Name: segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

저자는 감사하게 영국 심장 재단 프로젝트 보조금을 인정 (PDW), 국립 의학 연구 위원회 싱가포르 TAAP 및 DYNAMO 보조금 (XW, NMRC / OFLCG/ 004/2018, NMRC / OFLCG / 0017), A * 스타 대학원 장학금 (KTP에), 및 연구 우수 의 영국 심장 재단 센터 (MAP에).

1. 장치 제조 및 시약 준비
<ol><li>스테인레스 스틸 모듈 의 제조<ol>
<li>제공된 엔지니어링 도면에 따라 CNC 밀링 머신을 사용하여 316등급 스테인리스 스틸 모듈을 제조한다(도1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>폴리디메틸실록산(PDMS) 금형의 3D 프린팅<ol>
<li>제공된 엔지니어링 도면에 따라 SolidWorks를 사용하여 PDMS 금형의 3D 컴퓨터 지원 설계(CAD) 모델을 준비한다(그림2).</stron...

<ol>
	<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li><li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Sensing+of+Flow+Direction.">Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).</li><li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress.">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437, 426-431 (2005).</li><li>Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+and+compliance+of+endothelial+cells+after+shear+stress+in+vitro+or+from+different+aortic+regions:+Scanning+ion+conductance+microscopy+study.">Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study.</a> PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).</li><li>Asakura, T., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Patterns+and+Spatial+Distribution+of+Atherosclerotic+Lesions+in+Human.">Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human.</a> Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).</li><li>Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+evidence+for+a+change+in+the+pattern+of+aortic+wall+shear+stress+with+age.">Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).</li><li>Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fluid+mechanics+in+the+localization+and+detection+of+atherosclerosis.">The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis.</a> Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).</li><li>Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+rheological+system+for+studying+the+effect+of+fluid+shear+stress+on+cultured+cells.">Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells.</a> The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).</li><li>Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+and+orientation+of+cultured+endothelial+cells+in+response+to+shear+stress.">The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress.</a> Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).</li><li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells.">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li><li>Venugopal Menon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+microfluidic+3D+stenosis+model+to+study+leukocyte-endothelial+interactions+in+atherosclerosis.">A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis.</a> APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).</li><li>Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium:+A+review+of+the+orbital+shaker+method.">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li><li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator.">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).</li><li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture:+comparison+of+aortic,+venous,+capillary,+and+corneal+endothelium.">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li><li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS/MS.">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li><li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure.">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li><li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow.">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li><li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta.">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li></ol>

소용돌이 잘 하는 방법은 단일 우물에서 복잡한 흐름 프로파일을 생성할 수 있습니다- 중앙에 낮은 크기 다방향 흐름 (LMMF) 및 웰의 가장자리에 높은 크기 동방 흐름 (HMUF). 그러나, 용해 성 중재자의 전단 응력 매개 분비물은 소용돌이 배지에서 혼합되고 전체적으로 세포에 영향을 미치며, 잠재적으로 세포에 특정 전단 응력 프로파일의 진정한 효과를 마스킹한다.
여기서 입증?...

