Name: segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner takknemlig et British Heart Foundation-prosjektstipend (til PDW), et National Medical Research Council Singapore TAAP og DYNAMO Grant (til XW, NMRC / OFLCG/004/2018, NMRC / OFLCG/001/2017), et A * STAR Graduate Scholarship (til KTP) og et British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (til MA).

1. Fabrikasjon av enheter og tilberedning av reagenser
<ol><li>Fabrikasjon av rustfritt stål modul<ol>
<li>Fremstille modulen i rustfritt stål fra en klasse 316 rustfritt stål ved hjelp av en CNC-fresemaskin i henhold til den tekniske tegningen som følger med (figur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D-utskrift av en polydimetylsiloksanform (PDMS)<ol>
<li>Klargjør en CAD-modell (3D Computer Aided Design) av PDMS-formen ved hjelp av SolidWorks i henhold til den tekniske tegningen som følger ...

<ol>
	<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li><li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Sensing+of+Flow+Direction.">Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).</li><li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress.">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437, 426-431 (2005).</li><li>Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+and+compliance+of+endothelial+cells+after+shear+stress+in+vitro+or+from+different+aortic+regions:+Scanning+ion+conductance+microscopy+study.">Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study.</a> PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).</li><li>Asakura, T., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Patterns+and+Spatial+Distribution+of+Atherosclerotic+Lesions+in+Human.">Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human.</a> Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).</li><li>Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+evidence+for+a+change+in+the+pattern+of+aortic+wall+shear+stress+with+age.">Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).</li><li>Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fluid+mechanics+in+the+localization+and+detection+of+atherosclerosis.">The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis.</a> Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).</li><li>Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+rheological+system+for+studying+the+effect+of+fluid+shear+stress+on+cultured+cells.">Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells.</a> The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).</li><li>Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+and+orientation+of+cultured+endothelial+cells+in+response+to+shear+stress.">The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress.</a> Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).</li><li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells.">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li><li>Venugopal Menon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+microfluidic+3D+stenosis+model+to+study+leukocyte-endothelial+interactions+in+atherosclerosis.">A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis.</a> APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).</li><li>Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium:+A+review+of+the+orbital+shaker+method.">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li><li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator.">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).</li><li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture:+comparison+of+aortic,+venous,+capillary,+and+corneal+endothelium.">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li><li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS/MS.">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li><li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure.">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li><li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow.">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li><li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta.">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li></ol>

Den virvlende brønnmetoden er i stand til å generere komplekse strømningsprofiler i en enkelt brønn - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) på kanten av brønnen. Skjærstressmediert sekreter av løselig mediator vil imidlertid bli blandet i det virvlende mediet og påvirke celler i hele brønnen, og potensielt maskere den sanne effekten av en bestemt skjærstressprofil på cellene.
Beleggmetoden som er demonstrert her, overvinner dette...

