Name: 3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

Denna publikation stöddes av Award Number K22 CA218462-03 från NIH National Cancer Institute. HEK293-T-cellerna som uttryckte R-Spondin1 var en generös gåva från Dr. Michael P. Verzi.

Alla de musexperiment som genomfördes, inklusive användning av Tamoxifen och dödshjälp genom livmoderhalsförskjutning, hade godkännande av institutional animal care and use committee vid Stevens Institute of echnology.
1. Möss
OBS: Generationen av Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 möss har tidigare beskrivits3. Vuxna honmöss mellan åtta och tolv veckor användes.</...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties.">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li><li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium.">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche.">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li><li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage.">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li><li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury.">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li><li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche.">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis.">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li><li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters.">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li><li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages.">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li><li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc(min)+mice+downstream+of+Wnt+signaling.">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2.">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes.">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li><li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding.">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li><li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine.">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).</li><li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm.">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li></ol>

Denna metod kan bekräfta självförnyelsekapaciteten hos dedifferentiering av villi epitel som förvärvar stamcellsmarkörer in vivo. Det normala intestinala epitelet kan ge upphov till organoider från kryptan men inte villi-facket, när det odlas i 3D på grund av närvaron av stamceller i krypterna1. Således bekräftar organoidbildning från det dedifferentierade villi epitel odlat i 3D-kulturer stamcellsbildning från cellens ödesåtervändning. Rapporter om cell öde återföring...

Tarmkrypterna men inte villi, bildar organoider när de odlas i Matrigel eller BME-R1 matris. Dessa organoider är självorganiserande strukturer, ofta kallade "mini-gut" på grund av närvaron av de olika differentierade härstamningar, stamceller och stamceller som finns i tarmepiteleriet in vivo. Potentialen att bilda organoider från krypter tillskrivs närvaron av stamceller1. Intestinala villi består å andra sidan endast av differentierade celler och kan därför inte bilda organoider. Mutationer2 eller tillstånd som tillåter dedifferentiering av villus epitel kan dock leda till stamceller i villi2,3. Denna ödesförändring som resulterar i stemness i villi epitel kan bekräftas genom plätering av dedifferentiering villus epitel i 3D matris för att bestämma deras organoid-formning potential som en indikator på de-novo stemness i villus epitel. Därför är den kritiska aspekten av detta förfarande att säkerställa frånvaro av kryptförorening.
Smad4KO:β-cateninGOF villkorlig mutation orsakar dedifferentiering i intestinala epitel som kännetecknas av uttryck av spridning och stamcellsmarkörer i villi, och så småningom bildandet av kryptliknande strukturer i villi som kallas ectopic krypter Förekomsten av stamceller dessa dedifferentierade villi bestämdes av uttrycket av stamcellsmarkörer i ectopic krypter (in vivo) och mutant villis förmåga att bilda organoider wh pläterad Matrigel3. Nedan nämnda förfarande utarbetar den metod som används för att bekräfta stemnessen hos det dedifferentierande intestinala epitelet i Smad4KO:β-cateninGOF mutanta möss. Ett viktigt inslag i denna metod för att isolera villi var användningen av skrapning av tarmlumen, i motsats till EDTA-kelatmetoden4. Till skillnad från i EDTA-kelatmetoden behåller villi-isoleringen genom att skrapa majoriteten av det underliggande mesenchymet och gör det möjligt att justera trycket på skrapning för att ge villi utan tjudrade krypter. Skraptrycket är subjektivt för operatören, därför måste det optimala trycket för att ge villi utan krypter fastbundet bestämmas empiriskt av operatören. Den kritiska aspekten av detta förfarande är att säkerställa frånvaron av kryptförorening genom mikroskopisk undersökning av villi både före och efter plätering i BME-R1 matrisen.
Intestinal villi skrapas bort från tarmlumen med glasrutschbanor och placeras i ett 70 μm-filter och tvättas med PBS för att bli av med lösa celler eller eventuella krypter innan de pläteras i BME-R1-matrisen. Metoden betonar följande kriterier för att undvika kryptkontaminering: a) begränsa villi-skörden av den proximala halvan av årondenum där villi är längst, b) minimera antalet villi-avgivande skrapsår, c) tvätta filtret som innehåller villi genom en serie PBS i en sex-brunns skål och d) bekräfta frånvaron av kryptkontaminering genom mikroskopisk undersökning före och efter plätering i BME-R1 matris. Villi isolering genom att skrapa, snarare än genom EDTA chelation, förhindrar fullständig förlust av den underliggande mesenchyme som kan genischsignalerna 5,6,7,8, om det behövs, för organoid initiering från villus epitel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F-12 media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>&#160;PK4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled scissor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9703100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>1030001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdx2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70-micron cell strainer</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3433-005-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td>
			<td>Gift from Dr. Michael Verzi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrscope glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89218-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Blunt tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46620-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (50mg/mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-770</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d culturing of organoids from the intestinal villi epithelium undergoing dedifferentiation