그들의 기계적 환경에 혈관 세포의 반응은 혈관의 정상적인 기능과 질병1의발달에서 중요하다. 모든 혈관의 내부 표면을 일렬로 세이는 내피 세포(EC)의 기계생물학은 EC가 혈류에 의해 생성되는 전단 스트레스를 직접 경험하기 때문에 메카노생물학적 연구의 특정 초점이었습니다. 염증 반응, 변형된 강성 및 형태학, 혈관 활성 물질의 방출 및 접합 단백질의 국소화 및 발현과 같은 다양한 표현성 변화는 전단 응력2,3,4에EC 노출에 의존한다. 전단 의존성 내피 특성은 죽상 동맥 경화증5,6,7과같은 질병의 패치 개발을 설명할 수도 있다.
응력을 제어할 수 있는 문화권에서 전단이 IC에 미치는 영향을 연구하는 것이 유용하며, 다른 세포 유형으로부터 EC를 분리할 수 있습니다. 일반적으로 전단 응력적용을 위해 시험관내 장치에 사용되는 경우 병렬 플레이트 흐름 챔버와 원뿔 및 플레이트 바이코커만 포함하지만, 단원성 안정성, 진동 및 맥동유만8,9를적용할 수 있다. 스테노틱 기하학을 모방하는 테이퍼 또는 분기 형상 및 미세 유체 칩이 있는 수정된 유동 챔버가 개발되었지만, 낮은 처리량과 상대적으로 짧은 배양 기간은도전 10, 11을제기한다.
궤도 셰이커의 플랫폼에 배치된 표준 세포 배양 플라스틱웨어에서 세포가 재배되는 내피 메카노트랜스덕션 연구를 위한 궤도 셰이커(또는 소용돌이 잘 잘 돌리는) 방법은 만성적으로 복잡하고 공간적으로 다양한 전단 응력 패턴을 높은 처리량으로 EC에 부과할 수 있기 때문에 주목받고 있다(또는 소용돌이 잘 잘 돌리는) 방법(Warboys etalal12참조). 전산 유체 역학(CFD) 시뮬레이션은 소용돌이치는 우물에서 전단 응력의 공간 적 및 측두적인 변화를 특성화하기 위해 사용되었습니다. 플레이트가 배치되는 셰이커 플랫폼의 궤도 이동에 의해 야기되는 배양 배지의 소용돌이 운동은 6웰 플레이트의 우물 가장자리에 있는 중앙 및 고진도 동축 흐름(HMUF, 또는 putheroprotectionprotection flow)의 저진도 다방향 흐름(LMMF 또는 putativeandpro-atherogenic flow)으로 이어집니다. 예를 들어, 시간 평균 벽 전단 응력(TAWSS)은 중앙에 약 0.3Pa, 5mm 궤도 반경13로150rpm에서 소용돌이치는 6웰 플레이트 가장자리에서 0.7 Pa이다. 이 방법은 시판되는 플라스틱 제품과 궤도 셰이커 자체만 필요합니다.
그러나, 방법(및 시험관내에서 흐름을 부과하는 다른 방법에 대한 단점)에 대한 단점이 있다: EC는 전단 의존성 방식으로 용해성 중재자 및 미세입자를방출14,15,16 및 이 분비물은 소용돌이 치는 매체의 혼합으로 인해 방출된 것 이외의 우물의 영역에서 EC에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 EC 표현형에 전단 응력의 실제 효력을 마스크할 수 있습니다. 예를 들어, Ghim 외는 이것이 큰 입자의 세포간 수송에 대한 다른 전단 프로파일의 명백히 동일한 영향을 차지한다고추측했다(17).
여기서 우리는 플루론 F-127을 사용하여 표면을 통과시키고 다른 곳에서 성장을 방지하는 동안 섬유네틴 코팅을 사용하여 6웰 플레이트의 특정 영역에서 인간 배빌루칼 정맥 내피 세포(HUVEC) 접착을 촉진하는 방법을 설명한다. 이 방법은 셀 성장을 분할함으로써 EC가 한 종류의 전단 프로파일만 경험하고 우물의 다른 다른 프로파일에 노출된 다른 프로파일에 노출된 EC의 분비에 의해 영향을 받지 않기 때문에 위에서 설명한 한계를 해결합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg</td>
			<td>RS</td>
			<td>832-0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel 316</td>
			<td>Metal Supermarket</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5mM)</td>
			<td>Bio Status</td>
			<td>DR50200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>SHA7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Ring Pliers</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWP32-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Rings/Internal/C-Type</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWS35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2+3-D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cura 2.6.2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks 2016</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies

