Name: segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

De auteurs erkennen dankbaar een projectbeurs van de British Heart Foundation (aan PDW), een National Medical Research Council Singapore TAAP en DYNAMO Grant (aan XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), een A*STAR Graduate Scholarship (aan KTP) en een British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (to MA).

1. Vervaardiging van hulpmiddelen en bereiding van reagentia
<ol><li>Fabricage van roestvrijstalen module<ol>
<li>Fabriceer de roestvrijstalen module van een roestvrij staal van klasse 316 met behulp van een CNC-freesmachine volgens de meegeleverde technische tekening (figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D-printen van een polydimethylsiloxaan (PDMS) mal<ol>
<li>Bereid een CAD-model (3D computer aided design) van de PDMS-mal voor met SolidWorks volgens de meegeleverde technische tekening (<s...

<ol>
	<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li><li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Sensing+of+Flow+Direction.">Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).</li><li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress.">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437, 426-431 (2005).</li><li>Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+and+compliance+of+endothelial+cells+after+shear+stress+in+vitro+or+from+different+aortic+regions:+Scanning+ion+conductance+microscopy+study.">Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study.</a> PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).</li><li>Asakura, T., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Patterns+and+Spatial+Distribution+of+Atherosclerotic+Lesions+in+Human.">Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human.</a> Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).</li><li>Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+evidence+for+a+change+in+the+pattern+of+aortic+wall+shear+stress+with+age.">Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).</li><li>Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fluid+mechanics+in+the+localization+and+detection+of+atherosclerosis.">The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis.</a> Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).</li><li>Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+rheological+system+for+studying+the+effect+of+fluid+shear+stress+on+cultured+cells.">Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells.</a> The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).</li><li>Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+and+orientation+of+cultured+endothelial+cells+in+response+to+shear+stress.">The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress.</a> Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).</li><li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells.">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li><li>Venugopal Menon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+microfluidic+3D+stenosis+model+to+study+leukocyte-endothelial+interactions+in+atherosclerosis.">A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis.</a> APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).</li><li>Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium:+A+review+of+the+orbital+shaker+method.">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li><li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator.">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).</li><li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture:+comparison+of+aortic,+venous,+capillary,+and+corneal+endothelium.">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li><li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS/MS.">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li><li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure.">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li><li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow.">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li><li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta.">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li></ol>

De swirling-well methode is in staat om complexe flowprofielen te genereren in een enkele put - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) aan de rand van de put. Shear stress-gemedieerde afscheidingen van oplosbare mediatoren worden echter gemengd in het wervelende medium en beïnvloeden cellen in de hele put, waardoor mogelijk het ware effect van een bepaald afschuifspanningsprofiel op de cellen wordt gemaskeerd.
De hier gedemonstreerde co...

