Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

इस प्रकाशन को एनआईएच नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट से पुरस्कार संख्या K22 CA218462-03 द्वारा समर्थित किया गया था । HEK293-T आर-Spondin1 व्यक्त कोशिकाओं डॉ माइकल पी Verzi से एक उदार उपहार था ।

सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा टैमोक्सिफेन और इच्छामृत्यु के उपयोग सहित किए गए सभी माउस प्रयोगों को स्टीवंस इंस्टीट्यूट ऑफ एक्नोलॉजी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति का अनुमोदन मिला था ।
<p class="jove_title...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties.">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li><li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium.">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche.">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li><li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage.">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li><li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury.">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li><li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche.">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis.">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li><li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages.">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li><li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc(min)+mice+downstream+of+Wnt+signaling.">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2.">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes.">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding.">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li><li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine.">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).</li><li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm.">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li></ol>

यह विधि वीवो में स्टेम सेल मार्कर प्राप्त करने वाले विली एपिथेलियम को अलग करने की आत्म-नवीकरण क्षमता की पुष्टि कर सकती है। सामान्य आंतों के एपिथेलियम तहखाने से ऑर्गेनॉइड को जन्म दे सकते हैं, लेकिन ?...

आंतों के क्रिप्ट लेकिन विली नहीं, मैट्रिगेल या बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में सुसंस्कृत होने पर ऑर्गेनॉइड बनाते हैं। ये ऑर्गेनॉइड स्वयं-आयोजन संरचनाएं हैं, जिसे अक्सर वीवोमें आंतों के एपिथेलियम में मौजूद विभिन्न विभेदित वंश, जनक और स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण "मिनी-पेट" के रूप में जाना जाता है। क्रिप्ट्स से ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता का कारण स्टेम सेल की उपस्थिति होती है1. दूसरी ओर आंतों की विली में केवल विभेदित कोशिकाएं शामिल होती हैं, और इसलिए ऑर्गेनॉइड नहीं बन सकते हैं। हालांकि, म्यूटेशन2 या शर्तें जो विलीस एपिथेलियम के विवर्तन की अनुमति देतीहैं,विल्ली2,3में स्टेम सेल का कारण बन सकती हैं। विली एपिथेलियम में स्टेमनेस के परिणामस्वरूप इस भाग्य परिवर्तन की पुष्टि 3 डी मैट्रिक्स में डिफिडेंटिंग विलीनस एपिथेलियम को चढ़ाना द्वारा पुष्टि की जा सकती है ताकि वे विल्लस एपिथेलियम में डी-नोवो स्टेमनेस के संकेतक के रूप में अपने ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता का निर्धारण कर सकें। इसलिए, इस प्रक्रिया का महत्वपूर्ण पहलू क्रिप्टो संदूषण की अनुपस्थिति सुनिश्चित करना है।
Smad4KO:β-cateninGOF सशर्त उत्परिवर्तन विली में प्रसार और स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित आंतों के एपिथेलियम में अलग-अलग कारण बनता है, और अंततः वायली में तहखाना जैसी संरचनाओं का गठन जिसे एक्टोपिक क्रिप्ट्स के रूप में जाना जाता है, स्टेम सेल की उपस्थिति इन अलग विली को एक्टोपिक क्रिप्ट्स(वीवो में) मेंस्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति और उत्परिवर्ती विली की क्षमता ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता द्वारा निर्धारित की गई थी। एन प्लेटेड मैट्रिगेल3. नीचे उल्लिखित प्रक्रिया Smad4KOमें डिफिंग आंतों के एपिथेलियम के स्टेमनेस की पुष्टि करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को विस्तृत करती है: β-cateninGOF उत्परिवर्ती चूहों। विली को अलग-थलग करने के लिए इस पद्धति की एक प्रमुख विशेषता EDTA चेलेशन विधि4के विपरीत आंतों के ल्यूमेन के स्क्रैपिंग का उपयोग था। EDTA चेलेशन विधि के विपरीत, स्क्रैपिंग द्वारा विली अलगाव अंतर्निहित मेसेनचिम के बहुमत को बरकरार रखता है और सीमित क्रिप्ट के बिना विली उपज के लिए स्क्रैपिंग के दबाव को समायोजित करने की अनुमति देता है। स्क्रैपिंग का दबाव ऑपरेटर के लिए व्यक्तिपरक है, इसलिए, क्रिप्ट्स के बिना विली उपज के लिए इष्टतम दबाव ऑपरेटर द्वारा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया का महत्वपूर्ण पहलू बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले और बाद में विली की सूक्ष्म परीक्षा द्वारा तहखाना संदूषण की अनुपस्थिति सुनिश्चित करना है।
आंतों विली को ग्लास स्लाइड के साथ आंतों के ल्यूमेन को स्क्रैप किया जाता है और 70 माइक्रोन फिल्टर में रखा जाता है और ढीली कोशिकाओं या क्रिप्ट्स से छुटकारा पाने के लिए पीबीएस के साथ धोया जाता है, यदि कोई हो, तो बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले। विधि तहखाना संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित मानदंडों पर जोर देती है: ए) विली फसल को डुओडेनम के समीपस्थ आधे हिस्से तक सीमित करना जहां विली सबसे लंबे समय तक हैं, ख) विली-उपज वाले स्क्रैप की संख्या को कम करना, सी) छह-अच्छी डिश में पीबीएस की एक श्रृंखला के माध्यम से विली युक्त फिल्टर को धोना, और डी) बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले और बाद में सूक्ष्म परीक्षा द्वारा तहखाना संदूषण की अनुपस्थिति की पुष्टि करता है। ईडीटीए चेलेशन के बजाय स्क्रैपिंग द्वारा विली अलगाव, अंतर्निहित मेसेनचिम के पूर्ण नुकसान को रोकता है जो विलस एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए आला संकेत5,6,7,8, यदिआवश्यक हो तो प्रदान कर सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

