Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

פרסום זה נתמך על ידי פרס מספר K22 CA218462-03 מהמכון הלאומי לסרטן NIH. תאי HEK293-T המבטאים R-Spondin1 היו מתנה נדיבה מד"ר מייקל פ Verzi.

כל ניסויי העכבר שנערכו, כולל שימוש בטמוקסיפן ובהמתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם, קיבלו את אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון סטיבנס לאכינולוגיה.
1. עכברים
הערה: הדור של Smad4f /f; קאטנבלקס (אקס3)/+; עכברי ויללין-קרERT2 תו...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties.">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li><li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium.">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche.">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li><li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage.">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li><li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury.">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li><li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche.">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis.">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li><li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages.">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li><li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc(min)+mice+downstream+of+Wnt+signaling.">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2.">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes.">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding.">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li><li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine.">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).</li><li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm.">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li></ol>

שיטה זו יכולה לאשר את יכולת ההתחדשות העצמית של אפיתל villi dedifferentiating שרוכשים סמני תאי גזע ב vivo. אפיתל המעיים הרגיל יכול להוליד אורגנוידים מהקריפטה אך לא את תא villi, כאשר תרבית בתלת ממד בגלל נוכחותם של תאי גזע בקריפטות1. לכן, היווצרות organoid מן אפיתל villi מפוזר בתרבית תרביתות 3D מאשר...

קריפטות מעיים אבל לא villi, ליצור organoids כאשר תרבית מטריצת מטריגת מטריגת מטריגת BME-R1. אורגנוידים אלה הם מבנים המארגנים את עצמם, המכונים לעתים קרובות "מיני מעיים" בשל נוכחותם של שושלות שונות, אבות ותאי גזע הנמצאים אפיתל המעי ב vivo. הפוטנציאל ליצור organoids מ קריפטות מיוחס לנוכחות של תאי גזע1. villi המעיים לעומת זאת מורכב רק תאים מובחנים, ולכן לא יכול ליצור organoids. עם זאת, מוטציות 2 אותנאים המאפשרים דיפרנטיציה של אפיתל villus עלול להוביל לתאי גזע villi2,3. שינוי גורל זה וכתוצאה מכך גזענות אפיתל villi יכול להיות מאושר על ידי ציפוי אפיתל villus dedederentiating במטריצה 3D כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם יצירת organoid כאינדיקטור של גזעיות דה נובו אפיתל villus. לפיכך, ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח היעדר זיהום קריפטה.
Smad4KO: מוטציה מותנית β-קטניןGOF גורמת להפיכת האפיתל במעיים המסומנים על ידי ביטוי של סמני התפשטות ותאי גזע בוילי, ובסופו של דבר היווצרות מבנים דמויי קריפטה בוילי המכונה קריפטות חוץ רחמיות נוכחותם של תאי גזע אלה וילי מפוזרים נקבעה על ידי ביטוי של סמני תאי גזע בקריפטות ה חוץ רחמיות (בוויוו) והיכולת של הווילי המוטנטי ליצור אורנואידים wh en plated Matrigel3. הנוהל המוזכר להלן מפרט את המתודולוגיה המשמשת לאישור הגבעול של אפיתל המעיים המשתמט ב- Smad4KO: β עכברי מוטציה מסוג Smad4-cateninGOF. מאפיין מרכזי של מתודולוגיה זו לבידוד villi היה השימוש של גירוד של לומן המעי, בניגוד לשיטת כלציה EDTA4. שלא כמו בשיטת EDTA chelation, בידוד villi על ידי גירוד שומר על רוב mesenchyme הבסיסי ומאפשר להתאים את הלחץ של גירוד כדי להניב villi ללא קריפטות קשורות. הלחץ של גירוד הוא סובייקטיבי למפעיל, ומכאן, הלחץ האופטימלי להניב villi ללא קריפטות קשורות חייב להיקבע אמפירית על ידי המפעיל. ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח את היעדר זיהום הקריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית של villi הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה BME-R1.
villi מעיים הם גירד את לומן המעי עם שקופיות זכוכית להציב מסנן 70 מיקרומטר ונשטף עם PBS כדי להיפטר תאים רופפים או קריפטות, אם בכלל, לפני ציפוי במטריצה BME-R1. השיטה מדגישה את הקריטריונים הבאים כדי למנוע זיהום קריפטה: א) ממזג את הקציר villi החצי הפרוקסימלי של התריסריון שבו villi הם הארוכים ביותר, ב) מזעור מספר שריטות מניב villi, ג) שטיפת המסנן המכיל את villi באמצעות סדרה של PBS בצלחת שש באר, ו- d) המאשר את היעדר זיהום קריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי ציפוי מטריצת BME-R1. בידוד Villi על ידי גירוד, ולא על ידי EDTA chelation, מונע אובדן מוחלט של mesenchyme הבסיסי שעשוי לספק את אותות הנישה5,6,7,8, במידת הצורך, עבור חניכה organoid מן אפיתל villus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