Clonogenicity av organoider från intestinala epitel tillskrivs förekomsten av stamceller däri. Musens lilla intestinala epitel är indelat i krypter och villi: stammen och prolifererande celler är begränsade till krypterna, medan villi epitel innehåller endast differentierade celler. Därför kan de normala tarmkrypterna, men inte villi, ge upphov till organoider i 3D-kulturer. Förfarandet som beskrivs här är endast tillämpligt på villus epitel som genomgår dedifferentiering som leder till stemness. Metoden som beskrivs använder Smad4-förlust-av-funktion:β-catenin gain-of-function (Smad4KO:β-cateninGOF)villkorlig mutant mus. Mutationen gör att tarm villi dedifferentierar och genererar stamceller i villi. Intestinala villi som genomgår dedifferentiering skrapas av tarmarna med hjälp av glasrutschbanor, placeras i en 70 μm sil och tvättas flera gånger för att filtrera bort lösa celler eller krypter före plätering i BME-R1 matris för att bestämma deras organoidbildande potential. Två huvudkriterier användes för att säkerställa att de resulterande organoiderna utvecklades från det dedifferentierande villusfacket och inte från krypterna: 1) mikroskopiskt utvärdera den isolerade villi för att säkerställa frånvaron av några tjudrade krypter, både före och efter plätering i 3D-matrisen och 2) övervakning av tidsföringen för organoid utveckling från villi. Organoid initiering från villi förekommer endast två till fem dagar efter plätering och verkar oregelbundet formad, medan krypt-härledda organoider från samma intestinala epitel är uppenbara inom sexton timmar efter plätering och verkar sfäriska. Begränsningen av metoden är dock att antalet organoider som bildas och den tid som krävs för organoidinitiering från villi varierar beroende på graden av dedifferentiering. Beroende på mutationens specificitet eller förolämpningen som orsakar dedifferentieringen måste därför det optimala stadiet där villi kan skördas för att analysera deras organoida formningspotential bestämmas empiriskt.

Den avgörande faktorn för hur framgångsrikt förfarandet lyckas är att förhindra kryptförorening. Organoid utveckling från villi (och inte från någon förorenande krypter) säkerställs genom att bekräfta fyra huvudkriterier: 1) säkerställa renheten hos den skördade villi genom mikroskopisk undersökning före och efter plätering villi i BME-R1, 2) plätering av begränsat antal villi per brunn för att möjliggöra visualisering av alla pläterade villi individuellt, 3) på utveckling av organoid dagligen;...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation at JoVE.com

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Förfarandet beskriver isolering av villi från mus intestinala epitel genomgår dedifferentiering för att bestämma deras organoid formning potential.

3D-odling av organoider från intestinala Villi Epitel som genomgår dedifferentiering