आंतों के एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की क्लोनोजेनिकिटी को उसमें स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। माउस छोटे आंतों के एपिथेलियम को क्रिप्ट्स और विली में विभाजित किया जाता है: स्टेम और प्रसार कोशिकाएं क्रिप्ट तक सीमित होती हैं, जबकि विली एपिथेलियम में केवल विभेदित कोशिकाएं होती हैं। इसलिए, सामान्य आंतों के क्रिप्ट, लेकिन विली नहीं, 3 डी संस्कृतियों में ऑर्गेनॉइड को जन्म दे सकते हैं। यहां वर्णित प्रक्रिया केवल विल्लस एपिथेलियम पर लागू होती है जो विवर्तन के दौर से गुजर रही है जिससे स्टेमनेस होती है। वर्णित विधि Smad4-हानि-समारोह का उपयोग करती है: β-catenin लाभ-समारोह (Smad4KO:β-cateninGOF)सशर्त उत्परिवर्ती माउस । उत्परिवर्तन आंतों विली को डिफरेंट करने और विली में स्टेम सेल उत्पन्न करने का कारण बनता है। आंतों के विली को कांच की स्लाइड का उपयोग करके आंत से स्क्रैप किया जाता है, 70 माइक्रोन छलनी में रखा जाता है और बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले किसी भी ढीली कोशिकाओं या क्रिप्ट्स को फ़िल्टर करने के लिए कई बार धोया जाता है ताकि उनके ऑर्गेनॉइड-बनाने की क्षमता निर्धारित की जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए दो मुख्य मानदंडों का उपयोग किया गया था कि परिणामी ऑर्गेनॉइड को डिफरेंट विलस डिब्बे से विकसित किया गया था न कि क्रिप्ट्स से: 1) 3डी मैट्रिक्स में प्लेटिंग से पहले और बाद में किसी भी सीमित तहखाने की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए अलग विली का मूल्यांकन करना, और 2) विली से ऑर्गेनॉइड विकास के समय की निगरानी करना। विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा चढ़ाना के दो से पांच दिन बाद ही होती है और अनियमित रूप से आकार दिखाई देती है, जबकि एक ही आंतों के एपिथेलियम से क्रिप्टो-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड चढ़ाना के सोलह घंटे के भीतर स्पष्ट होते हैं और गोलाकार दिखाई देते हैं। हालांकि, विधि की सीमा यह है कि ऑर्गेनॉइड की संख्या बनती है, और विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए आवश्यक समय डिफरेंटेशन की डिग्री के आधार पर भिन्न होता है। इसलिए, उत्परिवर्तन की विशिष्टता या अपमान के आधार पर, जिस पर विली को उनके ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता को परखने के लिए काटा जा सकता है, अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

प्रक्रिया की सफलता के लिए निर्धारक कारक तहखाना संदूषण को रोक रहा है। विली से ऑर्गेनॉइड विकास (और किसी भी दूषित क्रिप्ट से नहीं) चार प्रमुख मानदंडों की पुष्टि करके सुनिश्चित किया जाता है: 1) बीएमई-आर 1, 2 मे?...

