Name: an improved time- and labor- efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 5R01HD095512-02 ל- S.W.).

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות C57BL/6 (בנות 8 שבועות).
1. הכנה:
<ol><li>ערבבו את ה-E Medium של William 's (תוסף גלוטמקס) עם 10% FBS ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרוטיקוטית כדי להפוך את התרבית למדיום.</li>
	<li>סנן 25 מ"ל...

<ol>
	<li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective.">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).</li><li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes:+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development.">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cell+polyploidization:+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes.">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214 (2015).</li><li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB.">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).</li><li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity.">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocytes+as+immunological+agents.">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li><li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis.">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility.">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).</li><li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia.">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li><li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes.">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li><li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle.">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li><li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes.">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li><li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment.">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li><li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers.">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-147,+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation,+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses.">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo.">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).</li><li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging.">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion.">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169 (2007).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>. Hepatocyte media, Thermofisher Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021)</li><li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer+cell+of+origin,+molecular+class,+and+effects+on+patient+prognosis.">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li><li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells.">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48 (2017).</li><li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes:+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair.">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li><li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History,+heterogeneity,+developmental+biology,+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells.">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD95+receptor:+apoptosis+revisited.">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li><li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li><li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression.">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li><li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130.">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li></ol>

פותחו פרוטוקולים שונים לבידוד הפטוציטים ראשוניים. הם גם נשמרו מותאמים ומותאמים בהתאם לצרכים שונים (טבלה 1). פרוטוקולי בידוד מורכבים בדרך כלל משני חלקים: פרפוזיה (כולל עיכול אנזים) וטיהור.
ניתן לבצע את הזלוף עם כל הכבד in vivo 2,20,21,22,23...

הכבד משמש כאחד האיברים החשובים ביותר בגוף בעלי החוליות בשל התפקיד החיוני שהוא ממלא בתפקודים תומכי חיים רבים כמו עיכול מזון, זרימת דם וניקוי רעלים. השימוש בתרבית הפטוציטים ראשונית במבחנה של עכבר פופולרי יותר ויותר במחקרים על חילוף חומרים של פחמימות וקרצינומה בכבד. לכן, חשוב לפתח שיטה נוחה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכבר תוך שמירה על תפקודו הפיזיולוגי המולד. בשל תפקודו כמרכז של חילוף חומרים של גלוקוז, הכבד הוא גם מרכזי בייצור גלוקוז ואחסון1. ניסויים עם הפטוציטים ראשוניים במבחנה הם חובה לרוב מחקרי חילוף החומרים של גלוקוז. לכן, במשך שנים, קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולים לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.
ההליך הכללי של בידוד הפטוציטים של עכברים הוא קודם כל לשטוף את הדם בכבד עם נוזל איזוסמוטי כגון מלח בחסימת פוספט (PBS) או תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחר מכן להשתמש בתמיסה המכילה קולגן כדי לנתק הפטוציטים. פרוטוקולים אלה חולקים הליך כללי אך נבדלים זה מזה בריאגנטים ובשלבים בהתאם לצרכים שונים. עם זאת, הכנת ריאגנטים נדרשים וביצוע צעדי בידוד לוקחים זמן. בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי, היעילות נקבעה כעדיפות, כאשר כל הריאגנטים מוכנים לשימוש וזמינים מהשוק, וכמה שפחות צעדים. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ויעילה לעבודה כדי לבודד הפטוציטים ראשוניים מעכבר, מבלי לסכן את טוהר הפטוציטים ראשוני מבודדים ואת הכדאיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>Coating not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td>Coating not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AKT</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2920S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FOXO1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>97635S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-p-AKT (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9271L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PEPCK</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-166778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-p-FOXO1 (S256)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>84192S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>383511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1443001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzyChrom Glucose Assay Kit</td>
			<td>BioAssay Systems</td>
			<td>EBGL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F3917-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Wash Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>13630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>NDC 0002-8215-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL (100 mg/mL)</td>
			<td>Hospira Inc</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Digest MA2:D30edium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17703-034</td>
			<td>Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 &#176;C freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Perfusion Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17701-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Capable of pumping at 4 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td>Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, PVDF 0.45 &#181;m 30mm diameter</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 0.5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 60 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Tank</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS6783</td>
			<td>Or any water bath tank capable of heating up to 45 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Medium (GlutaMAX Supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32551020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylozine (100 mg/mL)</td>
			<td>Vetone Anased LA</td>
			<td>NDC13985-704-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved time- and labor- efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation

הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר במבחנה בכבד , במיוחד במחקרי חילוף חומרים של גלוקוז. טכניקת בסיס הותאמה על בסיס צרכים שונים, כמו זמן, עבודה, עלות ושימוש ראשוני בהפטוציטים, וכתוצאה מכך פרוטוקולי בידוד ראשוניים שונים של הפטוציטים. עם זאת, הצעדים הרבים וההכנות המגיבים הגוזלים זמן רב בבידוד הפטוציטים ראשוני הם חסרונות עיקריים ליעילות. לאחר השוואת פרוטוקולים שונים עבור היתרונות והחסרונות שלהם, היתרונות של כל אחד מהם שולבו, ונוצר פרוטוקול בידוד הפטוציטים ראשוני מהיר ויעיל. תוך כ-35 דקות בלבד, פרוטוקול זה יכול להניב הפטוציטים ראשוניים בריאים באותה מידה, אם לא יותר, כמו פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, ניסויים במטבוליזם של גלוקוז שבוצעו באמצעות הפטוציטים ראשוניים מבודדים אימתו את התועלת של פרוטוקול זה במחקרי חילוף חומרים בכבד במבחנה . כמו כן, סקרנו וניתחנו בהרחבה את המשמעות והתכלית של כל שלב במחקר זה, כך שחוקרים עתידיים יוכלו לייעל עוד יותר את הפרוטוקול הזה על סמך הצרכים.

על מנת לבחון את היעילות, פרוטוקול הבידוד הראשוני הנוכחי של הפטוציטים בוצע על נקבות עכברי C57BL/6 בנות 8 שבועות. ההתקשרות והטוהר של הפטוציטים ראשוניים מבודדים נבדקו. בידוד ראשוני של הפטוציטים משמש למגוון רחב של ניסויים בפיזיולוגיה של הכבד, כגון השפעות תרופות בכבד ומטבוליזם של גלוקוז, פעילות ס?...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation at JoVE.com

