Name: an improved time- and labor- efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منحة 5R01HD095512-02 إلى S.W.).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم استخدام C57BL/6 إناث الفئران (8 أسابيع) في هذه الدراسة.
1. التحضير:
<ol><li>امزج ويليام E Medium (ملحق GlutaMAX) مع محلول FBS بنسبة 10٪ ومحلول مضاد للفطريات بنسبة 1٪ لجعل الثقافة متوسطة.</li>
	<li>قم بت?...

<ol>
	<li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective.">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).</li><li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes:+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development.">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cell+polyploidization:+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes.">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214 (2015).</li><li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB.">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).</li><li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity.">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocytes+as+immunological+agents.">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li><li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis.">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility.">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).</li><li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia.">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li><li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes.">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li><li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle.">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li><li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes.">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li><li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment.">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li><li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers.">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-147,+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation,+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses.">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo.">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).</li><li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging.">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion.">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169 (2007).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>. Hepatocyte media, Thermofisher Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021)</li><li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer+cell+of+origin,+molecular+class,+and+effects+on+patient+prognosis.">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li><li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells.">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48 (2017).</li><li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes:+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair.">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li><li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History,+heterogeneity,+developmental+biology,+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells.">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD95+receptor:+apoptosis+revisited.">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li><li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li><li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression.">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li><li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130.">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li></ol>

تم تطوير العديد من بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية. كما تم الحفاظ عليها على النحو الأمثل وتكييفها بناء على الاحتياجات المختلفة (الجدول 1). تتكون بروتوكولات العزل عموما من جزأين: التروية (بما في ذلك هضم الإنزيم) والتنقية.
 يمكن إجراء التروية مع الكبد بأكمله <e...

الكبد بمثابة واحد من أهم الأعضاء في الجسم الفقاري بسبب الدور الحيوي الذي يلعبه في العديد من الوظائف الداعمة للحياة مثل هضم الطعام والدورة الدموية وإزالة السموم. استخدام خلايا الكبد الأولية للفئران في ثقافة المختبر تحظى بشعبية متزايدة في دراسات استقلاب الكربوهيدرات وسرطان الكبد. لذلك ، من المهم تطوير طريقة ملائمة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية الفطرية. نظرا لوظيفته كمركز لاستقلاب الجلوكوز ، فإن الكبد هو أيضا مركز لإنتاج الجلوكوز وتخزينه1. التجارب مع خلايا الكبد الأولية في المختبر أمر لا بد منه لمعظم دراسات استقلاب الجلوكوز. لذلك ، لسنوات ، طورت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.
الإجراء العام لعزل خلايا الكبد لدى الفئران هو أولا طرد الدم في الكبد بسائل متساوي السمو مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ثم استخدام محلول يحتوي على الكولاجيناز لفصل خلايا الكبد. تشترك هذه البروتوكولات في إجراء عام ولكنها تختلف في الكواشف والخطوات القائمة على الاحتياجات المختلفة. ومع ذلك ، فإن إعداد الكواشف المطلوبة وتنفيذ خطوات العزل يستغرق وقتا. ولدى وضع هذا البروتوكول، وضعت الكفاءة كأولوية، مع جعل جميع الكواشف جاهزة للاستخدام ومتاحة من السوق، وبأقل خطوات ممكنة. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير طريقة سريعة وفعالة في العمل لعزل خلايا الكبد الأولية عن الفأر ، دون تعريض نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة وقدرتها على البقاء للخطر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>Coating not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td>Coating not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AKT</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2920S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FOXO1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>97635S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-p-AKT (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9271L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PEPCK</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-166778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-p-FOXO1 (S256)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>84192S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>383511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1443001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzyChrom Glucose Assay Kit</td>
			<td>BioAssay Systems</td>
			<td>EBGL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F3917-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Wash Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>13630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>NDC 0002-8215-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL (100 mg/mL)</td>
			<td>Hospira Inc</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Digest MA2:D30edium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17703-034</td>
			<td>Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 &#176;C freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Perfusion Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17701-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Capable of pumping at 4 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td>Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, PVDF 0.45 &#181;m 30mm diameter</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 0.5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 60 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Tank</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS6783</td>
			<td>Or any water bath tank capable of heating up to 45 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Medium (GlutaMAX Supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32551020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylozine (100 mg/mL)</td>
			<td>Vetone Anased LA</td>
			<td>NDC13985-704-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved time- and labor- efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation

تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في أبحاث الكبد في المختبر ، خاصة في دراسات استقلاب الجلوكوز. تم تكييف تقنية أساسية بناء على احتياجات مختلفة ، مثل الوقت والعمالة والتكلفة واستخدام خلايا الكبد الأولية ، مما أدى إلى بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية المختلفة. ومع ذلك ، فإن الخطوات العديدة ومستحضرات الكواشف التي تستغرق وقتا طويلا في عزل خلايا الكبد الأولية هي عيوب رئيسية للكفاءة. بعد مقارنة بروتوكولات مختلفة لإيجابياتها وسلبياتها ، تم الجمع بين مزايا كل منها ، وتم صياغة بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية بسرعة وكفاءة. في غضون 35 دقيقة فقط ، يمكن لهذا البروتوكول أن ينتج الكثير ، إن لم يكن أكثر ، من خلايا الكبد الأولية الصحية مثل البروتوكولات الأخرى. علاوة على ذلك ، أثبتت تجارب استقلاب الجلوكوز التي أجريت باستخدام خلايا الكبد الأولية المعزولة فائدة هذا البروتوكول في دراسات استقلاب الكبد في المختبر . كما قمنا بمراجعة وتحليل أهمية وغرض كل خطوة في هذه الدراسة على نطاق واسع حتى يتمكن الباحثون المستقبليون من تحسين هذا البروتوكول بناء على الاحتياجات.

من أجل اختبار الكفاءة ، تم إجراء بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية الحالية على الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اختبار تعلق ونقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة. يستخدم عزل خلايا الكبد الأولية لمجموعة واسعة من التجارب على فسيولوجيا الكبد ، مثل تأثيرات الأدوية الكبدية واستقلاب الج?...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation at JoVE.com

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

خلايا الكبد الأولية هي أداة قيمة لدراسة استجابة الكبد والتمثيل الغذائي في المختبر. باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، تم تطوير بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.

بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

خلايا الكبد الأولية للفئران مهمة في دراسات الكبد. خاصة بالنسبة لاستقلاب الجلوكوز ، واختبار الأدوية الكبدية. من ناحية الوقت ، يمكن أن تستغرق عملية العزل وقتا طويلا وتكلف الطاقة.يمكن أن يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر. إنه الوقت وسهولة العمل. يتطلب خطوات قليلة جدا مع جميع المناطق المتاحة تجاريا.ابدأ باستخدام المضخة التمعجية لبدء ضخ الماء المقطر المزدوج الدافئ بسرعة 4 مل في الدقيقة ، لمدة خمس دقائق. ثم قم بتغيير أنبوب الضخ من الماء إلى وسط التروية الساخن. مراقبة فقاعة الهواء بين الماء ووسط التروية.سوف يساعد على تتبع تدفق وسط التروية من خلال النظام. بعد ذلك تطهير البطن من مخدر ثمانية أسابيع C57 أسود 6J أنثى الفأر مع 70 ٪ من الإيثانول. وباستخدام مقص ، قم بقطع البطن لكشف الكبد والوريد البابي والوريد الأجوف السفلي.ثم أوقف المضخة التمعجية. بعد التأكد من أن أنبوب الضخ يحتوي على وسط التروية وليس الماء. أدخل قسطرة قياس 24 في الوريد الأجوف السفلي.قم بتشغيل المضخة مرة أخرى وقم بفتح الوريد البابي. أثناء ضخ وسط التروية ، اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. استمر في الضخ لمدة ثلاث إلى خمس دقائق تقريبا أو حتى يصبح السائل الذي تم تنظيفه صافيا.بعد ذلك قم بتغيير أنبوب الضخ من وسط التروية إلى وسط توزيع الكولاجيناز. واضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. استمر في الضخ حتى يتم استنفاد كل 25 مل من وسط إزالة الكولاجيناز.بعد ذلك عزل الكبد كله دون المرارة. ووضعها في 30 مل من وسط الغسيل في طبق بتري على الثلج. باستخدام ملقط تمزيق الكبد إلى قطع لإطلاق خلايا الكبد الأولية في المحلول.في هذه المرحلة ، يتحول وسط الغسيل إلى محلول غائم يحتوي على خلايا الكبد الأولية التي تم إطلاقها وقطع الكبد الصغيرة. قم بتصفية هذا الحل الغائم من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرون ، إلى 20 مل من 1X لكل مكالمة HBSS في أنبوب 50 مل على الجليد. وامزج المحلول عن طريق عكس الأنبوب 20 مرة.التالي الطرد المركزي الحل. ثم في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة ، شفط supernatant. واغسل الكريات ب 30 مل من وسط الغسيل البارد.بيليه الخلايا مرة أخرى مع الطرد المركزي. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 25 مل من وسط الثقافة. عد الخلايا وطبقها على لوحات الثقافة المطلوبة.وفقا للتصميم التجريبي. بعد الطلاء ، تم ربط خلايا الكبد الأولية المعزولة بقوة لمدة ساعة واحدة وتوسعت بالكامل بعد 12 ساعة. في خلايا الكبد المعزولة ، زادت مستويات mRNA من علامات خلايا الكبد ، مثل transthyretin و CD95 و ASGR1 و ASGR2 بشكل كبير مقارنة بالكبد بأكمله.على النقيض من ذلك ، كان وجود الخلايا المناعية والخلايا النجمية والخلايا البطانية أقل. كما يتضح من الانخفاض الحاد في CD45 ، الكولاجين من النوع 1 ألفا 1 ، والخلية البطانية 2 كيناز 2 مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال. مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يقلل بشكل كبير من التداخل من الخلايا الكبدية الأخرى.بعد طلاء مستويات ASGR1 و ASGR2 انخفضت مع مرور الوقت ، ولكن تبقى قابلة للمقارنة مع الكبد بأكمله حتى نقطة زمنية مدتها 12 ساعة. خاصة بالنسبة ل ASGR1. كان مستوى التعبير عن CD81 المرتبط بالغشاء ثابتا لمدة تصل إلى 48 ساعة.وبالمقارنة، زاد تعبير المستقبلات الشبيهة بالرسوم 4 بشكل عام وأصبح أعلى مما كان عليه في مستويات الجسم الحي بعد 48 ساعة. أظهرت اختبارات حساسية الأنسولين أن الأنسولين عزز بشكل كبير الفسفرة لكل من AKT في سيرين 473. وصندوق رأس الشوكة 01 في سيرين 256 ، في خلايا الكبد.الإشارة إلى حساسية خلايا الكبد الأولية للأنسولين. زادت مستويات بروتين فوسفونولبيروفات كاربوكسيكيناز بشكل كبير بعد علاج الجلوكاجون. مما يشير إلى أنه تم تنشيط مسار إنتاج الجلوكوز.تم تأكيد هذا التنشيط بشكل أكبر من خلال زيادة إنتاج الجلوكوز. ومع محفزات إنتاج الجلوكوز الأخرى مثل Forskolin + IBMX. يمكن لهذا البروتوكول توفير الوقت والطاقة للدراسات التي تستخدم خلايا الكبد الأولية للماوس.باتباع هذا البروتوكول ، يمكن إجراء التجارب ذات الصلة مثل استقلاب الجلوكوز الافتراضي واختبارات المؤشرات الحيوية الصيدلانية.

Research

JoVE Journal

Biology

Neutrophil Isolation Protocol

العدلة عزل بروتوكول

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

طريقة محسنة لعزل الحمض النووي الريبي من الصنوبر Loblolly ( P. taeda L.) والأنواع الأخرى الصنوبرية

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

بروتوكول لعزل خلايا الكبد الإنسان الابتدائية والموافق السكان الرئيسية للخلايا الكبد غير متني

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...