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Denna metod kan bekräfta den organoidbildande kapaciteten hos avstärkande villi epitel som förvärvar stamcellsmarkörer in vivo. Insamlingen av villi utförs via skrapning snarare än EDTA-kelatmetoden som förhindrar fullständig förlust av det underliggande mesenkymet som kan ge nischsignalerna om det behövs för organoidinitiering. Denna metod är tillämplig i epitelvävnader där proliferativa och differentierade fack avgränsas fysiskt och de avdifferentierande cellerna uttrycker stamcellsmarkörer in vivo.Vissa faktorer i detta protokoll måste bestämmas empiriskt, inklusive det optimala steget för att skörda villi och det optimala trycket för att skrapa villi, vilket kommer att ta tid och övning. Inducera Smad4 knockout och beta-catenin vinst av funktion mutation i mutanta möss med intraperitoneal injektion av tamoxifen och majsolja i fyra dagar i följd. Efter att ha avlivat musen, spraya buken med 70% etanol för att förhindra att muspäls kommer in i peritonealhålan.Öppna bukhålan med dissekeringssax för att exponera tarmarna och isolera tarmarna med sax och tång. Dissekera ut den proximala halvan av årondenumet och spola sedan ner årondenumet med fem milliliter iskallt PBS i en 10 milliliter spruta för att rensa luminalhalten. Öppna tolvfingertarmen längsgående med en vinklad sax och lägg tolvfingertarmen platt på en 15 centimeters Petri-skål på is med tolvfingertarmen vänd mot operatören.Innan du börjar skrapa, placera en 70 mikrometer nätsil i en av brunnarna på en sex-brunns vävnadskulturplatta. Fyll alla brunnar med fyra milliliter 1X PBS och lägg plattan på is. Skrapa villi med två mikroskopiska glasrutschbanor, en för att hålla duoden nere och den andra för att skrapa.Skrapa den lysande sidan av årondenum ytligt två gånger för att ta bort slemmet utan att ta bort villi, skrapa sedan årondenumet ytterligare två gånger för att samla villi på bilderna utan att binda krypterna. Använd en milliliter överföringspipett som innehåller PBS för att överföra villi till en 70 mikrometers nätsil i sexbrunnsskålen. Samla villi efter varje skrap.För att ta bort lösa krypter, tvätta villi som samlats in med 70 mikrometer sil genom att överföra silen genom en serie brunnar i sex-brunns skålen som innehåller fyra milliliter iskall PBS per brunn. Använd en P1000-pipett och överför villi-suspensionen i cirka tre milliliter PBS från 70-mikrometersilen till ett nytt 15 milliliter rör på is. Använd en 0,1%BSA-belagd trubbig p200 pipettspets för att överföra en 50 mikroliter volym av villi-fjädringen till en glasrutschbana.Räkna antalet villi i 50 mikroliterdroppar under 4X förstoring för att bestämma koncentrationen av villi i PBS-suspensionen och för att bekräfta frånvaron av tjudrade krypter. För att plätera villi, använd ett 0,1%BSA-belagt P200 trubbigt pipettspets för att överföra villi till ett mikrocentrifugrör för en pläteringstäthet på sex villi per brunn i 12,5 mikroliter BME-R1-matris. Snurra ner villi i två minuter vid 200 gånger G vid fyra grader Celsius.Ta bort supernaten och upprepa centrifugeringen för att ta bort eventuell rest PBS. I en laminär flödeshuv, återanvänd villi pelleten försiktigt i önskad mängd kall BME-R1 tinad på is. Med hjälp av en P20-pipett, plåt 12,5 mikroliter av villi i BME-R1 matris per brunn av en 96-brunn u-bottenad platta förvärmd till 37 grader Celsius.Inkubera plattan i en vävnadskulturinkubator vid 37 grader Celsius i 15 minuter för att möjliggöra stelning av BME-R1-matrisen. Lägg till 125 mikroliter förvärmda ENR-medier kompletterade enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Inkubera den pläterade villi i en vävnadskulturinkubator vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid och byt media varannan dag.Kassera alla brunnar där organoider uppträder före två dagar. Det finns en skillnad i utseende på organoiderna som kommer från krypterna kontra det de-differentierade villi-epitelet från samma mustarmar. De krypt-härledda organoiderna visas över natten som sfäriska strukturer med väldefinierade gränser.Kinetik och morfologiska utseende av de organoider som initierats från villi undersöktes, som verkar oregelbundet formade först och tar två till fem dagar innan de kan ses under ett mikroskop. Organoidinitiering från två olika villi visas. Villi med organoid-bilda potential verkar tät, möjligen på grund av bevarandet av den underliggande mesenchyme.Organoid initiering från villorna är uppenbar på dag två från en av villi. Medan i de andra villorna visas organoiden på dag fyra. Det är viktigt att vidta lämpliga åtgärder för att undvika kryptförorening när man skördar villi och odlar de resulterande organoiderna.Fenotypiska skillnader mellan de organoider som kommer från krypterna och villi av samma mutant observerades efter detta förfarande, så ytterligare experiment kunde utföras för att leta efter molekylära skillnader mellan de två. Detta protokoll skulle kunna användas för att studera skillnaderna mellan organoider som härrör från endogena krypter jämfört med ectopic krypter som härrör från av-differentiering, vilket innebär att konsekvenserna av avdifferiering kan åtgärdas.

Research

JoVE Journal

Biology

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

En 3D-system för odling mänskliga Artikulära chondrocyter i ledvätskan

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Ett protokoll för Lentiviral Transduction och Nedströms Analys av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primära cellkulturer från mus Retinal pigmentepitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Analysera oxidativ stress i Murine Intestinala organoider med hjälp av reaktiva syre arter-känslig fluorogen sond

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med hög kapacitet för odling och 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Etablera 3D-endometrieorganoider från musens livmoder

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Odling av Piglet Intestinal 3D-organoider från kryokonserverade epitelkrypter och etablering av cellmonolager

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-odling av organoider från murina tarmkrypter och en enda stamcell för organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

Generering och manipulation av tarmorganoider hos råttor

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Construction of a 3D Intestinal Mucosa Model with Paraffin Embedding

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models (Video) | JoVE

Grundläggande tredimensionellt (3D) tarmmodellsystem med en immunkomponent

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...