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3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

प्रक्रिया माउस आंतों के एपिथेलियम से विली के अलगाव का वर्णन करती है जो उनके ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता निर्धारित करने के लिए डिफाइनेशन से गुजर रही है।

आंतों विली एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की 3डी कल्टिंग डिफरेंटेशन से गुजर रही है

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

यह विधि वीवो में स्टेम सेल मार्कर प्राप्त करने वाले विली एपिथेलियम को डी-विभेदित करने की ऑर्गेनॉइड-बनाने की क्षमता की पुष्टि कर सकती है। विली का संग्रह ईडीटीए चेलेशन विधि के बजाय स्क्रैपिंग के माध्यम से किया जाता है जो अंतर्निहित मेसेनचिम के पूर्ण नुकसान को रोकता है जो ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए आवश्यक होने पर आला संकेत प्रदान कर सकता है। यह विधि एपिथेलियल ऊतकों में लागू होती है जहां प्रसारीय और विभेदित डिब्बों को शारीरिक रूप से चित्रित किया जाता है और डी-विभेदित कोशिकाएं वीवो में स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करती हैं।इस प्रोटोकॉल में कुछ कारकों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है, जिसमें विली की कटाई के लिए इष्टतम चरण और विली को स्क्रैप करने के लिए इष्टतम दबाव शामिल है, जिसमें समय और अभ्यास लगेगा। लगातार चार दिनों के लिए टैमोक्सिफेन और मकई के तेल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ उत्परिवर्ती चूहों में समारोह उत्परिवर्तन के Smad4 नॉकआउट और बीटा-catenin लाभ प्रेरित करें। माउस को इच्छामृत्यु के बाद, माउस फर को पेरिटोनियल गुहा में जाने से रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पेट को स्प्रे करें।आंत को बेनकाब करने के लिए विच्छेदन कैंची के साथ पेट की गुहा खोलें और कैंची और संदंश का उपयोग करके आंत को अलग करें। डुओडेनम के समीपस्थ आधे हिस्से को विच्छेदन करें, फिर ल्यूमिनल सामग्री को साफ करने के लिए 10 मिलीलीटर सिरिंज में पांच मिलीलीटर बर्फ ठंडे पीबीएस के साथ डुओडेनम को फ्लश करें। एक कोण कैंची के साथ डुओडेनम को खोलें और ऑपरेटर का सामना कर रहे डुओडेनम के ल्यूमेन के साथ बर्फ पर 15 सेंटीमीटर पेट्री डिश पर डुओडेनम फ्लैट बिछाएं।स्क्रैपिंग शुरू करने से पहले, छह-अच्छी ऊतक संस्कृति प्लेट के कुओं में से एक में 70 माइक्रोमीटर जाल छलनी रखें। 1X PBS के चार मिलीलीटर के साथ सभी कुओं को भरें और बर्फ पर थाली रखें। दो सूक्ष्म ग्लास स्लाइड का उपयोग करके विली को कुरेदें, एक डुओडेनम को नीचे रखने के लिए और दूसरा परिमार्जन करने के लिए।विली को हटाने के बिना बलगम को हटाने के लिए दो बार डुओडेनम के चमकदार पक्ष को कुरेदें, फिर क्रिप्ट्स को सीमित किए बिना स्लाइड्स पर विली इकट्ठा करने के लिए दो बार डुओडेनम को कुरेदें। छह-अच्छी डिश में विली को 70 माइक्रोमीटर जाल छलनी में स्थानांतरित करने के लिए पीबीएस युक्त एक मिलीलीटर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें। हर परिमार्जन के बाद विली लीजिए।ढीले क्रिप्ट्स को हटाने के लिए, छह-अच्छी तरह से डिश में कुओं की एक श्रृंखला के माध्यम से छलनी स्थानांतरित करके 70 माइक्रोमीटर छलनी के साथ एकत्र विली को धोएं जिसमें चार मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस शामिल है। एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, 70 माइक्रोमीटर छलनी से पीबीएस के लगभग तीन मिलीलीटर में विली निलंबन को बर्फ पर एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक ग्लास स्लाइड पर विली निलंबन की 50 माइक्रोलीटर मात्रा स्थानांतरित करने के लिए 0.1% बीएसए-लेपित कुंद-समाप्त P200 पिपेट टिप का उपयोग करें।पीबीएस निलंबन में विली की एकाग्रता निर्धारित करने और सीमित तहखाने की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए 4X आवर्धन के तहत 50 माइक्रोलीटर बूंद में विली की संख्या की गणना करें। विली प्लेट करने के लिए, बीएमई-आर1 मैट्रिक्स के 12.5 माइक्रोलीटर में छह विली प्रति कुएं के प्लेटिंग घनत्व के लिए विली को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 0.1% बीएसए-लेपित P200 कुंद-एंडेड पिपेट टिप का उपयोग करें। चार डिग्री सेल्सियस पर २०० बार जी पर दो मिनट के लिए विली नीचे स्पिन ।