Reacties van vasculaire cellen op hun mechanische omgeving zijn belangrijk in de normale functie van bloedvaten en bij de ontwikkeling van ziekte1. De mechanobiologie van de endotheelcellen (EC's) die het binnenoppervlak van alle bloedvaten belijnen, is een bijzondere focus van mechanobiologisch onderzoek geweest, omdat EC's direct de schuifspanning ervaren die wordt gegenereerd door de bloedstroom eroverheen. Verschillende fenotypische veranderingen zoals ontstekingsreacties, veranderde stijfheid en morfologie, de afgifte van vasoactieve stoffen en de lokalisatie en expressie van junctionele eiwitten zijn afhankelijk van eg-blootstelling aan schuifspanning2,3,4. Afschuifafhankelijke endotheeleigenschappen kunnen ook verantwoordelijk zijn voor de fragmentarische ontwikkeling van ziekten zoals atherosclerose5,6,7.
Het is nuttig om het effect van afschuiving op EC's in cultuur te bestuderen, waar spanningen kunnen worden gecontroleerd en EC's kunnen worden geïsoleerd van andere celtypen. Veelgebruikte in vitro apparaten voor het toepassen van schuifspanning op EC's zijn de parallelplaatstroomkamer en de kegel-en-plaatviscometer, maar alleen eenassige steady, oscillatory en pulsatile flow kunnen worden toegepast8,9. Hoewel gewijzigde stromingskamers met taps toelopende of vertakkende geometrieën en microfluïdische chips die een stenotische geometrie nabootsen zijn ontwikkeld , vormen hun lage doorvoer en de relatief korte cultuurduur die mogelijk is een uitdaging10, 11.
De orbitale shaker (of wervelende put) methode voor de studie van endotheelmechanotransductie, waarbij cellen worden gekweekt in standaard celkweekplasticware geplaatst op het platform van een orbitale shaker, krijgt steeds meer aandacht omdat het in staat is om chronisch complexe, ruimtelijk variërende schuifspanningspatronen op EC's met een hoge doorvoer op te leggen (zie review door Warboys et al.12). Computational Fluid Dynamics (CFD) simulaties zijn gebruikt om de ruimtelijke en temporele variatie van schuifspanning in een wervelende put te karakteriseren. De wervelende beweging van cultuurmedium veroorzaakt door de orbitale beweging van het schudplatform waarop de plaat is geplaatst, leidt tot Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF, of putatively pro-atherogene flow) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, of putatively atheroprotective flow) aan de rand van de putten van een 6-wells plaat. De tijdgemiddelde wandschaarspanning (TAWSS) is bijvoorbeeld ongeveer 0,3 Pa in het midden en 0,7 Pa aan de rand van een 6-putplaat die bij 150 tpm met een omloopradius van 5 mm13wordt gewerveld. De methode vereist alleen in de handel verkrijgbaar plastic en de orbitale shaker zelf.
Er is echter een nadeel aan de methode (en aan andere methoden om stromen in vitro op te leggen): EC's geven op een afschuifafhankelijke manier oplosbare mediatoren en microdeeltjes vrij14,15,16 en dit secretoom kan ECs beïnvloeden in andere gebieden van de put dan die waar ze zijn vrijgegeven, als gevolg van het mengen in het wervelende medium. Dit kan de werkelijke effecten van afschuifspanning op het EG-fenotype maskeren. Ghim et al. hebben bijvoorbeeld gespeculeerd dat dit verantwoordelijk is voor de ogenschijnlijk identieke invloed van verschillende afschuifprofielen op het transcellulaire transport van grote deeltjes17.
Hier beschrijven we een methode voor het bevorderen van de hechting van menselijke navelstrengaadotheelcellen (HUVEC) in specifieke gebieden van een 6-putplaat met behulp van fibronectinecoating tijdens het gebruik van Pluronic F-127 om het oppervlak te passiveren en groei elders te voorkomen. De methode lost de hierboven beschreven beperking op, omdat EC's door celgroei te segmenteren slechts één soort afschuifprofiel ervaren en niet worden beïnvloed door secretomen van EC's die elders in de put aan andere profielen worden blootgesteld.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg</td>
			<td>RS</td>
			<td>832-0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel 316</td>
			<td>Metal Supermarket</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5mM)</td>
			<td>Bio Status</td>
			<td>DR50200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>SHA7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Ring Pliers</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWP32-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Rings/Internal/C-Type</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWS35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2+3-D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cura 2.6.2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks 2016</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies

Schuifspanning opgelegd aan de arteriële wand door de bloedstroom beïnvloedt endotheelcelmorfologie en functie. Lage magnitude, oscillatoire en multidirectionele afschuifspanningen zijn allemaal gepostuleerd om een pro-atherosclerotisch fenotype in endotheelcellen te stimuleren, terwijl hoge magnitude en unidirectionele of uniaxiale afschuiving worden verondersteld endotheliale homeostase te bevorderen. Deze hypothesen vereisen verder onderzoek, maar traditionele in vitro technieken hebben beperkingen en zijn bijzonder slecht in het opleggen van multidirectionele schuifspanningen aan cellen. 
Een methode die steeds meer wordt gebruikt, is het gekweekt van endotheelcellen in standaard multi-well platen op het platform van een orbitale shaker; in deze eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer en chronische methode produceert het wervelende medium verschillende patronen en magnitudes van afschuiving, waaronder multidirectionele afschuiving, in verschillende delen van de put. Het heeft echter een aanzienlijke beperking: cellen in één regio, blootgesteld aan één type stroom, kunnen mediatoren afgeven in het medium die cellen in andere delen van de put beïnvloeden, blootgesteld aan verschillende stromen, waardoor de schijnbare relatie tussen stroom en fenotype wordt verstoord. 
Hier presenteren we een eenvoudige en betaalbare aanpassing van de methode waarmee cellen alleen kunnen worden blootgesteld aan specifieke afschuifspanningskenmerken. Celzaden is beperkt tot een bepaald gebied van de put door het gebied van belang te coaten met fibronectine, gevolgd door passivering met passiverende oplossing. Vervolgens kunnen de platen op de shaker worden gewerveld, wat resulteert in blootstelling van cellen aan goed gedefinieerde afschuifprofielen zoals multidirectionele afschuiving met een lage magnitude of uniaxiale afschuiving met een hoge magnitude, afhankelijk van hun locatie. Net als voorheen maakt het gebruik van standaard celkweekplasticware een eenvoudige verdere analyse van de cellen mogelijk. De wijziging heeft al de demonstratie mogelijk gemaakt van oplosbare mediatoren, die vrijkomen uit endotheel onder gedefinieerde kenmerken van schuifspanning, die cellen elders in de put beïnvloeden.

