Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
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Esta publicación fue apoyada por el Premio Número K22 CA218462-03 del Instituto Nacional del Cáncer de los NIH. Las células HEK293-T que expresan R-Spondin1 fueron un generoso regalo del Dr. Michael P. Verzi.

Todos los experimentos con ratones realizados, incluido el uso de tamoxifeno y la eutanasia por luxación cervical, tuvieron la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto Stevens de equinología.
1. Ratones
NOTA: La generación de Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Los ratones Villin-CreERT2 han sido descritos previamente3. Se utilizaron ratones hembr...

<ol>
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Este método puede confirmar la capacidad de autorrenovación de las vellosidades desdiferenciadoras del epitelio que adquieren marcadores de células madre in vivo. El epitelio intestinal normal puede dar lugar a organoides de la cripta pero no del compartimento de vellosidades, cuando se cultiva en 3D debido a la presencia de células madre en las criptas1. Por lo tanto, la formación de organoides a partir del epitelio de vellosidades desdiferenciadas cultivadas en cultivos 3D confirma...

Las criptas intestinales, pero no las vellosidades, forman organoides cuando se cultivan en matriz Matrigel o BME-R1. Estos organoides son estructuras autoorganizadas, a menudo denominadas "mini-intestino" debido a la presencia de los diversos linajes diferenciados, progenitores y células madre presentes en el epitelio intestinal in vivo. El potencial para formar organoides a partir de criptas se atribuye a la presencia de células madre1. Las vellosidades intestinales, por otro lado, consisten solo en células diferenciadas y, por lo tanto, no pueden formar organoides. Sin embargo, las mutaciones2 o condiciones que permiten la desdiferenciación del epitelio de las vellosidades pueden conducir a células madre en las vellosidades2,3. Este cambio de destino que resulta en el tallo en el epitelio de las vellosidades se puede confirmar mediante el recubrimiento del epitelio de vellosidad desdiferenciante en la matriz 3D para determinar su potencial de formación de organoides como un indicador de la virola de novo en el epitelio de las vellosidades. Por lo tanto, el aspecto crítico de este procedimiento es garantizar la ausencia de contaminación por criptas.
La mutación condicional Smad4KO:β-cateninaGOF causa desdiferenciación en el epitelio intestinal marcada por la expresión de la proliferación y los marcadores de células madre en las vellosidades, y eventualmente la formación de estructuras similares a criptas en las vellosidades conocidas como criptas ectópicas La presencia de células madre estas vellosidades desdiferenciadas fue determinada por la expresión de marcadores de células madre en las criptas ectópicas(in vivo)y la capacidad de las vellosidades mutantes para formar organoides wh en chapado Matrigel3. El procedimiento mencionado a continuación elabora la metodología utilizada para confirmar el tallo del epiteliointestinal indiferenciante en los ratones mutantes Smad4 KO:β-cateninaGOF. Una característica clave de esta metodología para aislar las vellosidades fue el uso del raspado de la luz intestinal, a diferencia del método de quelación con EDTA4. A diferencia del método de quelación EDTA, el aislamiento de vellosidades por raspado retiene la mayoría del mesénquima subyacente y permite ajustar la presión del raspado para producir vellosidades sin criptas atadas. La presión de raspado es subjetiva para el operador, por lo tanto, la presión óptima para producir vellosidades sin criptas atadas debe ser determinada empíricamente por el operador. El aspecto crítico de este procedimiento es garantizar la ausencia de contaminación por cripta mediante el examen microscópico de las vellosidades tanto antes como después del recubrimiento en la matriz BME-R1.
Las vellosidades intestinales se raspan de la luz intestinal con portaobjetos de vidrio y se colocan en un filtro de 70 μm y se lavan con PBS para deshacerse de las células sueltas o criptas, si las hay, antes del recubrimiento en la matriz BME-R1. El método hace hincapié en los siguientes criterios para evitar la contaminación de la cripta: a) confinar las vellosidades de la mitad proximal del duodeno donde las vellosidades son las más largas, b) minimizar el número de rasguños que producen vellosidades, c) lavar el filtro que contiene las vellosidades a través de una serie de PBS en un plato de seis pozos, y d) confirmar la ausencia de contaminación de la cripta mediante un examen microscópico antes y después del recubrimiento en la matriz BME-R1. El aislamiento de vellosidades por raspado, en lugar de por quelación con EDTA, evita la pérdida completa del mesénquima subyacente que puede proporcionar las señales de nicho5,6,7,8,si es necesario, para la iniciación organoidea desde el epitelio de vellosidades.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

