Name: segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

作者感谢英国心脏基金会项目赠款（PDW）、新加坡国家医学研究理事会TAAP和DYNAMO赠款（XW、NMRC/OFLCG/004/2018、NMRC/OFLCG/001/2017）、A*STAR研究生奖学金（致KTP）和英国心脏基金会卓越研究中心（MA）。

1. 制造设备和制备试剂
<ol><li>不锈钢模块的制造<ol>
<li>根据提供的工程图（图1），使用数控铣床从316级不锈钢中制造不锈钢模块。</li>
	</ol>
</li>
	<li>多晶硅氧烷 （PDMS） 模具的 3D 打印<ol>
<li>根据提供的工程图（图2），使用固体工程制作 PDMS 模具的 3D 计算机辅助设计 （CAD） 模型。</li>
		<li>将 CAD 模型导入 STL 文件，并将 STL 文件导入库拉 2.6.2。</li>
		...

<ol>
	<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li><li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. 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M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium:+A+review+of+the+orbital+shaker+method.">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li><li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator.">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).</li><li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture:+comparison+of+aortic,+venous,+capillary,+and+corneal+endothelium.">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li><li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS/MS.">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li><li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure.">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li><li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow.">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li><li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta.">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li></ol>

旋转井方法能够在单口井中生成复杂的流剖面 - 中心低震级多向流 （LMMF） 和井边缘的高震级单轴流 （HMUF）。然而，可溶性介质的剪切应激介分泌物将混合在漩涡介质中，影响整个井中的细胞，从而可能掩盖特定剪切应力特征对细胞的真正影响。
这里演示的涂层方法通过将细胞的生长限制在井的特定区域来克服这个问题。细胞通常附着在亲水表面，而不是疏水表面。因此，...

血管细胞对其机械环境的反应对血管的正常功能和疾病1的发展具有重要意义。排列在所有血管内表面的内皮细胞（ECs）的机械生物学一直是机械生物学研究的一个特别重点，因为ECs直接体验到血流产生的剪切应力。各种表型变化，如炎症反应，改变刚度和形态，血管活性物质的释放，以及结点蛋白的本地化和表达取决于EC暴露在剪切应力2，3，4。依赖剪切的内皮特性也可能是动脉粥样硬化5、6、7等疾病的零星发展的原因。
研究剪切对培养中 CC 的影响是有用的，因为文化可以控制应力，而 EC 可以与其他细胞类型隔离。常用的体外装置用于将剪切应力应用于 UC，包括平行板流室和锥板测速仪，但只能应用单轴稳定、振荡和脉动流8、9。虽然已开发出具有锥形或分支几何形状的改性流室和模仿维持几何形状的微流芯片，但其低通量和相对较短的文化持续时间可能构成挑战10， 11。
用于研究内皮机械转移的轨道摇床（或旋转良好）方法，即细胞生长在放置在轨道摇床平台上的标准细胞培养塑料器皿中，正日益受到关注，因为它能够长期将复杂、空间变化的剪切应力模式强加于吞吐量高的 ES 上（见 Warboys 等人的评论）。已采用计算流体动力学 （CFD） 模拟来描述旋转井中剪切应力的空间和时间变化。放置板的摇床平台的轨道运动引起的培养介质的旋转运动导致中心低震级多向流（LMMF，或假定亲热流）和6井板块井边缘的高震级单轴流（HMUF，或假定动脉保护流）。例如，时间平均壁切变应力 （TAWSS） 在中心约为 0.3 Pa，在 6 井板的边缘为 0.7 Pa，在 150 rpm 旋转，轨道半径为 5 毫米，半径为 13。该方法只需要市售的塑料制品和轨道摇床本身。
然而，这种方法（以及体外施加流动的其他方法）有一个缺点：由于旋转介质中的混合，IC以依赖剪切的方式释放可溶性介质和微粒，这种分泌物可能会影响井下区域的ECs，而不是释放的区域。这可能掩盖剪切应力对EC表型的实际影响。例如，Ghim等人推测，这解释了不同剪切图对大粒子17的跨细胞传输的明显相同影响。
在这里，我们描述了一种方法，促进人类脐带内皮细胞（HUVEC）粘附在6井板的特定区域使用纤维素涂层，同时使用Pluronic F-127传递表面，防止生长其他地方。该方法解决了上述限制，因为通过细分细胞生长，ECs 只体验一种剪切轮廓，并且不受暴露于井中其他配置文件的 EC 的分泌物的影响。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg</td>
			<td>RS</td>
			<td>832-0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel 316</td>
			<td>Metal Supermarket</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5mM)</td>
			<td>Bio Status</td>
			<td>DR50200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>SHA7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Ring Pliers</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWP32-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Rings/Internal/C-Type</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWS35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2+3-D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cura 2.6.2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks 2016</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies

血液流动对动脉壁施加的剪切应力影响内皮细胞形态和功能。低震级、振荡和多向剪切应力都被假定用于刺激内皮细胞中的亲动脉粥样硬化表型，而高震级和单向或单轴剪切被认为会促进内皮平衡。这些假设需要进一步研究，但传统的体外技术有局限性，在将多向剪切应力强加于细胞方面尤其差。 
一种越来越被使用的方法是在轨道摇床平台上的标准多井板中培养内皮细胞：在这种简单、低成本、高通量和慢性方法中，涡流介质在油井的不同部分产生不同的剪切模式和幅度，包括多向剪切。然而，它有一个显著的限制：一个区域的细胞暴露在一种类型的流动中，可能会将调停器释放到影响井中其他部分的细胞的介质中，暴露在不同的流中，从而扭曲流和表型之间的明显关系。 
在这里，我们介绍了一个简单和负担得起的方法修改，允许细胞暴露在特定的剪切应力特性。细胞播种仅限于油井的指定区域，将感兴趣的区域涂上纤维素，然后使用被动溶液进行活化。随后，板可以在摇床上旋转，导致细胞暴露在定义明确的剪切轮廓，如低震级多向剪切或高震级单轴剪切，这取决于其位置。与以往一样，使用标准的细胞培养塑料器皿可以直接进一步分析细胞。修改已经允许在定义的剪切应力特性下从内皮释放的可溶性介质的演示，这些细胞会影响位于井中其他地方的细胞。

HUVEC粘附到未涂有纤维素的井板区域，被普鲁罗尼奇F-127的通活性所废除：生长仅限于涂有纤维素的区域，即使在72小时的文化之后，有和没有剪切应力应用（图4A，图4C）。没有普鲁罗尼奇F-127的通电，HUVEC连接到表面没有纤维素，并进一步扩散了72小时的文化（图4B，图4D）。
<p cla...

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Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