Responser av vaskulære celler til deres mekaniske miljø er viktige i normal funksjon av blodkar og i utviklingen av sykdom1. Mekanobiologien til endotelcellene (ECs) som strekker den indre overflaten av alle blodkar har vært et spesielt fokus på mekanobiologisk forskning fordi ECs direkte opplever skjærspenningen generert av blodstrøm over dem. Ulike fenotypiske endringer som inflammatoriske responser, endret stivhet og morfologi, frigjøring av vasoaktive stoffer og lokalisering og uttrykk for koblingsproteiner avhenger av EC-eksponering for skjærspenning2,3,4. Skjæravhengige endotelegenskaper kan også redegjøre for den klumpete utviklingen av sykdommer som aterosklerose5,6,7.
Det er nyttig å studere effekten av skjær på ECs i kultur, hvor stress kan kontrolleres, og ECs kan isoleres fra andre celletyper. Vanligvis brukte in vitro-enheter for påføring av skjærspenning på ECer inkluderer parallellplatestrømningskammeret og kjegle-og-plate-viscometeret, men bare uniaxial steady, oscillatorisk og pulsatile strømning kan påføres8,9. Selv om modifiserte strømningskamre med koniske eller forgrenende geometrier og mikrofluidiske sjetonger som etterligner en stenotisk geometri er utviklet, er deres lave gjennomstrømning og den relativt korte kulturvarigheten som er mulig utgjøre en utfordring10, 11.
Orbital shaker (eller virvlende godt) metoden for studiet av endotel mechanotransduction, der celler dyrkes i standard cellekultur plasticware plassert på plattformen til en orbital shaker, får økende oppmerksomhet fordi den er i stand til kronisk imponerende komplekse, romlig varierende skjær stress mønstre på ECs med høy gjennomstrømning (se gjennomgang av Warboys et al.12). Beregningsvæskedynamikk (CFD) simuleringer har blitt brukt for å karakterisere den romlige og tidsmessige variasjonen av skjærspenning i en virvlende brønn. Den virvlende bevegelsen til kulturmediet forårsaket av shakerplattformens orbitale bevegelse der platen er plassert, fører til lav størrelses flerveis strømning (LMMF, eller putativt pro-aterogen strømning) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, eller putativt atheroprotective strømning) på kanten av brønnene til en 6-brønns plate. For eksempel er tidsgjennomsnittet veggskjærspenning (TAWSS) omtrent 0,3 Pa i midten og 0,7 Pa på kanten av en 6-brønns plate virvlet ved 150 rpm med en 5 mm orbital radius13. Metoden krever bare kommersielt tilgjengelig plasttøy og selve orbital shakeren.
Det er imidlertid en ulempe med metoden (og til andre metoder for å pålegge strømmer in vitro): ECs frigjør løselige mediatorer og mikropartikler på en skjæravhengig måte14,15,16 og dette sekretomet kan påvirke ECs i regioner i brønnen annet enn den de ble utgitt i, på grunn av blandingen i det virvlende mediet. Dette kan maskere de faktiske effektene av skjærspenning på EC fenotype. For eksempel har Ghim et al. spekulert i at dette står for den tilsynelatende identiske påvirkningen av forskjellige skjærprofiler på transcellulær transport av store partikler17.
Her beskriver vi en metode for å fremme humant navlestrengs vene endotelcelle (HUVEC) vedheft i bestemte områder av en 6-brønns plate ved hjelp av fibronektinbelegg mens du bruker Pluronic F-127 for å passivisere overflaten og forhindre vekst andre steder. Metoden løser begrensningen beskrevet ovenfor fordi EC-er ved å segmentere cellevekst bare opplever én type skjærprofil, og påvirkes ikke av sekreter fra ECer som er eksponert for andre profiler andre steder i brønnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg</td>
			<td>RS</td>
			<td>832-0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel 316</td>
			<td>Metal Supermarket</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5mM)</td>
			<td>Bio Status</td>
			<td>DR50200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>SHA7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Ring Pliers</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWP32-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Rings/Internal/C-Type</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWS35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2+3-D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cura 2.6.2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks 2016</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies

Skjærspenning pålagt arterieveggen ved blodstrømmen påvirker endotelcellemorfologi og funksjon. Lav størrelse, oscillatoriske og flerveis skjærspenninger har alle blitt postulert for å stimulere en pro-aterosklerotisk fenotype i endotelceller, mens høy størrelse og enveis eller enaksial skjær antas å fremme endotelial homeostase. Disse hypotesene krever videre undersøkelser, men tradisjonelle in vitro-teknikker har begrensninger, og er spesielt dårlige til å pålegge flerveis skjærspenninger på celler. 
En metode som får økende bruk er å dyrke endotelceller i standard multi-brønnplater på plattformen til en orbital shaker; I denne enkle, rimelige, høye gjennomstrømnings- og kroniske metoden produserer det virvlende mediet forskjellige mønstre og størrelser av skjær, inkludert flerveis skjær, i forskjellige deler av brønnen. Det har imidlertid en betydelig begrensning: celler i en region, utsatt for en type strømning, kan frigjøre mediatorer i mediet som påvirker celler i andre deler av brønnen, utsatt for forskjellige strømmer, og dermed forvrenge den tilsynelatende sammenhengen mellom strømning og fenotype. 
Her presenterer vi en enkel og rimelig modifikasjon av metoden som gjør at celler bare kan eksponeres for spesifikke skjærspenningsegenskaper. Cellesåing er begrenset til en definert region av brønnen ved å belegge regionen av interesse med fibronectin, etterfulgt av passivasjon ved hjelp av passiviseringsløsning. Deretter kan platene virvles på shakeren, noe som resulterer i eksponering av celler for veldefinerte skjærprofiler som lav størrelse flerveis skjær eller høy størrelse uniaxial skjær, avhengig av deres plassering. Som før tillater bruk av standard cellekulturplastikkvare enkel videre analyse av cellene. Modifikasjonen har allerede tillatt demonstrasjon av løselige meglere, frigjort fra endotel under definerte skjærspenningsegenskaper, som påvirker celler som ligger andre steder i brønnen.

Vedheft av HUVECs til regioner av brønnplaten som ikke er belagt med fibronectin ble abrogated av Pluronic F-127 passivasjon; veksten var begrenset til regionen belagt med fibronectin selv etter 72 h kultur, med og uten skjær stress søknad (Figur 4A, Figur 4C). Uten Pluronic F-127 passivasjon festet HUVECene seg til overflaten uten fibronectin og hadde spredt seg ytterligere med 72 timers kultur (Figur 4B<...

Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Denne protokollen beskriver en beleggmetode for å begrense endotelcellevekst til et bestemt område av en 6-brønns plate for skjærspenningsapplikasjon ved hjelp av orbital shaker-modellen.

Segmentering av vekst av endotelceller i 6-brønnsplater på en orbital shaker for mekanobiologiske studier

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Denne protokollen beskriver en beleggmetode for å begrense endotelcellevekst til et bestemt område av en 6-brønns plate for ren stressapplikasjon ved hjelp av orbital shaker-modellen. En vanlig måte å studere effekter av strømning på endotel er å dyrke endotelceller i multi-brønn kulturplater på en orbital shaker. Orbital shaker induserer en bølge som roterer rundt brønnen.Celler i sentrum av brønnen opplever den typen strømmer som antas å føre til aterosklerose. Celler nærmere kanten opplever flyt som antas å være beskyttende. Egenskapene til cellene i hver region antas å avhenge av de rene påkjenningene de opplever.Det er imidlertid et potensielt gulv i denne logikken. Endotelceller frigjør mediatorer på en strømningsavhengig måte. Disse meglerne vil nå en jevn konsentrasjon i det virvlende mediet og vil derfor påvirke celler i andre regioner enn den de ble løslatt.Det kan ødelegge eller skjule sanne effekter av skråstilling på celleatferd. Effekten er ikke begrenset til det virvlende brønnsystemet. Det kan forekomme selv i enkle modeller, som parallellplatestrømningskammeret.Det kan unngås ved å vokse celler i bare en del av systemet. Her beskriver vi metoder for å tillate celleadhesjon bare i midten eller bare på kanten av den virvlende brønnen. Fabrikasjon av rustfritt stål modul.Fabriker modulen i rustfritt stål fra en klasse 316 rustfritt stål i henhold til en ingeniørtegning som følger med. 3D-utskrift på PDMer. Klargjør en 3D CAD-modell av PDMs-form ved hjelp av SOLIDWORKS i henhold til den tekniske tegningen som følger med.Eksporter CAD-modellen til en STL-fil, og importer STL-filen til Cura 2.6.2. Del modellen i lag med en utskriftshastighet på 50 millimeter per sekund og fyll ut tettheten på 60 %Eksporter filen som en GCode. Lastet den opp til en Ultimaker 3D-skriver for utskrift.Bruk polylaktisk syre som utskriftsmateriale. Støping av PDMS-ring. Bland PDMS-base- og herdemiddelet godt med forholdet mellom 90,9 % base og 9,1 % herdemiddel.Hell den godt blandede løsningen i den 3D-trykte formen. Fjern bobler i et vakuumavgassingskammer. Herd den i en time i en 80 graders ovn.La PDMS-ringen avkjøles til romtemperatur. Fjern deretter den herdede PDMS-ringen forsiktig fra formen. Forberedelse av 1% Pluronic F-127.Vei ut fem gram Pluronic F-127. Hell den i en glassflaske. Tilsett deretter hundre mil Milli-Q vann i glassflasken.Dette gir en 5% Pluronic F-127-løsning. Pass på at alt Pluronic F-127 pulver er nedsenket i vannet. Lukk hetten og autoklaver den ved hjelp av et flytende steriliseringssyklusprogram.La oppløsningen avkjøles til romtemperatur før bruk. Tilsett 10 mil med 5% Pluronic F-127-løsning til 40 mil autoklavert Milli-Q-vann for å lage 1% Pluronic F-127-løsning. Utfør fortynning i en biosikkerhetsskapshette.Oppbevar både 1% og 5%Pluronic F-127 ved romtemperatur. Belegg av 6-brønns plate. Autoklaver modul i rustfritt stål, PDMS-ring og pinsett før bruk.Utfør alle etterfølgende prosedyrer i en BSC-hette og følg aseptiske teknikker for å sikre sterilitet. Plasser PDMS-ringen i en 6-brønn ved hjelp av pinsett. Bruk den ytre kanten på PDMS-ringen til å justere PDMS-ringen konsentrisk i brønnen.Merk at bare ikke-vevskulturbehandlede brønnplater skal brukes. Plasser modulen i rustfritt stål på toppen av PDMS-ringen ved hjelp av pinsett. Sett spissene på den interne holderingens tang inn i gripegrepene på holderingen.Klem på holderen for å redusere diameteren på holderringen. Sett den inn i 6-brønnen, trykk den godt på modulen i rustfritt stål, og slipp tangene for å feste PDMS-ringen i brønnen. Tilsett en mil med fem mikrogram per mikroliterfibronektin i midten eller kanten av brønnen, avhengig av interesseområdet, gjennom åpningen av PDMS-ring og moduler i rustfritt stål.Virvle platen for å sikre at fibronektinløsningen dekker hele interesseområdet. Inkuber i 30 minutter ved 37 grader i en fuktet inkubator under 95% luft og 5% CO2. Fjern fibronectinoppløsningen fra brønnen.Og vask nå to ganger med PBS. Når du er