La clonogenicidad de los organoides del epitelio intestinal se atribuye a la presencia de células madre en el mismo. El epitelio del intestino delgado del ratón está compartimentado en criptas y vellosidades: las células madre y proliferantes están confinadas a las criptas, mientras que el epitelio de las vellosidades contiene solo células diferenciadas. Por lo tanto, las criptas intestinales normales, pero no las vellosidades, pueden dar lugar a organoides en cultivos 3D. El procedimiento descrito aquí es aplicable solo a las vellosidades epiteliales sometidas a desdiferenciación que conduce a la esteronía. El método descrito utiliza el ratón mutante condicional Smad4-pérdida-de-función:β-catenina ganancia-de-función (Smad4 KO:β-cateninaGOF). La mutación hace que las vellosidades intestinales se desdiferencian y generen células madre en las vellosidades. Las vellosidades intestinales sometidas a desdiferenciación se raspan del intestino utilizando portaobjetos de vidrio, se colocan en un colador de 70 μm y se lavan varias veces para filtrar cualquier célula suelta o criptas antes del recubrimiento en la matriz BME-R1 para determinar su potencial de formación de organoides. Se utilizaron dos criterios principales para garantizar que los organoides resultantes se desarrollaran a partir del compartimento de vellosidades desdiferenciantes y no de las criptas: 1) evaluar microscópicamente las vellosidades aisladas para garantizar la ausencia de criptas atadas, tanto antes como después del revestimiento en la matriz 3D, y 2) monitorear el curso temporal del desarrollo de organoides desde las vellosidades. La iniciación organoidea de las vellosidades ocurre solo de dos a cinco días después del recubrimiento y aparece con forma irregular, mientras que los organoides derivados de la cripta del mismo epitelio intestinal son evidentes dentro de las dieciséis horas posteriores al recubrimiento y parecen esféricos. La limitación del método, sin embargo, es que el número de organoides formados y el tiempo requerido para la iniciación organoide de las vellosidades varían según el grado de desdiferenciación. Por lo tanto, dependiendo de la especificidad de la mutación o el insulto que causa la desdiferenciación, la etapa óptima en la que se pueden cosechar vellosidades para evaluar su potencial de formación de organoides debe determinarse empíricamente.

El factor determinante para el éxito del procedimiento es prevenir la contaminación de la cripta. El desarrollo de organoides a partir de las vellosidades (y no de ninguna cripta contaminante) se garantiza confirmando cuatro criterios principales: 1) garantizar la pureza de las vellosidades cosechadas mediante un examen microscópico antes y después de enchapar las vellosidades en BME-R1, 2) enchapar un número limitado de vellosidades por pozo para permitir la visualización de todas las vellosidades chapadas individ...

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3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

El procedimiento describe el aislamiento de las vellosidades del epitelio intestinal del ratón sometido a desdiferenciación para determinar su potencial de formación de organoides.

Cultivo 3D de organoides del epitelio de las vellosidades intestinales sometidos a desdiferenciación

