Name: segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt ett british heart foundation-projektbidrag (till PDW), ett nationellt medicinskt forskningsråd Singapore TAAP och DYNAMO Grant (till XW, NMRC / OFLCG / 004 / 2018, NMRC / OFLCG / 001 / 2017), ett A * STAR Graduate Scholarship (till KTP) och ett British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (till MA).

1. Tillverkning av anordningar och beredning av reagenser
<ol><li>Tillverkning av rostfri modul<ol>
<li>Tillverka den rostfria modulen av rostfritt stål av rostfritt stål av klass 316 med hjälp av en CNC-fräsmaskin enligt den medföljande konstruktionsritningen (figur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D-utskrift av en pdms-form (polydimethylsiloxane)<ol>
<li>Förbered en 3D-datorstödd designmodell (CAD) av PDMS-formen med SolidWorks enligt den medföljande tekniska ritningen (<strong class=...

<ol>
	<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li><li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Sensing+of+Flow+Direction.">Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).</li><li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress.">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437, 426-431 (2005).</li><li>Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+and+compliance+of+endothelial+cells+after+shear+stress+in+vitro+or+from+different+aortic+regions:+Scanning+ion+conductance+microscopy+study.">Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study.</a> PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).</li><li>Asakura, T., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Patterns+and+Spatial+Distribution+of+Atherosclerotic+Lesions+in+Human.">Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human.</a> Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).</li><li>Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+evidence+for+a+change+in+the+pattern+of+aortic+wall+shear+stress+with+age.">Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).</li><li>Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fluid+mechanics+in+the+localization+and+detection+of+atherosclerosis.">The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis.</a> Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).</li><li>Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+rheological+system+for+studying+the+effect+of+fluid+shear+stress+on+cultured+cells.">Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells.</a> The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).</li><li>Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+and+orientation+of+cultured+endothelial+cells+in+response+to+shear+stress.">The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress.</a> Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).</li><li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells.">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li><li>Venugopal Menon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+microfluidic+3D+stenosis+model+to+study+leukocyte-endothelial+interactions+in+atherosclerosis.">A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis.</a> APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).</li><li>Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium:+A+review+of+the+orbital+shaker+method.">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li><li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator.">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).</li><li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture:+comparison+of+aortic,+venous,+capillary,+and+corneal+endothelium.">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li><li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS/MS.">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li><li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure.">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li><li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow.">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li><li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta.">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li></ol>

Metoden med virvlande brunn kan generera komplexa flödesprofiler i en enda brunn - LMMF (Low Magnitude Multidirectional Flow) i mitten och High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) vid brunnens kant. Skevning stressmedlade sekret av löslig medlare kommer dock att blandas i det virvlande mediet och påverka celler i hela brunnen, vilket potentiellt döljer den sanna effekten av en viss savspänningsprofil på cellerna.
Den beläggningsmetod som demonstreras här övervinner denna fråga genom att b...

