Name: an improved time- and labor- efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.).

Tüm prosedürler Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada C57BL/6 dişi fareler (8 haftalık) kullanılmıştır.
1. Hazırlık:
<ol><li>Kültür ortamını yapmak için William'ın E Medium'unu (GlutaMAX Takviyesi)% 10 FBS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile karıştırın.</li>
	<li>Partikül kalıntılarını gidermek için 25 mL kollajenaz-dispaz ortamını (örneğin, Karaciğer Sindirim Ortamı) 0,45 μm'lik bir...

<ol>
	<li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective.">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).</li><li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes:+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development.">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li><li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cell+polyploidization:+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes.">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li><li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture.">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214 (2015).</li><li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB.">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).</li><li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity.">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocytes+as+immunological+agents.">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li><li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis.">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility.">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).</li><li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia.">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li><li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes.">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li><li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle.">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li><li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes.">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li><li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment.">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li><li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers.">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-147,+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation,+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses.">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo.">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).</li><li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging.">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method.">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion.">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro.">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169 (2007).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>. Hepatocyte media, Thermofisher Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021)</li><li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer+cell+of+origin,+molecular+class,+and+effects+on+patient+prognosis.">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li><li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells.">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48 (2017).</li><li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes:+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair.">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li><li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History,+heterogeneity,+developmental+biology,+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells.">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li><li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+sinusoidal+endothelial+cells:+Physiology+and+role+in+liver+diseases.">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li><li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD95+receptor:+apoptosis+revisited.">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li><li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li><li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression.">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li><li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130.">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li></ol>

Çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri geliştirilmiştir. Ayrıca farklı ihtiyaçlara göre optimize edilmiş ve uyarlanmıştır (Tablo 1). İzolasyon protokolleri genellikle iki bölümden oluşur: perfüzyon (enzim sindirimi dahil) ve saflaştırma.
Perfüzyon tüm karaciğer in vivo 2,20,21,22,23 veya disseke karaciğer lobları <sup cla...

Karaciğer, gıda sindirimi, kan dolaşımı ve detoksifikasyon gibi yaşamı destekleyen birçok fonksiyonda oynadığı hayati rol nedeniyle omurgalı vücudundaki en önemli organlardan biri olarak hizmet eder. Fare primer hepatosit in vitro kültürünün kullanımı, karbonhidrat metabolizması ve hepatik karsinom çalışmalarında giderek daha popüler hale gelmektedir. Bu nedenle, doğuştan gelen fizyolojik işlevini korurken fare primer hepatosit izolasyonu için uygun bir yöntem geliştirmek önemlidir. Glikoz metabolizmasının merkezi olarak işlevi nedeniyle, karaciğer aynı zamanda glikoz üretimi ve depolanması için de merkezidir1. Primer hepatositlerle yapılan deneyler in vitro olarak çoğu glukoz metabolizması çalışması için bir zorunluluktur. Bu nedenle, yıllarca, çeşitli araştırma grupları fare primer hepatosit izolasyonu için protokoller geliştirmiştir.
Fare hepatosit izolasyonunun genel prosedürü, önce karaciğerdeki kanı fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) gibi izosmotik bir sıvı ile temizlemek ve daha sonra hepatositleri ayırmak için kollajenaz içeren çözelti kullanmaktır. Bu protokoller genel bir prosedürü paylaşır, ancak farklı ihtiyaçlara göre reaktiflerde ve adımlarda farklılık gösterir. Ancak, gerekli reaktiflerin hazırlanması ve izolasyon adımlarının uygulanması zaman alır. Mevcut protokolün geliştirilmesinde verimlilik, kullanıma hazır ve piyasadan temin edilebilen tüm reaktifler ve mümkün olduğunca az adımla bir öncelik olarak belirlenmiştir. Bu protokolün genel amacı, izole edilmiş primer hepatosit saflığını ve canlılığını tehlikeye atmadan, primer hepatositleri fareden izole etmek için hızlı ve emek verimli bir yöntem sağlamaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>Coating not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td>Coating not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AKT</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2920S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FOXO1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>97635S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-p-AKT (S473)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9271L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PEPCK</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-166778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-p-FOXO1 (S256)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>84192S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>383511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1443001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzyChrom Glucose Assay Kit</td>
			<td>BioAssay Systems</td>
			<td>EBGL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F3917-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Wash Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>13630S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>NDC 0002-8215-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL (100 mg/mL)</td>
			<td>Hospira Inc</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Digest MA2:D30edium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17703-034</td>
			<td>Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 &#176;C freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Perfusion Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17701-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Capable of pumping at 4 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td>Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, PVDF 0.45 &#181;m 30mm diameter</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 0.5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 60 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Tank</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS6783</td>
			<td>Or any water bath tank capable of heating up to 45 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#8217;s E Medium (GlutaMAX Supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>32551020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylozine (100 mg/mL)</td>
			<td>Vetone Anased LA</td>
			<td>NDC13985-704-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved time- and labor- efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation

Primer hepatositler karaciğer in vitro araştırmalarında , özellikle glukoz metabolizması çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Zaman, işçilik, maliyet ve primer hepatosit kullanımı gibi farklı ihtiyaçlara göre bir baz tekniği uyarlanmış ve çeşitli primer hepatosit izolasyon protokolleri sağlanmıştır. Bununla birlikte, primer hepatosit izolasyonundaki sayısız basamak ve zaman alıcı reaktif preparatları, verimlilik için önemli dezavantajlardır. Farklı protokolleri artıları ve eksileri için karşılaştırdıktan sonra, her birinin avantajları birleştirildi ve hızlı ve verimli bir primer hepatosit izolasyon protokolü formüle edildi. Sadece ~ 35 dakika içinde, bu protokol diğer protokoller kadar olmasa da, sağlıklı primer hepatositler üretebilir. Ayrıca, izole primer hepatositler kullanılarak yapılan glukoz metabolizması deneyleri, in vitro karaciğer metabolizması çalışmalarında bu protokolün yararlılığını doğrulamıştır. Ayrıca, gelecekteki araştırmacıların bu protokolü ihtiyaçlara göre daha da optimize edebilmeleri için bu çalışmadaki her adımın önemini ve amacını kapsamlı bir şekilde gözden geçirdik ve analiz ettik.

Etkinliği test etmek için, mevcut primer hepatosit izolasyon protokolü 8 haftalık dişi C57BL/6 farelerde uygulandı. İzole primer hepatositlerin ataşmanı ve saflığı test edildi. Primer hepatosit izolasyonu, hepatik ilaç etkileri ve glukoz metabolizması, farmasötik biyobelirteç aktivitesi2, insülin duyarlılığı ve glikoz üretimi gibi karaciğer fizyolojisi üzerine çok çeşitli deneyler için kullanılır. Bu nedenle, bu protokolle izole edilen primer hepatositlerin aktivitele...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation at JoVE.com

