Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

Denne publikasjonen ble støttet av Pris nummer K22 CA218462-03 fra NIH National Cancer Institute. HEK293-T-cellene som uttrykte R-Spondin1 var en sjenerøs gave fra Dr. Michael P. Verzi.

Alle museeksperimentene som ble utført, inkludert bruk av Tamoxifen og eutanasi ved cervical dislokasjon, hadde godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Stevens Institute of echnology.
1. Mus
MERK: Generasjonen Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 mus har tidligere blitt beskrevet3. Voksne kvinnelige mus mellom åtte til tolv uker ble brukt.
<ol><li>...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties.">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li><li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium.">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche.">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li><li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage.">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li><li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury.">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li><li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche.">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis.">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li><li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages.">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li><li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc(min)+mice+downstream+of+Wnt+signaling.">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2.">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes.">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding.">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li><li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine.">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).</li><li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm.">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li></ol>

Denne metoden kan bekrefte selvfornyelseskapasiteten til dedifferensierende villi epitel som får stamcellemarkører in vivo. Det normale intestinale epitelet kan gi opphav til organoider fra krypten, men ikke villi-rommet, når det dyrkes i 3D på grunn av tilstedeværelsen av stamceller i kryptene1. Dermed bekrefter organoiddannelse fra dedifferensiert villi epitel dyrket i 3D-kulturer stamcelledannelse fra celle skjebne reversering. Rapporter om celle skjebne reversering i tarm epitele...

Tarmen krypter, men ikke villi, danner organoider når de dyrkes i Matrigel eller BME-R1 matrise. Disse organoidene er selvorganiserende strukturer, ofte referert til som "mini-gut" på grunn av tilstedeværelsen av de forskjellige differensierte avstamninger, forfedre og stamceller som er tilstede i tarmepitelet in vivo. Potensialet til å danne organoider fra krypter tilskrives tilstedeværelsen av stamceller1. Intestinal villi derimot består bare av differensierte celler, og kan derfor ikke danne organoider. Mutasjoner2 eller tilstander som tillater dedifferensiering av villus epitelet kan imidlertid føre til stamceller i villi2,3. Denne skjebneendringen som resulterer i stemness i villi epitelet kan bekreftes ved å plating dedifferentiating villus epitel i 3D matrise for å bestemme deres organoid-forming potensial som en indikator på de-novo stemness i villus epitel. Derfor er det kritiske aspektet ved denne prosedyren å sikre fravær av kryptforurensning.
Smad4KO:β-cateninGOF betinget mutasjon forårsaker dedifferensiering i tarmepitelet preget av uttrykket av spredning og stamcellemarkører i villi, og til slutt dannelsen av kryptlignende strukturer i villi referert til som ektopiske krypter Tilstedeværelsen av stamceller disse dedifferensierte villi ble bestemt av uttrykket av stamcellemarkører i ektopkryptene (in vivo) og mutant villiens evne til å danne organoider wh innbelagt Matrigel3. Den nedenfor nevnte prosedyren utdyper metodikken som brukes til å bekrefte stemness av dedifferentiating intestinal epitel i Smad4KO:β-cateninGOF mutant mus. Et sentralt trekk ved denne metoden for å isolere villi var bruken av skraping av tarmlumen, i motsetning til EDTA-chelasjonsmetoden4. I motsetning til i EDTA-chelasjonsmetoden beholder villi-isolasjon ved skraping mesteparten av det underliggende mesenchymet og gjør det mulig å justere skrapetrykket for å gi villi uten bundet krypter. Skrapetrykket er subjektivt for operatøren, derfor må det optimale trykket for å gi villi uten krypter bundet bestemmes empirisk av operatøren. Det kritiske aspektet ved denne prosedyren er å sikre fravær av kryptforurensning ved mikroskopisk undersøkelse av villi både før og etter plating i BME-R1-matrisen.
Intestinal villi skrapes av tarmlumen med glasssklier og plasseres i et 70 μm filter og vaskes med PBS for å kvitte seg med løse celler eller krypter, om noen, før plating i BME-R1 matrise. Metoden understreker følgende kriterier for å unngå kryptforurensning: a) begrense villi høste den proksimale halvdelen av tolvfingertarmen der villi er den lengste, b) minimere antall villi-yielding skraper, c) vaske filteret som inneholder villi gjennom en rekke PBS i en seks-brønns tallerken, og d) bekrefter fraværet av kryptforurensning ved mikroskopisk undersøkelse før og etter plating i BME-R1 matrise. Villi isolasjon ved skraping, i stedet for ved EDTA chelation, forhindrer fullstendig tap av underliggende mesenchyme som kan gi nisjesignalene5,6,7,8, om nødvendig, for organoid initiering fra villus epitelet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