सुपरनेट निकालें और किसी भी अवशिष्ट पीबीएस को हटाने के लिए अपकेंद्री दोहराएं। एक लैमिनार फ्लो हुड में, बर्फ पर ठंडे बीएमई-आर1 की आवश्यक मात्रा में विली पेलेट को धीरे-धीरे फिर से खर्च करें। एक P20 पिपेट का उपयोग करना, बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में विली के १२.५ माइक्रोलीटर की थाली एक ९६-अच्छी तरह से यू-तली प्लेट पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम की प्रति अच्छी तरह से ।बीएमई-आर1 मैट्रिक्स के ठोसकरण की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें। प्रत्येक अच्छी तरह से, पाठ पांडुलिपि में वर्णित पूर्व-गर्म एनआर मीडिया के 125 माइक्रोलीटर जोड़ें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में चढ़ाया विली इनक्यूबेट और हर दूसरे दिन मीडिया बदल जाते हैं।किसी भी कुएं को छोड़ दें जिसमें ऑर्गेनॉइड दो दिनों से पहले दिखाई देते हैं। एक ही माउस आंत से डी-विभेदित विली एपिथेलियम बनाम क्रिप्ट्स से उभरने वाले ऑर्गेनॉइड की उपस्थिति में अंतर है। क्रिप्टो-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड अच्छी तरह से परिभाषित सीमाओं के साथ गोलाकार संरचनाओं के रूप में रातोंरात दिखाई देते हैं।विली से शुरू किए गए ऑर्गेनॉइड की काइनेटिक्स और रूपात्मक उपस्थिति की जांच की गई थी, जो पहले अनियमित रूप से आकार के दिखाई देते हैं और माइक्रोस्कोप के नीचे देखे जाने से पहले दो से पांच दिन लगते हैं। दो अलग-अलग विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा दिखाई जाती है। ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता के साथ विली घने दिखाई देती है, संभवतः अंतर्निहित मेसेनचिम की अवधारण के कारण।विला से ऑर्गेनॉइड दीक्षा विली में से एक से दो दिन में स्पष्ट है। जबकि अन्य विला में, ऑर्गेनॉइड चार दिन में दिखाई देता है। विली की कटाई और परिणामस्वरूप ऑर्गेनॉइड बढ़ने पर क्रिप्ट संदूषण से बचने के लिए उचित कदम उठाना महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया के बाद एक ही उत्परिवर्ती के क्रिप्ट और विली से उभरने वाले ऑर्गेनॉइड के बीच फेनोटाइपिक मतभेद देखे गए थे, इसलिए दोनों के बीच आणविक मतभेदों को देखने के लिए आगे प्रयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अंतर्जात क्रिप्ट्स बनाम एक्टोपिक क्रिप्ट्स से उत्पन्न होने वाले ऑर्गेनॉइड के बीच मतभेदों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार डी-विभेदन के निहितार्थों को संबोधित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

श्लेष द्रव में एक संवर्धन मानव जोड़ chondrocytes के लिए 3 डी सिस्टम

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Lentiviral पारगमन और आंतों Organoids के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

माउस रेटिना वर्णक उपकला से प्राथमिक सेल संस्कृतियों

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों-संवेदनशील फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग करके मुरीन आंतों के ऑर्गेनोइड्स में ऑक्सीडेटिव तनाव का विश्लेषण करना

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और 3 डी इमेजिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

माउस गर्भाशय से 3 डी एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स की स्थापना

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से पिगलेट इंटेस्टाइनल 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और सेल मोनोलेयर की स्थापना

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

मुराइन इंटेस्टाइनल क्रिप्ट्स से ऑर्गेनोइड्स की 3 डी खेती और ऑर्गेनॉइड रिसर्च के लिए एक एकल स्टेम सेल

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

चूहे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन और हेरफेर

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

एक प्रतिरक्षा घटक के साथ बुनियादी तीन आयामी (3 डी) आंतों के मॉडल प्रणाली

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...