혈액의 흐름에 의해 동맥 벽에 부과 된 전단 스트레스는 내피 세포 형태와 기능에 영향을 미칩니다. 낮은 크기, 진동 및 다방향 전단 응력은 모두 내피 세포에서 프로 죽상 경화성 표현형을 자극하기 위해 가정되어 왔지만, 반면 높은 크기와 단방향 또는 단방향 또는 단방향 전단은 내피 집집성을 촉진하는 것으로 생각된다. 이러한 가설은 추가 조사를 필요로하지만, 전통적인 체외 기술은 한계가 있으며, 세포에 다방향 전단 응력을 부과하는 특히 가난합니다. 
점점 더 많은 사용을 얻고 있는 한 가지 방법은 궤도 셰이커의 플랫폼에 표준 다중 우물 판에서 내피 세포를 배양하는 것입니다. 이 간단하고 저렴한 고처리량 및 만성 방법에서 소용돌이 치는 매체는 다방향 전단을 포함한 다양한 패턴과 전단의 크기를 우물의 다른 부분에서 생성합니다. 그러나, 한 영역의 세포는 한 가지 유형의 흐름에 노출되어, 다른 흐름에 노출된 웰의 다른 부분에서 세포에 영향을 미치는 배지로 중재자를 방출할 수 있으므로 흐름과 표현형 사이의 명백한 관계를 왜곡할 수 있다. 
여기서 우리는 세포가 특정 전단 응력 특성에만 노출 될 수있는 방법의 쉽고 저렴한 수정을 제시한다. 세포 파종은 섬유넥틴으로 관심 영역을 코팅한 다음 통과 용액을 사용하여 통과함으로써 우물의 정의된 영역으로 제한됩니다. 이어서, 플레이트는 셰이커에 소용돌이칠 수 있으며, 그 결과 위치에 따라 저크기 다방향 전단 또는 높은 크기의 단방향 전단과 같은 잘 정의된 전단 프로파일에 세포가 노출될 수 있다. 이전과 마찬가지로 표준 세포 배양 플라스틱웨어를 사용하면 세포에 대한 간단한 추가 분석이 가능합니다. 수정은 이미 잘의 다른 곳에 있는 세포에 영향을 미치는 정의된 전단 응력 특성의 밑에 내피성에서 풀어 놓인 수용성 중재자의 데모를 허용했습니다.

섬유넥틴으로 코팅되지 않은 웰 플레이트의 영역에 HUVECs의 접착은 Pluronic F-127 패시비션에 의해 파괴되었다; 성장은 전단 응력적용(도 4A, 도 4C)의사용 및 없이 72h 문화의 후에도 섬유네틴으로 코팅된 부위에 국한되었다. 플루론 F-127 패시베이션없이, HUVECs는 섬유 네틴없이 표면에 부착하고 문화의 72 h에 의해 더 확산했다<strong cl...

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Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

본 프로토콜은 궤도 셰이커 모델을 사용하여 전단 응력 응용을 위한 6웰 플레이트의 특정 영역으로 내피 세포 성장을 제한하는 코팅 방법을 설명한다.