Clonogenicity av organoider fra tarmepitelet tilskrives tilstedeværelsen av stamceller der. Musen liten intestinal epitel er delt inn i krypter og villi: stammen og spredningscellene er begrenset til kryptene, mens villi epitelet bare inneholder differensierte celler. Derfor kan de normale tarmkryptene, men ikke villi, gi opphav til organoider i 3D-kulturer. Prosedyren beskrevet her gjelder bare for villus epitel som gjennomgår dedifferentiation som fører til stemness. Metoden som er beskrevet, bruker den betingede mutantmusen Smad β 4KO:β-cateninGOF). Mutasjonen får tarm villi til å dedifferentiate og generere stamceller i villi. Intestinal villi gjennomgår dedifferentiation skrapes av tarmen ved hjelp av glass lysbilder, plassert i en 70 μm sil og vasket flere ganger for å filtrere ut eventuelle løse celler eller krypter før plating i BME-R1 matrise for å bestemme deres organoid-forming potensial. To hovedkriterier ble brukt for å sikre at de resulterende organoidene ble utviklet fra det dedifferensierende villusrommet og ikke fra kryptene: 1) mikroskopisk evaluering av den isolerte villi for å sikre fravær av tethered krypter, både før og etter plating i 3D-matrisen, og 2) overvåking av tidsforløpet for organoidutvikling fra villi. Organoid initiering fra villi oppstår bare to til fem dager etter plating og vises uregelmessig formet, mens krypt-avledede organoider fra samme intestinale epitel er tydelige innen seksten timer etter plating og virker sfæriske. Begrensningen av metoden er imidlertid at antall organoider dannet, og tiden som kreves for organoid initiering fra villi varierer avhengig av graden av dedifferensiering. Derfor, avhengig av mutasjonens spesifisitet eller fornærmelsen som forårsaker dedifferensiering, må det optimale stadiet der villi kan høstes for å analyse deres organoide formingspotensial, bestemmes empirisk.

Den avgjørende faktoren for prosedyrens suksess forhindrer kryptforurensning. Organoid utvikling fra villi (og ikke fra noen forurensende krypter) sikres ved å bekrefte fire store kriterier: 1) sikre renheten av høstet villi ved mikroskopisk undersøkelse før og etter plating villi i BME-R1, 2) plating begrenset antall villi per brønn for å tillate visualisering av alle belagte villi individuelt, 3) på for å sikre utvikling av organoid daglig; bilder av tidsforløpet viser utvikling av organoider fra villi (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Prosedyren beskriver isolasjon av villi fra musen intestinal epitel gjennomgår dedifferentiation for å bestemme deres organoid forming potensial.