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

הפטוציטים ראשוניים של עכברים חשובים במחקרי כבד. במיוחד עבור חילוף חומרים של גלוקוז, ובדיקות תרופות בכבד. מבחינת זמן תהליך הבידוד יכול לגזול זמן רב והאנרגיה יקרה.פרוטוקול זה יכול לספק דרך יעילה לבודד הפטוציטים ראשוניים של עכברים. זה זמן וידידותי לעבודה. דורש מעט מאוד שלבים עם כל האזורים הזמינים באופן מסחרי.התחילו על ידי שימוש במשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל לשאוב מים מזוקקים כפולים מחוממים במהירות של 4 מ"ל לדקה, למשך חמש דקות. לאחר מכן החליפו את צינור השאיבה ממים למדיום זלעפות מחומם. ניטור בועת האוויר בין המים למדיום הזלוף.יעזור לעקוב אחר זרימת מדיום הזלוף דרך המערכת. לאחר מכן יש לחטא את בטנו של עכבר נקבת C57 שחור 6J בן שמונה שבועות מורדם עם 70% אתנול. ובעזרת מספריים, חתכו את הבטן כדי לחשוף את הכבד, וריד הפורטל והווריד הנבוב התחתון.ואז לעצור את המשאבה peristaltic. לאחר הקפדה על כך שצינור השאיבה מכיל מדיום פרפוזיה ולא מים. מכניסים קטטר של 24 מדים לתוך הווריד הנבוב התחתון.הפעילו מחדש את המשאבה וחתכו את וריד הפורטל פתוח. בזמן שמדיום הזלוף נשאב, לחץ על וריד הפורטל כל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. יש להמשיך לשאוב במשך כשלוש עד חמש דקות או עד שהנוזל השטוף מתבהר.לאחר מכן שנה את צינור השאיבה ממדיום הזלוף למדיום הפיזור של הקולגנאז. ולחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. ממשיכים לשאוב עד שכל 25 מ"ל של מדיום הדיספוזה של הקולגנאז מתרוקנים.לאחר מכן לבודד את כל הכבד ללא כיס המרה. והניח אותו ב -30 מ"ל של מדיום שטיפה בצלחת פטרי על קרח. שימוש במלקחיים קורע את הכבד לחתיכות כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים לתמיסה.בשלב זה, מדיום הכביסה הופך לתמיסה עכורה המכילה הפטוציטים ראשוניים משוחררים וחתיכות כבד קטנות. סנן את התמיסה העכורה הזו דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, לתוך 20 מ"ל של 1X לכל שיחה HBSS בצינור של 50 מ"ל על קרח. ומערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור 20 פעמים.הצנטריפוגה הבאה את הפתרון. לאחר מכן במכסה התרבית רקמה, שאפו את הסופרנטנט. ולשטוף את הכדור עם 30 מ"ל של מדיום שטיפה קרה.גלול את התאים שוב עם צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant, והשעה מחדש את הכדור ב-25 מ"ל של מדיום התרבית. ספרו את התאים וצלחו אותם על צלחות התרבית הרצויות.על פי התכנון הניסויי. לאחר הציפוי, הפטוציטים ראשוניים מבודדים היו מחוברים היטב בשעה אחת והורחבו במלואם לאחר 12 שעות. בהפטוציטים המבודדים, רמות ה-mRNA של סמני הפטוציטים, כגון טרנסתירטין, CD95, ASGR1 ו-ASGR2 עלו באופן משמעותי בהשוואה לכבד כולו.לעומת זאת, הנוכחות של תאי מערכת החיסון, תאי סטלטים ותאי אנדותל הייתה נמוכה יותר. כפי שמעידה ירידה חדה ב-CD45, קולגן מסוג 1 אלפא 1, ותאי אנדותל 2 קינאז 2 רמות mRNA. מציע כי פרוטוקול זה יכול להפחית מאוד את ההפרעות של תאים אחרים בכבד.לאחר ציפוי רמות ASGR1 ו- ASGR2 ירדו עם הזמן, אך נותרו דומות לכבד כולו עד לנקודת הזמן של 12 שעות. במיוחד עבור ASGR1. רמת הביטוי של CD81 הקשורה לממברנה הייתה עקבית במשך עד 48 שעות.לשם השוואה, ביטוי קולטן 4 דמוי אגרה עלה בדרך כלל והפך לגבוה יותר מרמות in vivo לאחר 48 שעות. מבחני רגישות לאינסולין הראו כי אינסולין מקדם באופן משמעותי את הזרחון של שני ה-AKT ב-serine 473. ותיבת מזלג 01 בסרין 256, בהפטוציטים.המציין את הרגישות של הפטוציטים ראשוניים לאינסולין. רמות החלבון Phosphoenolpyruvate carboxykinase עלו באופן משמעותי לאחר טיפול בגלוקגון. מה שמרמז על כך שמסלול ייצור הגלוקוז הופעל.הפעלה זו אושרה עוד יותר על ידי ייצור מוגבר של גלוקוז. ועם ממריצים אחרים לייצור גלוקוז כמו פורסקולין+IBMX. פרוטוקול זה יכול לחסוך גם זמן וגם אנרגיה למחקרים באמצעות הפטוציטים ראשוניים של עכברים.בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע ניסויים קשורים כגון חילוף החומרים ההיפותטי של הגלוקוז ובדיקות סמנים ביולוגיים פרמצבטיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Neutrophil Isolation Protocol

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ &#39; taeda ל) ומינים אחרים Conifer

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...