Svar från kärlceller på deras mekaniska miljö är viktiga i blodkärlens normala funktion och i utvecklingen av sjukdom1. Mekanobiologin hos de endotelceller (ECs) som kanterar den inre ytan av alla blodkärl har varit ett särskilt fokus för mekanobiologisk forskning eftersom ECs direkt upplever den saxstress som genereras av blodflödet över dem. Olika fenotypiska förändringar såsom inflammatoriska svar, förändrad styvhet och morfologi, frisättning av vasoaktiva ämnen och lokalisering och uttryck av junctional proteiner beror på EG exponering för sax stress2,3,4. Shear-beroende endotel egenskaper kan också förklara ojämn utveckling av sjukdomar såsom åderförkalkning5,6,7.
Det är användbart att studera effekten av sav på ECs i kultur, där påfrestningar kan kontrolleras, och ECs kan isoleras från andra celltyper. Vanliga in vitro-anordningar för applicering av saxspänning på ECs inkluderar parallellplåtens flödeskammare och kon- och plåtviscometern, men endast enaxialt stadigt, svängbart och pulsatilt flöde kanappliceras 8,9. Även om modifierade flödeskammare med avsmalnande eller förgrenande geometrier och mikrofluidiska chips som efterliknar en stenotisk geometri har utvecklats, utgör deras låga genomströmning och den relativt korta kulturtid som är möjlig en utmaning10, 11.
Orbital shaker (eller virvlande väl) metoden för studier av endotel mekanotransduktion, där celler odlas i standard cellkultur plastartiklar placerade på plattformen för en orbital shaker, får allt större uppmärksamhet eftersom den kan kroniskt införa komplexa, rumsligt varierande sax stressmönster på ECs med hög genomströmning (se granskning av Warboys et al.12). Beräkningsvätska dynamik (CFD) simuleringar har använts för att karakterisera rumsliga och tidsmässiga variationen av shear stress i en virvlande brunn. Den virvlande rörelsen hos odlingsmediet som orsakas av omloppsrörelsen hos den shakerplattform på vilken plattan placeras leder till multidirektionellt flöde med låg magnitud (LMMF, eller förföriskt pro-aterogent flöde) i mitten och Uniaxial Flow med hög magnitud (HMUF, eller putativt ateroprotektivt flöde) vid kanten av brunnarna på en 6-brunnsplatta. Till exempel är tidsgenomsnittad väggsjuvspänning (TAWSS) cirka 0,3 Pa i mitten och 0,7 Pa vid kanten av en 6-brunnsplatta virvlad vid 150 varv/min med en 5 mm omloppsradie13. Metoden kräver endast kommersiellt tillgängliga plastartiklar och själva orbital shakern.
Det finns dock en nackdel med metoden (och andra metoder för att införa flöden in vitro): ECs släpper lösliga medlare och mikropartiklar på ett savberoende sätt14,15,16 och denna secretome kan påverka ECs i andra regioner än den där de släpptes, på grund av blandningen i det virvlande mediet. Detta kan dölja de faktiska effekterna av sax stress på EG fenotyp. Till exempel har Ghim et al. spekulerat i att detta står för det till synes identiska inflytandet av olika savprofiler på transcellulär transport av stora partiklar17.
Här beskriver vi en metod för att främja mänsklig navelsträngsmörjningscell (HUVEC) vidhäftning i specifika regioner av en 6-brunnsplatta med fibronectinbeläggning medan du använder Pluronic F-127 för att passivera ytan och förhindra tillväxt någon annanstans. Metoden löser den begränsning som beskrivs ovan eftersom ECs, genom att segmentera celltillväxt, endast upplever en typ av savprofil och inte påverkas av secretomes från ECs som exponeras för andra profiler någon annanstans i brunnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg</td>
			<td>RS</td>
			<td>832-0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel 316</td>
			<td>Metal Supermarket</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5mM)</td>
			<td>Bio Status</td>
			<td>DR50200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>SHA7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Ring Pliers</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWP32-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Rings/Internal/C-Type</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWS35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2+3-D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cura 2.6.2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks 2016</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies

Shear stress påtvingas på artärväggen genom blodflödet påverkar endotelcellsmorfologi och funktion. Låg magnitud, oscillaterande och multidirectional shear påfrestningar har alla postulerats för att stimulera en pro-atherosclerotic fenotyp i endotelceller, medan hög magnitud och enkelriktad eller enaxial sax tros främja endotelial homeostas. Dessa hypoteser kräver ytterligare undersökning, men traditionella in vitro-tekniker har begränsningar och är särskilt dåliga på att införa multidirectional shear stress på celler. 
En metod som får allt större användning är att odla endotelceller i vanliga multibrunnsplattor på plattformen för en orbital shaker; I denna enkla, billiga, hög genomströmning och kroniska metod producerar det virvlande mediet olika mönster och magnitud på sajuvning, inklusive multidirectional sav, i olika delar av brunnen. Det har dock en betydande begränsning: celler i en region, utsatta för en typ av flöde, kan frigöra medlare i mediet som påverkar celler i andra delar av brunnen, utsatta för olika flöden, vilket förvränger det uppenbara förhållandet mellan flöde och fenotyp. 
Här presenterar vi en enkel och prisvärd modifiering av metoden som gör det möjligt för celler att exponeras endast för specifika savspänningsegenskaper. Cellfröning är begränsad till en definierad region i brunnen genom att täcka den region som är av intresse med fibronectin, följt av passivering med passiveringslösning. Därefter kan plattorna virvlas på skakapparaten, vilket resulterar i exponering av celler för väldefinierade saxprofiler som multidirektionell sax med låg magnitud eller enaxialsaxialsax med hög magnitud, beroende på deras placering. Som tidigare möjliggör användningen av standard cellkulturartiklar enkel ytterligare analys av cellerna. Ändringen har redan gjort det möjligt att demonstrera lösliga medlare, som frigörs från endotel under definierade savspänningsegenskaper, som påverkar celler som finns någon annanstans i brunnen.

Vidhäftning av HUVECs till regioner av brunnen plattan inte belagda med fibronectin var upphävas av Pluronic F-127 passivation; Tillväxten begränsades till regionen belagd med fibronectin även efter 72 h kultur, med och utan shear stress tillämpning(figur 4A, figur 4C). Utan den pluroniska F-127 passiveringen hade HUVECs fäst vid ytan utan fibronectin och hade spridit sig ytterligare med 72 h kultur (F...

Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Detta protokoll beskriver en beläggningsmetod för att begränsa endotel cell tillväxt till en viss region i en 6-brunns platta för shear stress ansökan med hjälp av orbital shaker modell.

