af tolvfingertarmen overfor operatøren.Før du begynder skrabningen, skal du placere en 70 mikrometer mesh si i en af brøndene på en seks-brønd vævskulturplade. Fyld alle brøndene med fire milliliter 1X PBS og læg pladen på is. Skrab villien ved hjælp af to mikroskopiske glasrutschebaner, den ene til at holde duodenumet nede og den anden til at skrabe.Skrab den lysende side af duodenum overfladisk to gange for at fjerne slim uden at fjerne villi, derefter skrabe duodenum to gange mere for at samle villi på dias uden at binde krypterne. Brug en en milliliter overførsel pipette indeholdende PBS at overføre villi til en 70 mikrometer mesh si i seks-brønd skålen. Saml villi efter hver skrabe.For at fjerne løse krypter skal du vaske den villi, der opsamles med 70 mikrometers si ved at overføre sien gennem en række brønde i den seks brøndede skål, der indeholder fire milliliter iskold PBS pr. Brønd. Ved hjælp af en P1000 pipette overføres villi suspensionen i omkring tre milliliter PBS fra 70 mikrometers si til et nyt 15 milliliterrør på is. Brug en 0,1% BSA-belagt stump-ended P200 pipette tip til at overføre en 50 mikroliter volumen af villi suspension på et glas dias.Tæl antallet af villi i 50 mikroliter dråbe under 4X forstørrelse for at bestemme koncentrationen af villi i PBS suspension og for at bekræfte fraværet af tøjrede krypter. For at plade villi, skal du bruge en 0,1%BSA-belagt P200 stump-ended pipette spids til at overføre villi til en mikrocentrifuge rør for en plating densitet på seks villi per brønd i 12,5 mikroliter af BME-R1 matrix. Drej ned villi i to minutter ved 200 gange G ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten, og gentag centrifugeringen for at fjerne eventuelle resterende PBS. I en laminar flow hætte, genbruge villi pellet forsigtigt i den nødvendige mængde af kolde BME-R1 optøet på is. Ved hjælp af en P20 pipette, plade 12,5 mikroliter af villi i BME-R1 matrix per brønd af en 96-godt U-bund plade forvarmet til 37 grader Celsius.Inkuber pladen i en vævskulturinkubator ved 37 grader Celsius i 15 minutter for at tillade størkning af BME-R1-matrixen. Til hver brønd skal du tilføje 125 mikroliter af forvarmede ENR-medier suppleret som beskrevet i tekstmanuskriptet. Inkubere den belagt villi i en vævskultur inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og ændre medierne hver anden dag.Kassér enhver brønd, hvor organoider vises før to dage. Der er en forskel i udseendet af organoider, der kommer ud af krypterne versus det dedifferentierede villi epitel fra samme musearm. De kryptafledte organoider fremstår natten over som sfæriske strukturer med veldefinerede grænser.Kinetik og morfologiske udseende af de organoider, der blev indledt fra villi, blev undersøgt, som vises uregelmæssigt formet i starten og tager to til fem dage, før de kan ses under et mikroskop. Organoid indledning fra to forskellige villi er vist. Villi med organoiddannende potentiale synes tæt, muligvis på grund af fastholdelsen af det underliggende mesenchyme.Organoid indledning fra villaerne er tydelig på dag to fra en af villi. Mens i de andre villaer, organoid vises på dag fire. Det er afgørende at tage de rigtige skridt til at undgå kryptforurening, når man høster villi og dyrker de resulterende organoider.Fænotypiske forskelle mellem de organoider, der kommer ud af krypter og villi af samme mutant blev observeret efter denne procedure, så yderligere eksperimenter kunne udføres for at lede efter molekylære forskelle mellem de to. Denne protokol kan anvendes til at undersøge forskellene mellem organoider som følge af endogene krypter versus ektopiske krypter som følge af de-differentiering, således implikationer af de-differentiering kunne løses.

Research

JoVE Journal

Biology

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

En 3D-system til dyrkning Menneskelige artikulær chondrocytter i synovialvæske

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokol for Lentiviral transduktion og nedstrøms analyse af Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primære cellekulturer fra mus retinale Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Analyse af oxidativ stress i murintarmorganoider ved hjælp af reaktiv iltartsfølsom fluorogen sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En platform med høj kapacitet til kultur og 3D-billeddannelse af organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablering af 3D endometrieorganoider fra musens livmoder

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kultur af pattegrise Intestinal 3D organoider fra kryopræserverede epitelkrypter og etablering af cellemonolag

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrkning af organoider fra murinale krypter og en enkelt stamcelle til organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

Generering og manipulation af rottetarmorganoider

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

Grundlæggende tredimensionelt (3D) tarmmodelsystem med en immunkomponent

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...