ferdig, fjern PBS helt fra brønnen. Fjern holderingen, modulen i rustfritt stål og PDMS-ringen fra brønnen.Tilsett 1,5 mil av 1% Pluronic F-127 i brønnen og inkuber i en time ved romtemperatur for å passivisere den ubestrøket overflaten. Fjern Pluronic F-127-oppløsningen fra brønnen og vask tre ganger med PBS. Når den er vasket, bruk den belagte brønnen umiddelbart eller oppbevar den i fire grader i opptil to uker med laget av PBS i den belagte brønnen.Såing av endotelceller. Tell celler ved hjelp av et hemocytometer og frø 180 000 celler i en belagt 6-brønns plate i 1,5 mil pre-varm cellekultur medium. Rist brønnplaten sidelengs for å sikre at cellene fordeler seg jevnt i brønnen.La den ligge i en 37 graders fuktet inkubator under 95% luft og 5% CO2 over natten. Skjær stress søknad ved hjelp av en orbital shaker. Celler bør nå samløp etter tre dager med vekst.Erstatt mediet med 1,9 mil pre-warn cellekultur medium for å oppnå en høyde på to millimeter. Plasser en brønnplate på plattformen til en orbital shaker i en fuktet inkubator og virvle den ved 150 RPM i tre dager. Valgfritt, etter to dager med skjær, kan cytokiner legges til cellekulturmediet for å undersøke samspillet mellom cytokiner og ren stress.Etter behandling skjærer du cellene for en annen dag. I denne studien ble TNF-alfa brukt til å aktivere cellene. Utfør analyse etter tre dager med skjærstressapplikasjon.Mikroskopbilder viser at Pluronic F-127 forhindret HUVEC-vedheft til regionen uten fibronektinbelegg. Ingen HUVECer var festet til den delen av brønnoverflaten som ikke hadde blitt forbehandlet med fibronectin før passivisering av Pluronic F-127 etter 24 timer, i figur A, og 72 timer, i figur C, av vekst. Uten Pluronic F-127 passivasjon ble HUVEC-er festet til overflaten uten fibronectin, 24 timer etter sådd, i figur B, og spres videre med 72 timer, i figur D.Skalastangen er lik 500 mikrometer.Kjernefysisk rød flekk viser morfologien til skjærede HUVECer, A, i midten og B, på kanten av en full brønn. Skala bar er lik hundre mikrometer. A og B viser også celleomriss avgrenset ved immunstaining av ZO-1.Legg merke til justering og forlengelse av celler på kanten, men ikke i midten. Den viser ingen signifikant forskjell i kjernekraftindeksen, noe som indikerer rundhet, mellom HUVEC-er som vokser i full brønn og segmenterte brønner ble sett for ubehandlede eller TNF-alfabehandlede HUVECer. Cellene var lengre nær kanten av brønnen.En tendens til en større forlengelse i TNF-alfabehandlede HUVECer var ikke konsekvent signifikant på tvers av steder. Det ble ikke observert signifikant forskjell mellom fulle og segmenterte brønner i tetthetstallet A, ubehandlet og B, TNF-alfabehandlede HUVECer på forskjellige radiale steder. I begge tilfeller var det flere celler per enhet på kanten enn i midten av brønnen.Til slutt lar metoden vi har skissert her deg dyrke celler i bare en region av den virvlende brønnen eller faktisk av ethvert plastbasert cellekultursystem. Det betyr at celler i en del av brønnen som opplever en type flyt, ikke påvirkes av meglere som frigjøres fra celler i et annet område som opplever forskjellige strømmer. Ikke bare det, vi kan se på celler som vokser i en region med eller uten at celler dyrkes i andre regioner.Det gjør at effekten av slike løselige meglere kan demonstreres. Testing av effekten av betinget medium på naive celler tillater det samme. Ved å analysere tilstandsmediet kan meklerne identifiseres.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis rotvekst med Rapid manipulering av Root miljøet ved hjelp av RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Tredimensjonal Flow Chamber Device å studere Chemokine, rettet Ekstravasering Celler Sirkulerende under fysiologiske strømningsforhold

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

Gene Transfeksjon mot spheroid Cells om Micropatterned Kultur tallerker genmodifiserte Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studerer Støkiometrien av epidermal vekstfaktor reseptor i intakte celler bruker korrelative Mikros

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønstre bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel bruker fotokjemi for biologiske programmer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital risting kultur pattedyrceller i O-formet fartøy å produsere Uniform aggregater

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...