Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

本書は、NIH国立がん研究所の賞番号K22 CA218462-03によって支援されました。R-Spondin1を発現するHEK293-T細胞は、マイケル・P・ヴェルジ博士からの寛大な贈り物でした。

子宮頸部脱臼によるタモキシフェンと安楽死の使用を含むすべてのマウス実験は、スティーブンスechnology研究所の制度的動物ケアおよび使用委員会の承認を得た。
1. マウス
メモ: Smad4f/fの生成;キャットンブ・ロクス(ex3)/+;ヴィリン・クレERT2 マウスは、以前に説明されている3.8~12週齢の成...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties.">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li><li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium.">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche.">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li><li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage.">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li><li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury.">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li><li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche.">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis.">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li><li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages.">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li><li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc(min)+mice+downstream+of+Wnt+signaling.">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2.">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes.">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding.">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li><li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine.">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).</li><li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm.">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li></ol>

この方法は、生体内で幹細胞マーカーを取得する不分化ビリ上皮の自己再生能力を確認できる。正常な腸上皮は、陰窩内に幹細胞が存在するため3Dで培養した場合、陰窩からオルガノイドを生じさせることができるが、絨毛コンパートメントからは生じることができない。したがって、3D培養で培養したデファノイド絨毛上皮からオルガノイド形成は、細胞運命逆転か...

腸内の納骨堂は絨毛ではなく、マトリゲルまたはBME-R1マトリックスで培養するとオルガノイドを形成する。これらのオルガノイドは自己組織化構造であり、生体内の腸上皮に存在する種々の分化系統、前駆細胞、および幹細胞の存在に起因してしばしば「ミニ腸」と呼ばれる。クリプトからオルガノイドを形成する可能性は、幹細胞1の存在に起因する。一方、腸内絨毛は分化した細胞のみで構成されており、オルガノイドを形成することはできません。しかし、突然変異2または絨毛上皮の脱分化を可能にする条件は、絨毛2、3の幹細胞を引き起こし得る。この絨毛上皮の幹形成をもたらすこの運命変化は、3Dマトリックスで脱分性性のヴィルス上皮をめっきし、絨毛上皮における脱ノボ茎の指標としてそのオルガノイド形成電位を決定することによって確認することができる。したがって、この手順の重要な側面は、暗号汚染の欠如を確実にすることです。
Smad4KO:β-カテニンGOF 条件突然変異は、絨毛における増殖および幹細胞マーカーの発現によって特徴づけられる腸上皮における脱分化を引き起こす、 そして最終的に異所性陰窩と呼ばれる絨毛の陰窩様構造の形成 これらの分化された絨毛は、異所性の陰窩(in vivo)における幹細胞マーカーの発現と、オルガノイドwhを形成する変異絨毛の能力によって決定されたエンメッキマトリゲル3.以下に挙げた手順は、Smad4KOにおける腸上皮の変性性を確認するために用いられる方法論を詳述する:β-カテニンGOF 変異マウス。絨毛を単離するためのこの方法論の主な特徴は、EDTAキレート法4とは対照的に、腸管腔の掻き取りの使用であった。EDTAキレート法とは異なり、掻き取りによる絨毛分離は、基礎となる間質の大部分を保持し、つながれた納骨堂なしで絨毛を生み出すために擦り傷の圧力を調整することを可能にする。削りの圧力はオペレータに主観的であるため、納骨堂なしで絨毛を生み出す最適な圧力は、オペレータによって経験的に決定されなければならない。この手順の重要な側面は、BME-R1マトリックスでめっき前後の絨毛の顕微鏡検査による暗号汚染の欠如を確実にすることです。
腸絨毛は、ガラススライドで腸内腔を削り取り、70μmのフィルターに入れ、PBSで洗浄して、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを取り除きます。この方法は、クリリが最も長い十二指腸の近位半分を収穫する絨毛を閉じ込め、b)絨毛を収穫するスクラップの数を最小限に抑え、c)6ウェル皿の中で一連のPBSを通して絨毛を含むフィルターを洗浄し、d)顕微鏡検査前およびRMEマトリックスの後にクリプト汚染の欠如を確認する。EDTAキレートではなく擦り傷によるVilli単離は、必要に応じて、絨毛上皮からのオルガノイド開始のためのニッチ信号5、6、7、8を提供し得る根底の間質の完全な損失を防ぐ。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