메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

본 프로토콜은 궤도 셰이커 모델을 사용하여 투명 응력 응용을 위해 내피 세포 성장을 6웰 플레이트의 특정 영역으로 제한하는 코팅 방법을 설명합니다. 내피성에 대한 흐름의 효과를 연구하는 일반적인 방법은 궤도 셰이커에 다중 잘 배양 판에서 내피 세포를 배양하는 것입니다. 궤도 셰이커는 우물 주위를 회전하는 파도를 유도합니다.우물의 중심에 있는 세포는 죽상 경화증으로 이끌어 내는 것으로 생각되는 흐름의 종류를 경험합니다. 보호로 생각 되는 가장자리 경험 흐름에 가까운 세포. 각 영역에 있는 세포의 속성은 그(것)들이 경험하는 깎아지른 듯한 응력에 달려 있는 가정됩니다.그러나 이 논리에는 잠재적인 바닥이 있습니다. 내피 세포는 흐름 의존적 방식으로 중재자를 방출합니다. 이 중재자는 소용돌이 치는 매체에 있는 균일한 농도에 도달하고 그러므로 풀어 놓인 것 보다는 다른 지역에 있는 세포에 영향을 미칩니다.이는 전단이 세포 행동에 미치는 실제 효과를 손상시키거나 숨길 수 있습니다. 효과는 소용돌이 잘 시스템에 국한되지 않습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버와 같은 간단한 모델에서도 발생할 수 있습니다.그것은 시스템의 한 부분에서 세포를 성장하 여 피할 수 있다. 여기서는 중앙또는 소용돌이의 가장자리에서만 셀 접착을 허용하는 방법을 설명합니다. 스테인레스 스틸 모듈의 제조.제공된 엔지니어링 도면에 따라 316등급 스테인리스 스틸에서 스테인리스 스틸 모듈을 제작합니다. PDM의 3D 프린팅은 제공된 엔지니어링 도면에 따라 SOLIDWORKS를 사용하여 PDM 금형의 3D CAD 모델을 준비합니다.CAD 모델을 STL 파일로 내보내고 STL 파일을 큐라 2.6.2로 가져옵니다. 모델을 초당 50밀리미터의 인쇄 속도로 레이어로 슬라이스하고 60%의 채우기 밀도가 있는 레이어로 모델을 GCode로 내보냅니다. 인쇄를 위해 Ultimaker 3D 프린터에 업로드했습니다.폴리락산을 인쇄 재료로 사용하십시오. PDMS 링의 주조. PDMS 베이스와 경화제를 90.9%의 염기및 9.1%의 경화제의 비율로 잘 섞는다.잘 혼합된 용액을 3D 프팅 금형에 붓습니다. 진공 탈기 챔버에서 거품을 제거합니다. 80도 용광로에서 1 시간 동안 치료하십시오.PDMS 링이 실온으로 냉각되도록 합니다. 그런 다음 경화 된 PDMS 링을 금형에서 조심스럽게 제거하십시오. 1%의 플로론 F-127 의 준비.푸론 F-127의 5 그램을 무게. 유리 병에 붓습니다. 그런 다음 유리 병에 밀리-Q 물 100마리를 넣습니다.이것은 5 % 플로론 F-127 솔루션을 제공합니다. 모든 플로론 F-127 분말이 물에 잠겨 있는지 확인합니다. 액체 살균 주기 프로그램을 사용하여 캡을 닫고 자동 복제합니다.사용 전에 실온으로 용액을 식히십시오. 오토클레이브 밀리-Q 물 40mil에 5%의 플로론 F-127 용액 10mil을 추가하여 1%의 플로론 F-127 솔루션을 만듭니다. 바이오 세이프티 캐비닛 후드에서 희석을 수행합니다.실온에서 1%와 5%의 플로론 F-127을 모두 보관하십시오. 6 웰 플레이트의 코팅. 자동 클러브 스테인레스 스틸 모듈, PDMS 링 및 핀셋을 사용하기 전에 사용할 수 있습니다.BSC 후드에서 모든 후속 절차를 수행하고 멸균을 보장하기 위해 무균 기술을 관찰하십시오. 핀셋을 사용하여 PDMS 링을 6웰에 배치합니다. PDMS 링의 외부 림을 사용하여 PDMS 링을 웰 내에서 동심으로 정렬합니다.참고, 비 조직 배양 처리 웰 플레이트만 사용해야 합니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 링 위에 스테인레스 스틸 모듈을 놓습니다. 내부 고정 링 펜치의 팁을 고정 링의 그립 홀드에 삽입합니다.홀더를 짜서 고정 링의 직경을 줄입니다. 6-well에 넣고 스테인레스 스틸 모듈에 단단히 누르고 펜치를 방출하여 PDMS 링을 웰에 고정시하십시오. PDMS 링 및 스테인레스 스틸 모듈의 개방을 통해 관심 영역에 따라 마이크로 리터 섬유 네틴 당 5 마이크로 그램의 1 마일을 우물의 중심 또는 가장자리에 추가합니다.섬유넥틴 용액이 관심 의 모든 영역을 커버 할 수 있도록 플레이트를 소용돌이. 95%의 공기와 5%CO2 미만의 가습 인큐베이터에서 37도에서 30분 동안 배양하십시오. 우물에서 섬유네틴 용액을 제거합니다.그리고 지금 PBS와 두 번 씻어. 완료되면, 완전히 우물에서 PBS를 제거합니다. 