Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
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Cette publication a été soutenue par le numéro de prix K22 CA218462-03 du NIH National Cancer Institute. Les cellules HEK293-T exprimant R-Spondin1 ont été un don généreux du Dr Michael P. Verzi.

Toutes les expériences menées sur des souris, y compris l’utilisation du tamoxifène et l’euthanasie par luxation cervicale, ont reçu l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut d’echnologie Stevens.
1. Souris
NOTE : La génération de Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Des souris Villin-CreERT2 ont déjà été décrites3. Des ...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties.">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li><li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium.">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche.">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li><li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage.">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li><li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury.">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li><li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche.">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis.">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li><li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages.">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li><li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc(min)+mice+downstream+of+Wnt+signaling.">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2.">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes.">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding.">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li><li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine.">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).</li><li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm.">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li></ol>

Cette méthode peut confirmer la capacité d’auto-renouvellement de l’épithélium des villosités dédifférenciantes qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. L’épithélium intestinal normal peut donner naissance à des organoïdes de la crypte mais pas du compartiment des villosités, lorsqu’il est cultivé en 3D en raison de la présence de cellules souches dans les cryptes1. Ainsi, la formation d’organoïdes à partir de l’épithélium des villosités d?...

Les cryptes intestinales, mais pas les villosités, forment des organoïdes lorsqu’elles sont cultivées dans une matrice de Matrigel ou de BME-R1. Ces organoïdes sont des structures auto-organisatrices, souvent appelées « mini-intestin » en raison de la présence des différentes lignées différenciées, progéniteurs et cellules souches présents dans l’épithélium intestinal in vivo. Le potentiel de formation d’organoïdes à partir de cryptes est attribué à la présence de cellules souches1. Les villosités intestinales, d’autre part, ne sont constituées que de cellules différenciées et ne peuvent donc pas former d’organoïdes. Cependant, les mutations2 ou les conditions qui permettent la dédifférenciation de l’épithélium des villosités peuvent conduire à des cellules souches dans lesvillosités 2,3. Ce changement de destin entraînant une tige dans l’épithélium des villosités peut être confirmé en plaquant l’épithélium villositédifférenciant dans une matrice 3D afin de déterminer leur potentiel de formation d’organoïdes comme indicateur de la tige de novo dans l’épithélium villus. Par conséquent, l’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte.
La mutation conditionnelle Smad4KO:β-caténineGOF provoque une dédifférenciation dans l’épithélium intestinal marquée par l’expression de marqueurs de prolifération et de cellules souches dans les villosités, et finalement la formation de structures de type crypte dans les villosités appelées cryptes ectopiques La présence de cellules souches ces villosités dédifférenciées a été déterminée par l’expression de marqueurs de cellules souches dans les cryptes ectopiques(in vivo)et la capacité des villosités mutantes à former des organoïdes wh en plaqué Matrigel3. La procédure mentionnée ci-dessous élabore la méthodologie utilisée pour confirmer la tige de l’épithélium intestinal dédifférenciant chez les souris mutantes Smad4KO:β-caténineGOF. Une caractéristique clé de cette méthodologie pour isoler les villosités était l’utilisation du grattage de la lumière intestinale, par opposition à la méthode de chélation EDTA4. Contrairement à la méthode de chélation EDTA, l’isolement des villosités par grattage conserve la majorité du mésenchyme sous-jacent et permet d’ajuster la pression de grattage pour produire des villosités sans cryptes attachées. La pression de raclage est subjective pour l’opérateur, par conséquent, la pression optimale pour produire des villosités sans cryptes attachées doit être déterminée empiriquement par l’opérateur. L’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte par un examen microscopique des villosités avant et après le placage dans la matrice BME-R1.
Les villosités intestinales sont grattées de la lumière intestinale avec des lames de verre et placées dans un filtre de 70 μm et lavées avec du PBS pour se débarrasser des cellules lâches ou des cryptes, le cas échéant, avant le placage dans la matrice BME-R1. La méthode met l’accent sur les critères suivants pour éviter la contamination des tésiers : a) confiner la récolte des villosités dans la moitié proximale du duodénum où les villosités sont les plus longues, b) minimiser le nombre d’éraflures produisant des villosités, c) laver le filtre contenant les villosités à travers une série de PBS dans une boîte à six puits, et d) confirmer l’absence de contamination des cryptes par un examen microscopique avant et après le placage dans la matrice BME-R1. L’isolement de Villosité par grattage, plutôt que par chélation EDTA, empêche la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche5,6,7,8, si nécessaire, pour l’initiation organoïde de l’épithélium villus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