腸上皮由来のオルガノイドのクロノジェニック性は、その中に幹細胞が存在することに起因する。マウスの小腸上皮は、陰窩および絨毛に区分される:茎および増殖細胞は、陰窩に閉じ込められるのに対し、絨毛上皮は分化した細胞のみを含む。したがって、正常な腸内窩は、絨毛ではなく、3D培養でオルガノイドを生じさせることができる。ここで説明する手順は、茎につながる脱分化を受けているvillus上皮にのみ適用可能である。記載された方法は、Smad4-機能喪失:β-カテニン機能の利得(Smad4KO:β-カテニンGOF)条件変異マウスを使用する。この突然変異は、腸内絨毛を分解し、絨毛内に幹細胞を生成させる。脱分化を受けた腸絨毛は、ガラススライドを使用して腸から掻き取られ、70μmのストレーナーに入れられ、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを濾過してオルガノイド形成の可能性を決定するために数回洗浄される。得られたオルガノイドが、3Dマトリックスでめっきする前後の両方で、単一の絨毛の欠如を確実にするために、分離された絨毛を顕微鏡的に評価し、絨毛からのオルガノイド発達の時間経過を監視する2つの主な基準を使用した。絨毛からのオルガノイド開始は、めっき後2〜5日後に起こり、不規則な形で現れるのに対し、同じ腸上皮由来の陰窩由来のオルガノイドはめっきの16時間以内に明らかであり、球状に見える。しかし、この方法の制限は、オルガノイドが形成される数、およびビリからのオルガノイド開始に要する時間が、脱分化の程度によって異なるためである。したがって、変異の特異性または脱分性を引き起こす侮辱に応じて、ビリがそれらのオルガノイド形成電位をアッセイするために収穫できる最適な段階は、経験的に決定されなければならない。

手順の成功の決定要因は、暗号汚染を防ぐことです。ビリ(および汚染された納骨堂からではない)からのオルガノイドの開発は、4つの主要な基準を確認することによって保証される:1)BME-R1で絨毛をめっきする前後の顕微鏡検査によって収穫された絨毛の純度を確保する、2)すべてのメッキ絨毛を個別に視覚化できるように、十分に限られた数の絨毛をめっきするタイムコースの画像は、絨毛(<...

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3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