该协议描述了一种涂层方法，使用轨道摇床模型将内皮细胞生长限制在 6 井板的特定区域，用于剪切应力应用。

在机械生物学研究的轨道摇床上的 6 井板中分段内皮细胞的生长

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

该协议描述了一种涂层方法，使用轨道摇床模型将内皮细胞生长限制在 6 井板的特定区域，用于纯粹的应力应用。研究流对内皮的影响的一个常见方法是在轨道摇床的多井培养板中培养内皮细胞。轨道摇床会发出围绕油井旋转的波浪。井中心的细胞经历被认为会导致动脉粥样硬化的流动。靠近边缘体验流的细胞被认为是保护性的。每个区域的细胞属性假定取决于它们所经历的纯压力。然而，这种逻辑中存在潜在的底层。内皮细胞以依赖于流量的方式释放调解员。这些调解员将在旋转介质中达到均匀的浓度，因此将影响释放细胞以外的区域的细胞。这可能损坏或隐藏剪切对细胞行为的真正影响。效果不仅限于旋转井系统。它甚至可能发生在简单的模型中，如平行板流室。它可以通过在系统中仅有一部分中生长细胞来避免。在这里，我们描述的方法，允许细胞粘附只在中心或仅在漩涡井的边缘。制造不锈钢模块。根据提供的工程图纸，从 316 级不锈钢中制造不锈钢模块。PDM 上的 3D 打印。 根据提供的工程图纸，使用 SOLIDWORKS 编写 PDM 模具的 3D CAD 模型。将 CAD 模型导入 STL 文件，并将 STL 文件导入 Cura 2.6.2。将模型切成每秒 50 毫米的打印速度和 60% 的填充密度的层，将文件作为 GCode 导出。将其上传到乌尔蒂制造商 3D 打印机进行打印。使用聚乳酸作为印刷材料。PDMS 环的铸造。将 PDMS 碱基和固化剂与 90.9% 碱基和 9.1% 固化剂的比例很好地混合。将混合良好的溶液倒入 3D 打印模具中。去除真空脱气室中的气泡。在80度的炉子里治疗一小时。允许 PDMS 环冷却到室温。然后小心地从模具中取出固化的 PDMS 环。准备1%普鲁罗尼奇F-127。重量为五克普鲁罗尼奇F-127。倒入玻璃瓶中。然后在玻璃瓶中加入一百万米米水。这提供了 5% 的普鲁罗尼奇 F-127 解决方案。确保所有普鲁罗尼奇F-127粉末都浸入水中。关闭盖子，使用液体灭菌循环程序将其高压灭菌。使用前让溶液冷却到室温。将 10 密耳的 5% 普鲁尼克 F-127 解决方案添加到 40 万毫计的高压米利-Q 水中，使 1% 的普鲁尼克 F-127 解决方案。在生物安全柜罩中进行稀释。在室温下存放 1% 和 5% 的普鲁罗尼奇 F-127。涂层6井板。使用前，自动结块不锈钢模块、PDMS 环和钳子。在 BSC 罩中执行所有后续程序，并观察无菌技术以确保无菌。使用钳子将 PDMS 环放在 6 井中。使用 PDMS 环的外部边缘在井内同心对齐 PDMS 环。请注意，应仅使用非组织培养处理良好的板材。使用钳子将不锈钢模块放在 PDMS 环的顶部。将内部保留环钳的尖端插入保留环的握把中。挤压支架以降低固定环的直径。将其放入 6 井中，将其牢牢压在不锈钢模块上，并释放钳子，以确保井中的 PDMS 环的安全。通过打开 PDMS 环和不锈钢模块，将每微升纤维素的 1 密耳（5 微克）添加到井的中心或边缘，具体取决于感兴趣的区域。旋转板，以确保纤维素溶液覆盖所有感兴趣的区域。在 95% 空气和 5% CO2 下的加湿孵化器中，在 37 度下孵化 30 分钟。从井中取出纤维素溶液。现在用 Pbs 洗两次。完成后，从井中完全取出 PBS。从井中取出固定环、不锈钢模块和 PDMS 环。将1.5万的1%普鲁尼奇F-127加入井中，在室温下孵育一小时，以使未涂布的表面通电。从井中取出普鲁罗尼奇 F-127 溶液，用 PBS 清洗三次。洗净后，立即使用涂层井或在四度储存长达两周的时间，涂层井中带有 PBS 层。内皮细胞的播种。使用血细胞计和种子18万细胞在1.5万预热细胞培养介质中将细胞计数成涂层的6井板。横向摇动井板，确保细胞均匀地分布在井中。将其留在 37 度加湿的孵化器中，在 95% 空气和 5% CO2 下过夜。使用轨道摇床剪切应力应用。细胞在生长三天后应达到汇合。用 190 万的预警细胞培养介质替换介质，达到两毫米的高度。将一个井板放在一个潮湿的孵化器的轨道摇床平台上，在150 RPM旋转三天。可选的，经过两天的剪切，细胞因子可以添加到细胞培养介质，以调查细胞因子和纯粹的压力之间的相互作用。治疗后，再切细胞一天。在这项研究中，TNF-阿尔法被用来激活细胞。在三天的剪切应力应用后进行分析。显微镜图像显示，普鲁罗尼奇F-127防止HUVEC粘附到该地区没有纤维素涂层。在生长图A和图C中，在24小时后，在普鲁罗尼克F-127失活之前未预处理过纤维素的井面部分没有附加HUVEC。没有普鲁罗尼奇F-127的通过，HUVEC被连接到表面没有纤维素，24小时后播种，在图B，并进一步增殖72小时，在图D.比例杆等于500微米。核红污渍显示切变的HUVEC，A，在中心和B的形态，在一个完整的井的边缘。秤杆等于一百微米。A 和 B 还显示通过 ZO-1 免疫维护划出的细胞轮廓。注意边缘细胞的排列和拉长，而不是中心。它显示核形状指数（表示圆形）在全井生长的 HUVEC 和未经处理或 TNF-阿尔法处理的 HUVEC 的细分井之间没有显著差异。细胞在井边拉长得更长。在TNF-阿尔法处理的HUVEC中，更延长的倾向在各地并不一贯显著。在不同径向位置，未处理的 A、未经处理的全井和分段井密度为 B、TNF-阿尔法处理的 HUVEC 之间没有显著差异。在这两种情况下，每个单位区域在边缘的细胞都比在井中央的细胞多。总之，我们在这里概述的方法允许您在任何基于塑料的细胞培养系统中，仅在旋转井的一个区域或实际上生长细胞。这意味着，经历一种流的油井一部分的细胞不受从经历不同流动的另一个区域的细胞释放的介质的影响。不仅如此，我们可以观察在一个区域生长的细胞，无论是否在其他区域生长细胞。这可以证明这种可溶性调解人的影响。测试条件介质对天真细胞的影响允许同样的事情。通过分析条件介质，可以识别调解员。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

生物工程

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生物活性蛋白或多肽在水凝胶上的应用

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

o 型血管哺乳动物细胞产生均匀集料的轨道晃动培养

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...