קלוגוגניות של organoids מן האפיתל המעי מיוחסת לנוכחות של תאי גזע בו. האפיתל המעי הקטן של העכבר ממודר לתוך קריפטות ו villi: הגבעול ותאי המתרבים מוגבלים הקריפטות, ואילו אפיתל villi מכיל רק תאים מובחנים. לפיכך, קריפטות מעיים נורמליות, אבל לא villi, יכול להוליד organoids בתרבויות 3D. ההליך המתואר כאן חל רק על אפיתל villus העובר דיפרנציה המובילה לגבעול. השיטה המתוארת משתמשת Smad4-אובדן-פונקציה:β-catenin רווח של פונקציה (Smad4KO:β-cateninGOF) עכבר מוטציה מותנה. המוטציה גורמת לוילי המעיים להשפריץ וליצור תאי גזע בוילי. villi מעיים עוברים דיפרנציה הם גירד את המעי באמצעות שקופיות זכוכית, להציב מסננת 70 מיקרומטר ונשטף מספר פעמים כדי לסנן את כל תאים רופפים או קריפטות לפני ציפוי במטריצה BME-R1 כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם ליצירת organoid. שני קריטריונים עיקריים שימשו כדי להבטיח כי organoids וכתוצאה מכך פותחו מתא villus dedifferentiating ולא מן הקריפטות: 1) הערכה מיקרוסקופית villi מבודד כדי להבטיח היעדר כל קריפטות קשורות, הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה 3D, ו 2) ניטור מסלול הזמן של התפתחות organoid מן villi. חניכת אורגנויד מן villi מתרחשת רק יומיים עד חמישה ימים לאחר ציפוי ונראה בצורה לא סדירה, ואילו organoids נגזר קריפטה מאותו אפיתל מעיים נראים בתוך שש עשרה שעות של ציפוי ונראה כדורי. המגבלה של השיטה, עם זאת, היא כי מספר organoids נוצר, ואת הזמן הנדרש עבור חניכה organoid מן villi להשתנות בהתאם למידת הדיפרנציה. לפיכך, בהתאם לייחודיות המוטציה או העלבון הגורם להשתמטות, יש לקבוע אמפירית את השלב האופטימלי שבו ניתן לקצור את villi כדי לבחון את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.

הגורם הקובע להצלחת ההליך הוא מניעת זיהום קריפטה. התפתחות האורגנויד מן villi (ולא מכל קריפטות מזהמות) מובטחת על ידי אישור ארבעה קריטריונים עיקריים: 1) הבטחת טוהר villi שנקטף על ידי בדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי ציפוי villi ב BME-R1, 2) ציפוי מספר מוגבל של villi לבאר כדי לאפשר הדמיה של כל villi מצופה בנפרד, 3) על ...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

ההליך מתאר בידוד של villi מן אפיתל מעי העכבר עובר דיפרנטיציה כדי לקבוע את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