Segmentering av tillväxten av endotelceller i 6-brunnsplattor på en orbital shaker för mekanobiologiska studier

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Detta protokoll beskriver en beläggningsmetod för att begränsa endotel cell tillväxt till en viss region i en 6-brunns platta för ren stress ansökan med hjälp av orbital shaker modell. Ett vanligt sätt att studera effekter av flöde på endotel är att odla endotelceller i multi-well kulturplattor på en orbital shaker. Orbital shaker inducerar en våg som roterar runt brunnen.Celler i mitten av brunnen upplever den typ av flöden som tros leda till åderförkalkning. Celler närmare kantupplevelseflödet som tros vara skyddande. Cellernas egenskaper i varje region antas bero på de stora påfrestningar som de upplever.Det finns dock ett potentiellt golv i denna logik. Endotelceller släpper ut medlare på ett flödesberoende sätt. Dessa medlare kommer att nå en enhetlig koncentration i det virvlande mediet och kommer därför att påverka celler i andra regioner än den där de släpptes ut.Det kan skada eller dölja sanna effekter av sax på cellbeteendet. Effekten är inte begränsad till det virvlande brunnssystemet. Det kan förekomma även i enkla modeller, som parallellplattans flödeskammare.Det kan undvikas genom att odla celler i endast en del av systemet. Här beskriver vi metoder för att tillåta cell vidhäftning endast i mitten eller bara vid kanten av den virvlande brunnen. Tillverkning av rostfri modul.Tillverka den rostfria modulen av rostfritt stål av rostfritt stål av grad 316 enligt en medföljande ingenjörsritning. 3D-utskrift på PDMs. Förbered en 3D CAD-modell av PDMs-form med SOLIDWORKS enligt den medföljande tekniska ritningen.Exportera CAD-modellen till en STL-fil och importera STL-filen till Cura 2.6.2. Segmenta modellen i lager med en utskriftshastighet på 50 millimeter per sekund och fyllningstätheten 60 % Exportera filen som en GCode. Laddade upp den till en Ultimaker 3D-skrivare för utskrift.Använd polylaktisk syra som tryckmaterial. Gjutning av PDMS-ring. Blanda PDMS-basen och härdningsmedlet väl med förhållandet 90,9% bas och 9,1% härdningsmedel.Häll den välblandade lösningen i den 3D-printade formen. Ta bort bubblor i en vakuumavgasningskammare. Härda den i en timme i en 80-graders ugn.Låt PDMS-ringen svalna till rumstemperatur. Ta sedan bort den härdade PDMS-ringen försiktigt från formen. Förberedelse av 1%Pluronic F-127.Väg ut fem gram Pluronic F-127. Häll det i en glasflaska. Tillsätt sedan 100 miljoner Milli-Q vatten i glasflaskan.Detta ger en 5%Pluronic F-127 lösning. Se till att allt pluronic F-127 pulver är nedsänkt i vattnet. Stäng locket och autoklavera det med hjälp av ett flytande steriliseringsprogram.Låt lösningen svalna till rumstemperatur före användning. Tillsätt 10 mil 5%Pluronic F-127 lösning till 40 mil autoklaverat Milli-Q-vatten för att göra 1%Pluronic F-127 lösning. Utför utspädningen i en biosäkerhetskåpskåpskåp.Förvara både 1%och 5%Pluronic F-127 vid rumstemperatur. Beläggning av 6-brunnsplatta. Autoklav rostfritt stålmodul, PDMS-ring och pincett före användning.Utför alla efterföljande procedurer i en BSC-huva och observera aseptiska tekniker för att säkerställa sterilitet. Placera PDMS-ringen i en 6-brunns med pincett. Använd PDMS-ringens yttre kant för att justera PDMS-ringen koncentriskt i brunnen.Observera att endast icke-vävnadskulturbehandlade brunnsplattor bör användas. Placera modulen i rostfritt stål ovanpå PDMS-ringen med pincett. För in spetsarna på den inre låsringens tång i gripgreppen på låsringen.Tryck på hållaren för att minska fästringens diameter. Sätt den i 6-brunnen, tryck den ordentligt på rostfria modulen och släpp tången för att säkra PDMS-ringen i brunnen. Tillsätt en mil med fem mikrogram per mikroliterfibronectin i mitten eller kanten av brunnen, beroende på intresseområdet, genom öppnandet av PDMS-ringen och rostfria modul.Snurra plattan för att säkerställa att fibronectinlösningen täcker hela intresseområdet. Inkubera i 30 minuter vid 37 grader i en fuktad inkubator under 95% luft och 5%CO2. Ta bort fibronectinlösningen från brunnen.Och tvätta dig nu två gånger med PBS. När du är klar, ta helt bort PBS från brunnen. Ta bort låsringen, rostfria modulen och PDMS-ringen från brunnen.Tillsätt 1,5 mil 1%Pluronic F-127 i brunnen och inkubera i en timme vid rumstemperatur för att passivera den obelagda ytan. Ta bort Pluronic F-127-lösningen från brunnen och tvätta tre