Hechting van HUVECs aan gebieden van de putplaat die niet met fibronectine waren bedekt, werd door Pluronic F-127 passivering ingetrokken; de groei bleef beperkt tot het gebied dat zelfs na 72 uur cultuur bedekt was met fibronectine, met en zonder afschuifspanningstoepassing (figuur 4A, figuur 4C). Zonder de Pluronic F-127 passivering waren HUVECs zonder fibronectine aan het oppervlak bevestigd en hadden zich verder verspreid met...

Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-putplaat voor afschuifspanningstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel.

Segmentering van de groei van endotheelcellen in 6-putplaten op een orbitale shaker voor mechanobiologische studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-put plaat voor pure stresstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel. Een veel voorkomende manier om effecten van stroming op endotheel te bestuderen, is door endotheelcellen in multi-well kweekplaten op een orbitale shaker te gekweekt. De orbitale shaker induceert een golf die rond de put draait.Cellen in het midden van de put ervaren het soort stromen waarvan wordt gedacht dat ze leiden tot atherosclerose. Cellen dichter bij de rand ervaren een stroom waarvan wordt gedacht dat ze beschermend is. Eigenschappen van de cellen in elke regio worden verondersteld af te hangen van de pure stress die ze ervaren.Er is echter een potentiële verdieping in deze logica. Endotheelcellen geven bemiddelaars op een stroomafhankelijke manier vrij. Deze bemiddelaars zullen een uniforme concentratie bereiken in het wervelende medium en zullen daarom cellen aantasten in andere regio's dan die waar ze zijn vrijgegeven.Dat kan de ware effecten van afschuiven op het celgedrag beschadigen of verbergen. Het effect is niet beperkt tot het wervelputsysteem. Het kan zelfs voorkomen in eenvoudige modellen, zoals de parallelle plaatstroomkamer.Het kan worden vermeden door cellen in slechts één deel van het systeem te laten groeien. Hier beschrijven we methoden om celadhesie alleen in het midden of alleen aan de rand van de wervelput toe te staan. Fabricage van roestvrijstalen module.Fabriceer de roestvrijstalen module van een roestvrij staal van klasse 316 volgens een meegeleverde technische tekening. 3D-printen op PMM's. Bereid een 3D CAD-model van PDMs-mal voor met SOLIDWORKS volgens de meegeleverde technische tekening.Exporteer het CAD-model naar een STL-bestand en importeer het STL-bestand naar Cura 2.6.2. Snijd het model in lagen met een afdruksnelheid van 50 millimeter per seconde en een invuldichtheid van 60% Exporteer het bestand als een GCode. Geüpload naar een Ultimaker 3D-printer om te printen.Gebruik polymelkzuur als drukmateriaal. Gieten van PDMS ring. Meng de PDMS-basis en het uithardingsmiddel goed met de verhouding van 90,9% basis en 9,1%-uithardingsmiddel.Giet de goed gemengde oplossing in de 3D-geprinte mal. Verwijder bellen in een vacuüm ontgassingskamer. Hard het een uur uit in een oven van 80 graden.Laat de PDMS-ring afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS-ring voorzichtig uit de mal. Bereiding van 1%Pluronic F-127.Weeg vijf gram Pluronic F-127 af. Giet het in een glazen fles. Voeg vervolgens 100 miljoen Milli-Q water toe aan de glazen fles.Dit geeft een 5%Pluronic F-127 oplossing. Zorg ervoor dat al het Pluronic F-127 poeder in het water is ondergedompeld. Sluit de dop en autoclaaf deze met behulp van een programma voor de sterilisatiecyclus van de vloeistof.Laat de oplossing voor gebruik afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 10 mil 5%Pluronic F-127 oplossing toe aan 40 mil autoclaaf Milli-Q water om 1%Pluronic F-127 oplossing te maken. Voer de verdunning uit in een afzuigkap van een bioveiligheidskast.Bewaar zowel 1% als 5% Pluronic F-127 bij kamertemperatuur. Coating van 6-put plaat. Autoclaaf roestvrijstalen module, PDMS-ring en pincet voor gebruik.Voer alle daaropvolgende procedures uit in een BSC-kap en neem aseptische technieken in acht om steriliteit te garanderen. Plaats de PDMS-ring in een 6-put met een pincet. Gebruik de externe rand van de PDMS-ring om de PDMS-ring concentrisch in de put uit te lijnen.Let op, alleen niet-weefselkweekbehandelde putplaten mogen worden gebruikt. Plaats de roestvrijstalen module met een pincet op de PDMS-ring. Steek de uiteinden van de interne borgringtang in de greepgrepen van de borgring.Knijp in de houder om de diameter van de borgring te verkleinen. Plaats het in de 6-put, druk het stevig op de roestvrijstalen module en laat de tang los om de PDMS-ring in de put te zetten. Voeg een mil van vijf microgram per microliter fibronectine toe aan het midden of de rand van de put, afhankelijk van de interesseregio, door het openen van PDMS-ring en roestvrijstalen module.Wervel de plaat om ervoor te zorgen dat de fibronectine-oplossing alle interessegebieden bestrijkt. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden in een bevochtigde incubator onder 95% lucht en 5% CO2. Verwijder de fibronectineoplossing uit de put.En nu twee keer wassen met PBS. Als u klaar bent, verwijdert u de PBS volledig uit de put. Verwijder de borgring, roestvrijstalen module en PDMS-ring uit de put.Voeg 1,5 mil 1%Pluronic F-127 toe aan de put en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur om het ongecoate oppervlak te passiveren. Haal de Pluronic F-127 oplossing uit de put en was driemaal met PBS. Eenmaal gewassen, gebruik de gecoate put onmiddellijk of bewaar op vier graden gedurende maximaal twee weken met de laag PBS in de gecoate put.Zaaien van endotheelcellen. Tel cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 180.000 cellen in een gecoate 6-put plaat in 1,5 mil pre-warm celkweekmedium. Schud de putplaat zijdelings om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig in de put verdelen.Laat het 's nachts in een 37 graden bevochtigde incubator onder 95% lucht en 5% CO2. Shear stress applicatie met behulp van een orbitale shaker. Cellen moeten na drie dagen groei samenvloeien.Vervang het medium door 1,9 mil voorgeïnd waarschuw celkweekmedium om een hoogte van twee millimeter te bereiken. Plaats een putplaat op het platform van een orbitale shaker in een bevochtigde incubator en wervel deze drie dagen bij 150 RPM. Optioneel kunnen na twee dagen afschuiven cytokinen worden toegevoegd aan het celkweekmedium om het samenspel tussen cytokinen en pure stress te onderzoeken.Knip na de behandeling de cellen nog een dag af. In deze studie werd TNF-alpha gebruikt om de cellen te activeren. Voer de analyse uit na drie dagen van afschuifspanning.Microscoopbeelden tonen aan dat Pluronic F-127 HUVEC-hechting aan het gebied voorkwam zonder fibronectinecoating. Er waren geen HUVECs bevestigd aan het deel van het putoppervlak dat niet was voorbehandeld met fibronectine vóór passivering van Pluronic F-127 na 24 uur, in figuur A, en 72 uur, in figuur C, van de groei. Zonder Pluronic F-127 passivering werden HUVECs zonder fibronectine aan het oppervlak bevestigd, 24 uur na het zaaien, in figuur B, en worden ze verder verspreid met 72 uur, in figuur D.De schaalbalk is gelijk aan 500 micrometer.Nucleaire rode vlek toont de morfologie van geschoren HUVECs, A, in het midden, en B, aan de rand van een volledige put. Schaalbalk is gelijk aan honderd micrometer. A en B tonen ook celcontouren afgebakend door immunostaining van ZO-1.Let op de uitlijning en rek van cellen aan de rand, maar niet in het midden. Het toont geen significant verschil in nucleaire vormindex, wat wijst op rondheid, tussen HUVECs die in volle put zijn gekweekt en gesegmenteerde putten werden waargenomen voor onbehandelde of met TNF-alfa behandelde HUVECs. Cellen waren meer langwerpig aan de rand van de put.Een tendens naar een grotere rek in met TNF-alfa behandelde HUVECs was niet consistent significant op verschillende locaties. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen volledige en gesegmenteerde putten in dichtheidsaantal A, onbehandeld, en B, TNF-alfa-behandelde HUVECs op verschillende radiale locaties. In beide gevallen waren er meer cellen per eenheidsgebied aan de rand dan in het midden van de put.Concluderend, de methode die we hier hebben geschetst, stelt u in staat om cellen te laten groeien in slechts één gebied van de wervelende put of zelfs van elk op plastic gebaseerd celkweeksysteem. Dat betekent dat cellen in een deel van de put die één type stroom ervaren, niet worden beïnvloed door bemiddelaars die vrijkomen uit cellen in een andere regio die verschillende stromen ervaren. Niet alleen dat, we kunnen kijken naar cellen die in één regio worden gekweekt met of zonder cellen die in andere regio's worden gekweekt.Dat maakt het mogelijk om de effecten van dergelijke oplosbare mediatoren aan te toonden. Het testen van de effecten van geconditioneerd medium op naïeve cellen maakt hetzelfde mogelijk. Door het conditiemedium te analyseren, kunnen de bemiddelaars worden geïdentificeerd.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

Gentransfectie richting Sferoïde Cellen op micropatterned Cultuur Platen voor genetisch gemodificeerde Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Een cultuur van zoogdiercellen schudden in O-vormige schepen tot uniforme aggregaten orbitaal

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...