この手順は、脱分化を受けているマウス腸管上皮からの絨毛の分離を記述し、そのオルガノイド形成電位を決定する。

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

この方法は、生体内で幹細胞マーカーを取得する脱分化ビリ上皮のオルガノイド形成能を確認できる。絨毛の収集は、オルガノイド開始に必要な場合にニッチ信号を提供し得る根底の間分関係の完全な損失を防ぐEDTAキレート法ではなく、擦り傷を介して行われる。この方法は、増殖および分化された区画が物理的に線引きされ、脱分化細胞が生体内で幹細胞マーカーを発現する上皮組織に適用可能である。このプロトコルのいくつかの要因は、絨毛を収穫するための最適な段階と、時間と練習を要する絨毛を削るための最適な圧力を含め、経験的に決定する必要があります。4日間連続してタモキシフェンとトウモロコシ油の腹腔内注射を行った変異マウスの機能変異のSmad4ノックアウトおよびβ-カテニンのゲインを誘導する。マウスを安楽死させた後、腹部に70%エタノールを吹き付けて、マウスの毛皮が腹腔に入るのを防ぎます。解剖はさみで腹腔を開いて腸を露出させ、はさみと鉗子を使って腸を単離する。十二指腸の近位半分を解剖し、その後、10ミリリットルの注射器で氷冷PBSの5ミリリットルで十二指腸を洗い流し、発光含有量をクリアする。斜めのはさみで縦方向に十二指腸を開き、十二指腸の内腔がオペレータに向いている氷の上に15センチメートルのペトリ皿の上に平らに十二指腸を置きます。削り始める前に、6ウェル組織培養プレートのウェルの1つに70マイクロメートルのメッシュストレーナーを置きます。すべての井戸を1X PBSの4ミリリットルで満たし、プレートを氷の上に置きます。2つの顕微鏡的なガラススライドを使用して絨毛を削り、1つは十二指腸を下に保持し、もう1つは擦り傷を付けます。十二指腸の明るい側を表面的に2回削り、絨毛を取り除かずに粘液を取り除き、十二指腸をさらに2回削り、納骨堂をテザリングすることなくスライド上の絨毛を収集する。PBSを含む1ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、6ウェル皿の70マイクロメートルメッシュストレーナーに絨毛を移します。すべての擦り傷の後に絨毛を収集します。緩い納骨堂を取り除くために、1ウェルあたり4ミリリットルの氷冷PBSを含む6ウェル皿の一連の井戸を通してストレーナーを移すことによって、70マイクロメートルのストレーナーで収集した絨毛を洗います。P1000ピペットを使用して、70マイクロメートルストレーナーから氷上の新しい15ミリリットルチューブにPBSの約3ミリリットルで絨毛懸濁液を移します。0.1%BSAコーティングの鈍い終わりP200ピペットの先端を使用して、絨毛懸濁液の50マイクロリットルの体積をガラススライドに移します。4X倍率の50マイクロリットルの液滴中の絨毛の数を数えて、PBS懸濁液中の絨毛の濃度を決定し、つながれた納骨堂の欠如を確認する。絨毛をプレートするには、0.1%BSAコーティングP200鈍エンドピペットチップを使用して、BME-R1マトリックスの12.5マイクロリットルで6絨毛のメッキ密度のためにマイクロ遠心チューブに絨毛を移します。4°Cで200倍Gで2分間ビリをスピンダウンします。上清を取り除き、遠心分離を繰り返して残留PBSを除去します。ラミナールフローフードで、氷の上で解凍した冷たいBME-R1の必要量にそっと絨毛ペレットを再懸濁します。P20ピペットを使用して、BME-R1マトリックスの絨毛のプレート12.5マイクロリットルを摂氏37度に予め温めた96ウェルU底板のウェルあたり。BME-R1マトリックスを固化できるように、37°Cの組織培養インキュベーターで15分間プレートをインキュベートします。各井戸に、テキスト原稿に記載されているように補足される125マイクロリットルの温め前のENR培地を加える。5%の二酸化炭素で摂氏37度の組織培養インキュベーターにめっき絨毛をインキュベートし、一日おきに培地を交換します。オルガノイドが2日前に現れる井戸を捨てる。同じマウス腸から脱分化された絨毛上皮と陰窩から出現するオルガノイドの外観に違いがある。暗号由来オルガノイドは、明確に定義された境界を持つ球状の構造として一晩現れる。絨毛から始まったオルガノイドの運動学的および形態学的外観を調べ、最初は不規則な形で見え、顕微鏡下で見られるまでに2〜5日かかる。2つの異なる絨毛からのオルガノイド開始が示されている。オルガノイド形成電位を有する絨毛は、おそらく基礎となる間質の保持のために、緻密に見える。ヴィラからのオルガノイド開始は、絨毛の1つから2日目に明らかです。他のヴィラにいる間、オルガノイドは4日目に現れます。絨毛を収穫し、得られたオルガノイドを成長させるときには、暗号汚染を避けるために適切な措置を講じる必要があります。同じ変異体の暗号と絨毛から出現するオルガノイドとの間に生まれる有機体の間のフェノイドの違いは、この手順に従って観察されたので、両者の分子差を探すためにさらなる実験を行うことができる。このプロトコルは、分化解除から生じる内在性の暗号と異所性の納骨堂から生じるオルガノイドの違いを研究するために使用することができ、したがって、脱分化の影響に対処することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

マウス子宮からの3D子宮内膜オルガノイドの確立

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

免疫成分を用いた基本的な3次元(3D)腸管モデルシステム

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...