שיטה זו יכולה לאשר את היכולת להרכיב organoid של אפיתל villi דה-הבחנה לרכוש סמני תאי גזע ב vivo. האוסף של villi מבוצע באמצעות גירוד ולא שיטת EDTA chelation המונע אובדן מוחלט של mesenchyme הבסיסי שעשוי לספק את אותות הנישה במידת הצורך עבור חניכה organoid. שיטה זו ישימה ברקמות אפיתל שבהן תאים מתרבים ומובחנים מוגדרים פיזית והתאים המבדילים מבטאים סמני תאי גזע ב- vivo.כמה גורמים בפרוטוקול זה צריכים להיקבע אמפירית, כולל השלב האופטימלי לקציר את villi ואת הלחץ האופטימלי עבור גירוד villi, אשר ייקח זמן ותרגול. לגרום לנוק-אאוט של Smad4 ולבטא-קטנין להשיג מוטציה בתפקוד בעכברים מוטנטיים עם הזרקה תוך-אינטריטונלית של טמוקסיפן ושמן תירס במשך ארבעה ימים רצופים. לאחר המתת חסד של העכבר, לרסס את הבטן עם 70%אתנול כדי למנוע פרוות העכבר מלהיכנס לחלל הצפק.פתח את חלל הבטן עם מספריים דיסקציה כדי לחשוף את המעי ולבודד את המעי באמצעות מספריים ומלקחיים. לנתח את החצי הפרוקסימלי של התריסריון, ולאחר מכן לשטוף את התריסריון עם חמישה מיליליטר של PBS קר קרח במזרק 10 מיליליטר כדי לנקות את התוכן הזוהר. פתחו את התריסריון לאורך עם מספריים זוויתיים והניחו את התריסריון שטוח על צלחת פטרי באורך 15 ס"מ על קרח עם לומן של התריסריון מול המפעיל.לפני תחילת השריטות, מניחים מסננת רשת 70 מיקרומטר באחת הבארות של צלחת תרבית רקמות של שש בארות. מלאו את כל הבארות בארבעה מיליליטר של PBS 1X ומניחים את הצלחת על קרח. לגרד את villi באמצעות שתי שקופיות זכוכית מיקרוסקופית, אחד להחזיק את התריסריון למטה והשני לגרד.לגרד את הצד הזוהר של התריסריון באופן שטחי פעמיים כדי להסיר את הריר מבלי להסיר את villi, ולאחר מכן לגרד את התריסריון פעמיים נוספות כדי לאסוף את villi על השקופיות מבלי לקשור את הקריפטות. השתמש פיפטה העברה מיליליטר אחד המכיל PBS להעביר את villi למסננת רשת 70 מיקרומטר בצלחת שש טוב. לאסוף את villi אחרי כל שריטה.כדי להסיר קריפטות רופפות, לשטוף את villi שנאסף עם מסננת 70 מיקרומטר על ידי העברת המסננת דרך סדרה של בארות בצלחת שש באר המכיל ארבעה מיליליטר של PBS קר קרח לכל טוב. באמצעות פיפטה P1000, להעביר את השעיית villi בכשלושה מיליליטר של PBS מ מסננת 70 מיקרומטר לצינור חדש 15 מיליליטר על קרח. השתמש 0.1% BSA מצופה קצות פיפטה P200 קצה להעביר נפח 50 microliter של מתלה villi על שקופית זכוכית.לספור את מספר villi בטיפת 50 microliter תחת הגדלה 4X כדי לקבוע את הריכוז של villi בהשעיית PBS ולאשר את היעדר קריפטות קשורות. כדי צלחת villi, להשתמש 0.1% מצופה BSA P200 קצות פיפטה קהה קצה להעביר את villi לצינור microcentrifuge עבור צפיפות ציפוי של שישה villi לבאר ב 12.5 microliters של מטריצת BME-R1. סובבו את הוילי במשך שתי דקות ב-200 פעמים ג'י ב-4 מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ולחזור על centrifugation כדי להסיר כל PBS שיורית. במכסה המנוע של זרימה למינארית, יש להפיץ מחדש את גלולה הווילי בעדינות בכמות הנדרשת של BME-R1 קר המופשר על קרח. באמצעות פיפטת P20, צלחת 12.5 מיקרוליטרים של villi במטריצה BME-R1 לכל באר של צלחת 96 טוב U-תחתון התחמם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.לדגור את הלוח באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר התגבשות של מטריצת BME-R1. לכל באר, הוסף 125 מיקרוליטרים של מדיית ENR מחוממת מראש בתוספת כמתואר בכתב היד של הטקסט. לדגור את villi מצופה באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולשנות את התקשורת כל יומיים.להשליך כל באר שבה organoids מופיעים לפני יומיים. יש הבדל במראה האורגנוידים שיוצאים מהקריפטות לעומת האפיתל של וילי המובחנ מאותו מעי עכבר. האורגנוידים שמקורם בקריפטה מופיעים בן לילה כמבנים כדוריים עם גבולות מוגדרים היטב.הקינטיקה והמראה המורפולוגי של האורגנוידים שיזם מווילי נבדקו, שנראים מעוצבים באופן לא סדיר בהתחלה ולוקח יומיים עד חמישה ימים לפני שניתן לראות אותם תחת מיקרוסקופ. חניכה אורגנויד משני וילילי שונים מוצגת. villi עם פוטנציאל יצירת אורגנויד נראה צפוף, אולי בשל השמירה של mesenchyme הבסיסי.חניכת האורגנויד מהווילות ניכרת ביום השני מאחד הווילי. בעוד בווילות האחרות, האורגנויד מופיע ביום הרביעי. זה חיוני כדי לנקוט את הצעדים הנכונים כדי למנוע זיהום קריפטה בעת קצירת villi וגידול organoids וכתוצאה מכך.הבדלים פנוטיפיים בין האורגנוידים העולים מהקריפטות לבין villi של אותה מוטציה נצפו בעקבות הליך זה, כך שניתן היה לבצע ניסויים נוספים כדי לחפש הבדלים מולקולריים בין השניים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את ההבדלים בין organoids הנובע קריפטות אנדוגני לעומת קריפטות חוץ רחמיות הנובעות דה-בידול, ולכן ניתן לטפל בהשלכות של דה-בידול.

Research

JoVE Journal

Biology

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...