La clonogénicité des organoïdes de l’épithélium intestinal est attribuée à la présence de cellules souches dans celui-ci. L’épithélium de l’intestin grêle de la souris est compartimenté en cryptes et villosités : la tige et les cellules proliférantes sont confinées dans les cryptes, tandis que l’épithélium des villosités ne contient que des cellules différenciées. Par conséquent, les cryptes intestinales normales, mais pas les villosités, peuvent donner naissance à des organoïdes dans les cultures 3D. La procédure décrite ici ne s’applique qu’à l’épithélium des villosités subissant une dédifférenciation conduisant à la tige. La méthode décrite utilise la souris mutante conditionnelle Smad4-loss-of-function:β-caténine gain-of-function (Smad4KO:β-caténineGOF). La mutation provoque la dédifférenciation des villosités intestinales et la génération de cellules souches dans les villosités. Les villosités intestinales subissant une dédifférenciation sont grattées de l’intestin à l’aide de lames de verre, placées dans une passoire de 70 μm et lavées plusieurs fois pour filtrer les cellules lâches ou les cryptes avant le placage dans la matrice BME-R1 afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde. Deux critères principaux ont été utilisés pour s’assurer que les organoïdes résultants ont été développés à partir du compartiment des villosités dédifférenciantes et non à partir des cryptes: 1) évaluer au microscope les villosités isolées pour s’assurer de l’absence de cryptes attachées, avant et après le placage dans la matrice 3D, et 2) surveiller le déroulement du développement organoïde à partir des villosités. L’initiation organoïde à partir des villosités ne se produit que deux à cinq jours après le placage et semble de forme irrégulière, tandis que les organoïdes dérivés de la crypte du même épithélium intestinal sont apparents dans les seize heures suivant le placage et semblent sphériques. La limite de la méthode, cependant, est que le nombre d’organoïdes formés et le temps nécessaire à l’initiation organoïde à partir des villosités varient en fonction du degré de dédifférenciation. Par conséquent, en fonction de la spécificité de la mutation ou de l’insulte à l’origine de la dédifférenciation, le stade optimal auquel les villosités peuvent être prélevées pour déterminer leur potentiel de formation organoïde doit être déterminé empiriquement.

Le facteur déterminant pour le succès de la procédure est la prévention de la contamination des cryptes. Le développement organoïde à partir des villosités (et non à partir de cryptes contaminantes) est assuré par la confirmation de quatre critères majeurs: 1) assurer la pureté des villosités prélevées par un examen microscopique avant et après le placage des villosités dans BME-R1, 2) placage d’un nombre limité de villosités par puits pour permettre la visualisation de tous les villosités plaquées...

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3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

La procédure décrit l’isolement des villosités de l’épithélium intestinal de la souris subissant une dédifférenciation afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde.

Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Cette méthode peut confirmer la capacité de formation d’organoïdes de dédéliférer l’épithélium des villosités qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. La collecte des villosités est effectuée par grattage plutôt que par la méthode de chélation EDTA empêchant la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche si nécessaire pour l’initiation organoïde. Cette méthode est applicable dans les tissus épithéliaux où les compartiments prolifératifs et différenciés sont physiquement délimités et où les cellules démilinciantes expriment des marqueurs de cellules souches in vivo.Certains facteurs de ce protocole doivent être déterminés empiriquement, y compris l’étape optimale pour la récolte des villosités et la pression optimale pour gratter les villosités, ce qui prendra du temps et de la pratique. Induire le knockout Smad4 et le gain de fonction de la bêta-caténine chez des souris mutantes avec injection intrapéritonéale de tamoxifène et d’huile de maïs pendant quatre jours consécutifs. Après avoir euthanasié la souris, vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour empêcher la fourrure de la souris de pénétrer dans la cavité péritonéale.Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux à dissection pour exposer l’intestin et isolez l’intestin à l’aide de ciseaux et de pinces. Disséquez la moitié proximale du duodénum, puis rincez le duodénum avec cinq millilitres de PBS glacé dans une seringue de 10 millilitres pour éliminer le contenu luminal. Ouvrez le duodénum longitudinalement avec un ciseau incliné et posez le duodénum à plat sur une boîte de Petri de 15 centimètres sur de la glace avec la lumière du duodénum face à l’opérateur.Avant de commencer le raclage, placez une passoire à mailles de 70 micromètres dans l’un des puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits. Remplissez tous les puits avec quatre millilitres de PBS 1X et placez la plaque sur de la glace. Grattez les villosités à l’aide de deux lames de verre microscopiques, l’une pour maintenir le duodénum vers le bas et l’autre pour gratter.Gratter le côté luminal du duodénum superficiellement deux fois pour enlever le mucus sans enlever les villosités, puis gratter le duodénum deux fois de plus pour recueillir les villosités sur les diapositives sans attacher les cryptes. Utilisez une pipette de transfert d’un millilitre contenant du PBS pour transférer les villosités vers une passoire maillée de 70 micromètres dans la parabole à six puits. Ramassez les villosités après chaque éraflure.Pour éliminer les cryptes lâches, lavez les villosités recueillies avec la passoire de 70 micromètres en transférant la passoire à travers une série de puits dans la boîte de six puits contenant quatre millilitres de PBS glacé par puits. À l’aide d’une pipette P1000, transférez la suspension de villosités dans environ trois millilitres de PBS de la crépine de 70 micromètres vers un nouveau tube de 15 millilitres sur glace. Utilisez une pointe de pipette P200 à 0,1 % revêtue de BSA pour transférer un volume de 50 microlitres de la suspension à villosités sur une glissière en verre.Comptez le nombre de villosités dans la gouttelette de 50 microlitres sous grossissement 4X pour déterminer la concentration de villosités dans la suspension PBS et pour confirmer l’absence de cryptes attachées. Pour plaquer les villosités, utilisez une pointe de pipette à extrémité émoussée P200 revêtue de 0,1 % de BSA pour transférer les villosités dans un tube de microcentrifugation pour une densité de placage de six villosités par puits dans 12,5 microlitres de matrice BME-R1. Faites tourner les villosités pendant deux minutes à 200 fois G à quatre degrés Celsius.Retirez le surnageant et répétez la centrifugation pour éliminer tout PBS résiduel. Dans une hotte à écoulement laminaire, remettez ensemisement doucement la pastille dans la quantité requise de BME-R1 froid décongelé sur de la glace. À l’aide d’une pipette P20, plaque 12,5 microlitres des villosités dans la matrice BME-R1 par puits d’une plaque à fond en U de 96 puits préchauffée à 37 degrés Celsius.Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la solidification de la matrice BME-R1. À chaque puits, ajoutez 125 microlitres de supports ENR préchauffés complétés comme décrit dans le manuscrit textuel. Incuber les villosités plaquées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et changer le milieu tous les deux jours.Jetez tout puits dans lequel les organoïdes apparaissent avant deux jours. Il y a une différence dans l’apparence des organoïdes émergeant des cryptes par rapport à l’épithélium des villosités déconiffé différencié du même intestin de souris. Les organoïdes dérivés de la crypte apparaissent du jour au lendemain comme des structures sphériques avec des bordures bien définies.La cinétique et l’aspect morphologique des organoïdes initiés à partir des villosités ont été examinés, qui semblent de forme irrégulière au début et prennent de deux à cinq jours avant de pouvoir être vus au microscope. L’initiation organoïde à partir de deux villosités différentes est montrée. Les villosités ayant un potentiel de formation organoïde semblent denses, peut-être en raison de la rétention du mésenchyme sous-jacent.L’initiation organoïde des villas est apparente au deuxième jour depuis l’un des villosités. Alors que dans les autres villas, l’organoïde apparaît au quatrième jour. Il est crucial de prendre les mesures appropriées pour éviter la contamination des cryptes lors du prélèvement des villosités et de la croissance des organoïdes qui en résultent.Des différences phénotypiques entre les organoïdes émergeant des cryptes et des villosités du même mutant ont été observées à la suite de cette procédure, de sorte que d’autres expériences ont pu être menées pour rechercher des différences moléculaires entre les deux. Ce protocole pourrait être utilisé pour étudier les différences entre les organoïdes issus des cryptes endogènes et les cryptes ectopiques résultant de la dédifférenciation, de sorte que les implications de la dédifférenciation pourraient être abordées.

Research

JoVE Journal

Biology

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Un système 3D pour les chondrocytes articulaires humains Culture dans le liquide synovial

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Recherche

Biologie

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives de l’oxygène

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Culture d’organoïdes 3D intestinaux de porcelet à partir de cryptes épithéliales cryoconservées et établissement de monocouches cellulaires

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...