3D Culturing av organoider fra Intestinal Villi Epithelium Gjennomgår Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Denne metoden kan bekrefte den organoiddannende kapasiteten til avdifferensierende villi epitel som får stamcellemarkører in vivo. Samlingen av villi utføres via skraping i stedet for EDTA-chelation-metoden som forhindrer fullstendig tap av det underliggende mesenchymet som kan gi nisjesignalene hvis det kreves for organoid initiering. Denne metoden gjelder i epitelvev der proliferative og differensierte rom er fysisk avgrenset og de avdifferensierende cellene uttrykker stamcellemarkører in vivo.Noen faktorer i denne protokollen må bestemmes empirisk, inkludert det optimale stadiet for høsting av villi og det optimale trykket for skraping av villi, noe som vil ta tid og praksis. Induser Smad4 knockout og beta-catenin gevinst av funksjon mutasjon i mutant mus med intraperitoneal injeksjon av tamoxifen og maisolje i fire påfølgende dager. Etter å ha euthanizing musen, spray magen med 70% etanol for å forhindre at musepels kommer inn i bukhulen.Åpne bukhulen med disseksjonssaks for å eksponere tarmen og isolere tarmen ved hjelp av saks og tang. Disseker ut den proksimale halvdelen av tolvfingertarmen, og skyll deretter tolvfingertarmen med fem milliliter iskald PBS i en 10 milliliter sprøyte for å fjerne lysinnholdet. Åpne tolvfingertarmen med en vinklet saks og legg tolvfingertarmen flatt på en 15 centimeter Petri-tallerken på is med lumen på tolvfingertarmen vendt mot operatøren.Før du begynner å skrape, plasser en 70 mikrometer maskesil i en av brønnene til en seksbrønns vevskulturplate. Fyll alle brønnene med fire milliliter 1X PBS og legg platen på is. Skrap villi ved hjelp av to mikroskopiske glasssklier, den ene for å holde tolvfingertarmen nede og den andre for å skrape.Skrap lyssiden av tolvfingertarmen overfladisk to ganger for å fjerne slimet uten å fjerne villi, og skrap deretter tolvfingertarmen to ganger til for å samle villi på lysbildene uten å tethering kryptene. Bruk en en milliliter overføring pipette som inneholder PBS for å overføre villi til en 70 mikrometer mesh sil i seks-brønns parabolen. Samle villi etter hver skrape.For å fjerne løse krypter, vask villi samlet med 70 mikrometer silen ved å overføre silen gjennom en rekke brønner i seksbrønnsfatet som inneholder fire milliliter iskald PBS per brønn. Bruk en P1000 pipette, overfør villi-suspensjonen i omtrent tre milliliter PBS fra 70 mikrometer silen til et nytt 15 milliliterrør på is. Bruk en 0,1%BSA-belagt, stump-endet P200 pipettespiss til å overføre et 50 mikrolitervolum av villi-suspensjonen til et glasssklie.Tell antall villi i 50 mikroliterdråpen under 4X forstørrelse for å bestemme konsentrasjonen av villi i PBS-suspensjonen og for å bekrefte fraværet av tethered krypter. For å plate villi, bruk en 0,1% BSA-belagt P200 blunt-ended pipettespiss for å overføre villi til et mikrocentrifuge rør for en plating tetthet på seks villi per brønn i 12,5 mikroliter BME-R1 matrise. Spinn ned villi i to minutter ved 200 ganger G ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten og gjenta sentrifugeringen for å fjerne eventuell gjenværende PBS. I en laminær strømningshette, resuspend villi pellet forsiktig i den nødvendige mengden kald BME-R1 tint på is. Ved hjelp av en P20 pipette ble plate 12,5 mikroliter av villi i BME-R1-matrise per brønn av en 96-brønns U-bunnet plate forhåndsvarmet til 37 grader Celsius.Inkuber platen i en vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius i 15 minutter for å tillate størkning av BME-R1-matrisen. Til hver brønn legger du til 125 mikroliter forhåndsvarmede ENR-medier supplert som beskrevet i tekstmanuskriptet. Inkuber den belagte villi i en vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og bytt media annenhver dag.Kast bort brønner der organoider vises før to dager. Det er en forskjell i utseendet på organoidene som kommer fra kryptene kontra det de-differensierte villi-epitelet fra samme musetarm. De krypt-avledede organoidene vises over natten som sfæriske strukturer med veldefinerte grenser.Kinetikken og morfologiske utseendet til organoidene initiert fra villi ble undersøkt, som vises uregelmessig formet i begynnelsen og tar to til fem dager før de kan ses under et mikroskop. Organoid initiering fra to forskjellige villi er vist. Villi med organoiddannende potensial virker tett, muligens på grunn av oppbevaring av det underliggende mesenchymet.Organoid initiering fra villaene er tydelig på dag to fra en av villi. Mens du er i de andre villaene, vises organoiden på dag fire. Det er viktig å ta de riktige skrittene for å unngå kryptforurensning når du høster villi og vokser de resulterende organoidene.Fenotypiske forskjeller mellom organoidene som kommer fra kryptene og villi av samme mutant ble observert etter denne prosedyren, slik at ytterligere eksperimentering kunne utføres for å lete etter molekylære forskjeller mellom de to. Denne protokollen kan brukes til å studere forskjellene mellom organoider som oppstår fra endogene krypter versus ektopkrypter som oppstår ved avdifferensiering, og dermed kan implikasjoner av de-differensiering adresseres.

Research

JoVE Journal

Biology

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

En 3D System for dyrking Menneskelig artikulære chondrocytes i synovialvæsken

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokoll for Lentiviral Transduksjon og Nedstrøms Analyse av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primært cellekulturer fra musen netthinnens Pigment epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Analysere oksidativt stress i murine intestinale organoider ved hjelp av reaktive oksygenarter-sensitiv fluorogen sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med høy gjennomstrømning for kultur og 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablering av 3D Endometrial Organoids fra Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kultur av Piglet Intestinal 3D Organoids fra kryopreserverte epitelkrypter og etablering av cellemonolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrking av organoider fra murintestinale krypter og en enkelt stamcelle for organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

Generering og manipulering av tarmorganoider fra rotter

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

Grunnleggende tredimensjonalt (3D) tarmmodellsystem med en immunkomponent

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...