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Fare primer hepatositleri karaciğer çalışmalarında önemlidir. Özellikle glikoz metabolizması ve hepatik ilaç testi için. Zaman açısından izolasyon işlemi zaman alıcı ve enerji maliyetli olabilir.Bu protokol, fare primer hepatositlerini izole etmek için etkili bir yol sağlayabilir. Zaman ve emek dostudur. Ticari olarak temin edilebilen tüm bölgelerle çok az adım gerektirir.Isıtılmış çift damıtılmış suyu dakikada 4 mL hızda, beş dakika boyunca pompalamaya başlamak için peristaltik pompayı kullanarak başlayın. Ardından pompalama tüpünü sudan ısıtılmış perfüzyon ortamına değiştirin. Su ve perfüzyon ortamı arasındaki hava kabarcığının izlenmesi.Perfüzyon ortamının sistemdeki akışını izlemeye yardımcı olacaktır. Daha sonra anestezi uygulanan sekiz haftalık C57 siyah 6J dişi farenin karnını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ve bir makas kullanarak, karaciğeri, portal veni ve inferior vena kavayı açığa çıkarmak için karnı kesin.Ardından peristaltik pompayı durdurun. Pompalama borusunun su değil perfüzyon ortamı içerdiğinden emin olduktan sonra. İnferior vena kavaya 24 gauge kateter yerleştirin.Pompayı tekrar açın ve portal damarı kesin. Perfüzyon ortamı pompalanırken, sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Yaklaşık üç ila beş dakika boyunca veya yıkanan sıvı temizlenene kadar pompalamaya devam edin.Daha sonra pompalama tüpünü perfüzyon ortamından kollajenaz dispase ortamına değiştirin. Ve sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Kollajenaz dispase ortamının 25 mL'sinin tamamı tükenene kadar pompalamaya devam edin.Daha sonra safra kesesi olmadan tüm karaciğeri izole edin. Ve buz üzerinde bir Petri kabında 30 mL yıkama ortamına yerleştirin. Forseps kullanmak, primer hepatositleri çözeltiye salmak için karaciğeri parçalara ayırır.Bu aşamada, yıkama ortamı, serbest bırakılan birincil hepatositleri ve küçük karaciğer parçalarını içeren bulutlu bir çözeltiye dönüşür. Bu bulutlu çözeltiyi 70 mikronluk bir hücre süzgeciyle, buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpte HBSS çağrısı başına 20 mL 1X'e filtreleyin. Ve tüpü 20 kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.Daha sonra çözümü santrifüj edin. Daha sonra doku kültürü başlığında, süpernatanı aspire edin. Peleti 30 mL soğuk yıkama ortamı ile yıkayın.Santrifüjleme ile hücreleri bir kez daha pelet edin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 25 mL kültür ortamında tekrar askıya alın. Hücreleri sayın ve istediğiniz kültür plakalarına yerleştirin.Deneysel tasarıma göre. Kaplamadan sonra, izole edilmiş primer hepatositler bir saat sıkıca tutturuldu ve 12 saat sonra tamamen genişletildi. İzole hepatositlerde, transtiretin, CD95, ASGR1 ve ASGR2 gibi hepatosit belirteçlerinin mRNA düzeyleri tüm karaciğere kıyasla anlamlı derecede artmıştır.Buna karşılık, bağışıklık hücrelerinin, yıldız hücrelerinin ve endotel hücrelerinin varlığı daha düşüktü. CD45, kollajen tip 1 alfa 1 ve endotel hücresi 2 kinaz 2 mRNA seviyelerinde keskin bir azalma ile kanıtlandığı gibi. Bu protokolün diğer hepatik hücrelerden gelen paraziti büyük ölçüde azaltabileceğini düşündürmektedir.Kaplamadan sonra ASGR1 ve ASGR2 seviyeleri zamanla azaldı, ancak 12 saatlik zaman noktasına kadar tüm karaciğerle karşılaştırılabilir kaldı. Özellikle ASGR1 için. Membrana bağlı CD81'in ekspresyon seviyesi 48 saate kadar tutarlıydı.Buna karşılık, toll-like reseptör 4 ekspresyonu genellikle artmış ve 48 saat sonra in vivo seviyelerden daha yüksek hale gelmiştir. İnsülin duyarlılık testleri, insülinin serin 473'te her iki AKT'nin fosforilasyonunu önemli ölçüde desteklediğini göstermiştir. Ve hepatositlerde serin 256'da çatal kafalı kutu 01.Primer hepatositlerin insüline duyarlılığını gösterir. Fosfoenolpiruvat karboksikinaz protein seviyeleri glukagon tedavisinden sonra anlamlı derecede artmıştır. Glikoz üretim yolunun aktive edildiğini düşündürmektedir.Bu aktivasyon, artan glikoz üretimi ile daha da doğrulandı. Ve Forskolin + IBMX gibi diğer glikoz üretim uyarıcıları ile. Bu protokol, fare primer hepatositlerini kullanan çalışmalar için hem zamandan hem de enerjiden tasarruf sağlayabilir.Bu protokolü takiben, varsayımsal glikoz metabolizması ve farmasötik biyobelirteç testleri gibi ilgili deneyler yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Neutrophil Isolation Protocol

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...