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Este método puede confirmar la capacidad formadora de organoides del epitelio de vellosidades desdes diferenciadoras que adquieren marcadores de células madre in vivo. La recolección de vellosidades se realiza mediante raspado en lugar del método de quelación EDTA que previene la pérdida completa del mesénquima subyacente que puede proporcionar las señales de nicho si es necesario para la iniciación organoide. Este método es aplicable en tejidos epiteliales donde los compartimentos proliferativos y diferenciados están físicamente delineados y las células desdes diferenciadoras expresan marcadores de células madre in vivo.Algunos factores en este protocolo deben determinarse empíricamente, incluida la etapa óptima para cosechar las vellosidades y la presión óptima para raspar las vellosidades, lo que llevará tiempo y práctica. Inducir la mutación Smad4 knockout y beta-catenina de ganancia de función en ratones mutantes con inyección intraperitoneal de tamoxifeno y aceite de maíz durante cuatro días consecutivos. Después de la eutanasia del ratón, rocíe el abdomen con 70% de etanol para evitar que el pelaje del ratón entre en la cavidad peritoneal.Abra la cavidad abdominal con tijeras de disección para exponer el intestino y aislar el intestino con tijeras y pórceps. Diseccionar la mitad proximal del duodeno, luego enjuagar el duodeno con cinco mililitros de PBS helado en una jeringa de 10 mililitros para eliminar el contenido luminal. Abra el duodeno longitudinalmente con una tijera en ángulo y coloca el duodeno plano sobre una placa de Petri de 15 centímetros sobre hielo con la luz del duodeno mirando hacia el operador.Antes de comenzar el raspado, coloque un colador de malla de 70 micrómetros en uno de los pozos de una placa de cultivo de tejido de seis pozos. Llene todos los pozos con cuatro mililitros de 1X PBS y coloque la placa sobre hielo. Raspe las vellosidades usando dos portaobjetos de vidrio microscópicos, uno para sostener el duodeno hacia abajo y el otro para raspar.Raspe el lado luminal del duodeno superficialmente dos veces para eliminar el moco sin eliminar las vellosidades, luego raspe el duodeno dos veces más para recoger las vellosidades en las diapositivas sin atar las criptas. Use una pipeta de transferencia de un mililitro que contenga PBS para transferir las vellosidades a un colador de malla de 70 micrómetros en el plato de seis pozos. Recoge las vellosidades después de cada rasguño.Para eliminar las criptas sueltas, lave las vellosidades recolectadas con el colador de 70 micrómetros transfiriendo el colador a través de una serie de pozos en el plato de seis pozos que contiene cuatro mililitros de PBS helado por pozo. Usando una pipeta P1000, transfiera la suspensión de vellosidades en aproximadamente tres mililitros de PBS del colador de 70 micrómetros a un nuevo tubo de 15 mililitros sobre hielo. Utilice una punta de pipeta P200 de extremo romo recubierta de BSA al 0,1% para transferir un volumen de 50 microlitros de la suspensión de vellosidades a un portaobjetos de vidrio.Cuente el número de vellosidades en la gota de 50 microlitros con un aumento de 4X para determinar la concentración de vellosidades en la suspensión de PBS y confirmar la ausencia de criptas atadas. Para colocar las vellosidades, use una punta de pipeta de extremo romo P200 recubierta de BSA al 0.1% para transferir las vellosidades a un tubo de microcentrífuga para una densidad de recubrimiento de seis vellosidades por pozo en 12.5 microlitros de matriz BME-R1. Gire hacia abajo las vellosidades durante dos minutos a 200 veces G a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante y repita la centrifugación para eliminar cualquier PBS residual. En una campana de flujo laminar, vuelva a colocar el pellet de vellosidades suavemente en la cantidad requerida de BME-R1 frío descongelado en hielo. Usando una pipeta P20, placa 12.5 microlitros de las vellosidades en matriz BME-R1 por pozo de una placa con fondo en U de 96 pozos precalentada a 37 grados Celsius.Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados durante 15 minutos para permitir la solidificación de la matriz BME-R1. A cada pozo, agregue 125 microlitros de medios ENR precalentados complementados como se describe en el manuscrito de texto. Incubar las vellosidades chapadas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y cambiar los medios cada dos días.Deseche cualquier pozo en el que aparezcan organoides antes de dos días. Hay una diferencia en la apariencia de los organoides que emergen de las criptas frente al epitelio de vellosidades desdesferenciado del mismo intestino de ratón. Los organoides derivados de la cripta aparecen de la noche a la mañana como estructuras esféricas con bordes bien definidos.Se examinó la cinética y la apariencia morfológica de los organoides iniciados a partir de vellosidades, que aparecen con forma irregular al principio y tardan de dos a cinco días antes de que puedan verse bajo un microscopio. Se muestra la iniciación organoide a partir de dos vellosidades diferentes. Las vellosidades con potencial de formación de organoides parecen densas, posiblemente debido a la retención del mesénquima subyacente.La iniciación organoide de las villas es evidente en el segundo día desde una de las vellosidades. Mientras que en las otras villas, el organoide aparece en el cuarto día. Es crucial tomar las medidas adecuadas para evitar la contaminación de la cripta al cosechar las vellosidades y cultivar los organoides resultantes.Las diferencias fenotípicas entre los organoides que emergen de las criptas y las vellosidades del mismo mutante se observaron después de este procedimiento, por lo que se podrían realizar más experimentos para buscar diferencias moleculares entre los dos. Este protocolo podría usarse para estudiar las diferencias entre organoides que surgen de criptas endógenas versus criptas ectópicas que surgen de la desdiferenciación, por lo que se podrían abordar las implicaciones de la desdiferenciación.

Research

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Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Cultivo de organoides 3D intestinales de lechones a partir de criptas epiteliales criopreservadas y establecimiento de monocapas celulares

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

Generación y manipulación de organoides intestinales de rata

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...