웰에서 고정 링, 스테인레스 스틸 모듈 및 PDMS 링을 제거합니다.1.5 mil의 1%플루론 F-127을 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하여 코팅되지 않은 표면을 통과합니다. 플루론 F-127 용액을 우물에서 제거하고 PBS로 세 번 세척하십시오. 씻으면 코팅된 코팅을 즉시 사용하거나 코팅된 PBS 층과 함께 최대 4도까지 보관하십시오.내피 세포의 파종. 혈혈계및 종자(180, 000)를 사용하여 세포를 전온 세포 배양 배지의 1.5mil에서 코팅된 6웰 플레이트로 카운트한다. 우물 판을 측면으로 흔들어 세포가 우물에서 균등하게 분포되도록 합니다.하룻밤 사이에 95%의 공기와 5%의 CO2 아래에서 37도 가습 인큐베이터에 둡니다. 궤도 셰이커를 사용하여 전단 응력 응용 프로그램입니다. 세포는 성장의 3 일 후에 합류에 도달해야 합니다.배지를 사전 경고 세포 배양 배지의 1.9 mil로 교체하여 2밀리미터의 높이를 달성한다. 가습된 인큐베이터에 궤도 셰이커의 플랫폼에 우물 판을 놓고 3 일 동안 150 RPM에서 소용돌이. 선택 사항, 전단의 이틀 후, 사이토카인은 세포 배양 배지에 첨가하여 사이토카인과 깎아지른 듯한 스트레스 사이의 상호 작용을 조사할 수 있다.치료 후, 다른 하루 동안 세포를 전단. 이 연구에서는, TNF-알파세포를 활성화하기 위하여 이용되었다. 전단 응력 적용 3일 후에 분석을 수행합니다.현미경 이미지는 Pluronic F-127이 섬유넥틴 코팅없이 지역에 HUVEC 접착을 방지한 것을 보여줍니다. 24시간 후, 그림 A에서 72시간, 그림 C에서, 32시간 후, 푸론 F-127의 통과 전에 섬유네틴으로 전처리되지 않은 우물 표면의 일부에 HUVEC가 부착되지 않았다. Pluronic F-127 패시베이션없이, HUVECs는 섬유 네틴없이 표면에 부착되었다, 파종 후 24 시간, 그림 B에서, 그리고 72 시간 더 증식, 그림 D.에서 스케일 바는 500 마이크로미터에 동일하다.핵 붉은 얼룩은 전체 우물의 가장자리에, 중앙에, A, 및 B의 형태를 보여줍니다. 스케일 바는 백 마이크로미터와 같습니다. A와 B는 또한 ZO-1의 면역 염색에 의해 묘사된 세포 윤곽을 보여줍니다.모서리에 있는 셀의 정렬 및 신장은 중앙에 있지 않습니다. 그것은 핵 형상 지수에 유의한 차이를 보여줍니다, 전체 잘 자란 HUVEC 사이의 둥근을 나타내는 및 분할 된 우물 치료 또는 TNF 알파 처리 HUVECs에 대한 볼 수 있었다. 세포는 우물의 가장자리 근처에 더 길었다.TNF 알파 처리 HUVECs에서 더 큰 신장에 대한 경향은 위치에 걸쳐 일관되게 중요하지 않았다. 다른 방사형 위치에서 A, 처리되지 않은 및 B, TNF 알파 처리 HUVECs의 밀도 수에서 전체 및 분할 된 우물 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 두 경우 모두, 우물의 중심보다 가장자리에 단위 영역 당 더 많은 세포가 있었다.결론적으로, 우리가 여기에서 설명한 방법은 플라스틱 기반 세포 배양 시스템의 소용돌이 또는 실제로 한 영역에서 세포를 성장시킬 수 있습니다. 즉, 한 유형의 흐름을 경험하는 한 부분의 세포는 다른 흐름이 발생하는 다른 영역에서 세포에서 방출되는 중재자에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 의미합니다. 뿐만 아니라, 우리는 세포가 그밖 지구에서 성장되거나 없이 한 지역에서 성장한 세포를 볼 수 있습니다.이를 통해 이러한 수용성 중재자의 효과를 입증할 수 있습니다. 순진한 세포에 조건부 배지의 효과 테스트 는 동일한 것을 허용. 조건 매체를 분석함으로써, 중재자를 식별할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

온칩 내피 염증성 Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

연구

생체공학

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

유 전적으로 변형 된 세포 이식을위한 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 세포를 향해 유전자 형질

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

균일 한 골 재를 생산 하 오 모양의 혈관에 포유류 세포의 문화를 떨고는 궤도

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...