gånger med PBS. När du har tvättat, använd den belagda brunnen omedelbart eller förvara i fyra grader i upp till två veckor med pbs-skiktet i den belagda brunnen.Sådd av endotelceller. Räkna celler med en hemocytometer och frö 180 000 celler till en belagd 6-brunnsplatta i 1,5 mil förvärmt cellkulturmedium. Skaka brunnsplattan i lydnad för att säkerställa att cellerna fördelas jämnt i brunnen.Lämna den i en 37-graders fuktad inkubator under 95% luft och 5% CO2 över natten. Shear stress ansökan med hjälp av en orbital shaker. Cellerna bör nå sammanflöde efter tre dagars tillväxt.Ersätt mediet med 1,9 mil för-varna cellkulturmedium för att uppnå en höjd av två millimeter. Placera en brunnsplatta på plattformen för en orbital shaker i en fuktad inkubator och snurra den vid 150 RPM i tre dagar. Valfritt, efter två dagars savning, cytokiner kan läggas till cellkulturmediet för att undersöka samspelet mellan cytokiner och ren stress.Efter behandlingen, sav cellerna i en annan dag. I denna studie användes TNF-alfa för att aktivera cellerna. Utför analys efter tre dagars shear stress ansökan.Mikroskopbilder visar att Pluronic F-127 förhindrade HUVEC vidhäftning till regionen utan fibronectinbeläggning. Inga HUVECs var fästa vid den del av brunnen ytan som inte hade förbehandlats med fibronectin före passivering av Pluronic F-127 efter 24 timmar, i figur A och 72 timmar, i figur C, av tillväxt. Utan pluronic F-127 passivation var HUVECs fästa på ytan utan fibronectin, 24 timmar efter sådd, i figur B, och förökas ytterligare med 72 timmar, i figur D.Skalstången är lika med 500 mikrometer.Nukleär röd fläck visar morfologin hos saxade HUVECs, A, i mitten, och B, vid kanten av en full brunn. Skalstången är lika med hundra mikrometer. A och B visar också cellkonturer avgränsade genom immunostaining av ZO-1.Observera justering och förlängning av celler vid kanten men inte i mitten. Det visar ingen signifikant skillnad i kärn- forma index som indikerar roundness, mellan HUVECs som odlas i fulla brunnar och segmenterade brunnar sågs för obehandlade eller TNF-alfabehandlade HUVECs. Cellerna var mer långsträckta nära brunnens kant.En tendens till en större förlängning i TNF-alfa-behandlade HUVECs var inte konsekvent betydande på olika platser. Ingen signifikant skillnad observerades mellan fulla och segmenterade brunnar i densitetsnummer A, obehandlade och B, TNF-alfabehandlade HUVECs på olika radiella platser. I båda fallen fanns det fler celler per enhetsområde vid kanten än i mitten av brunnen.Sammanfattningsvis gör metoden som vi har beskrivit här att du kan odla celler i bara en region i den virvlande brunnen eller för den delen av något plastbaserat cellkultursystem. Det betyder att celler i en del av brunnen som upplever en typ av flöde inte påverkas av medlare som frigörs från celler i en annan region som upplever olika flöden. Inte bara det, vi kan titta på celler som odlas i en region med eller utan att celler odlas i andra regioner.Detta gör det möjligt att påvisa effekterna av sådana lösliga medlare. Att testa effekterna av konditionerat medium på naiva celler tillåter samma sak. Genom att analysera tillståndsmediet kan medlarna identifieras.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endothelial inflammatorisk Fenotypning

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescensavbildning av Arabidopsis rottillväxt med Rapid Manipulering av Root miljö med hjälp av RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Tredimensionell strömningskammare Device att studera Chemokine-riktad Extravasering av celler som cirkulerar under fysiologiska flödesförhållanden

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

Gentransfektion mot sfäroid Celler på Micropatterned odlingsplattor för genetiskt modifierade celltransplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studie stökiometrin hos receptorn för epidermal tillväxtfaktor i intakta celler genom att använda Korrelat Mikroskopi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungcancerceller med användning av en Multichannel dubbla elektriskt fält mikroflödes Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mönstring bioaktiva proteiner eller peptider på Hydrogel med fotokemi för biologiska tillämpningar

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

En Orbital skakar kultur av däggdjursceller i O-formade fartyg att producera enhetliga aggregat

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...