Name: segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

Yazarlar, İngiliz Kalp Vakfı proje hibesini (PDW'ye), Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi Singapur TAAP ve DYNAMO Hibesini (XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), A*STAR Lisansüstü Bursu (KTP'ye) ve İngiliz Kalp Vakfı Araştırma Mükemmelliği Merkezi öğrenciliğini (MA'ya) minnetle kabul etmektedir.

1. Cihazların imalatı ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Paslanmaz çelik modülün imalatı<ol>
<li>Paslanmaz çelik modülü, sağlanan mühendislik çizimine göre bir CNC freze makinesi kullanarak 316 paslanmaz çelikten imal edin (Şekil 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Polidimetilsiloksisan (PDMS) kalıbının 3D baskısı<ol>
<li>Sağlanan mühendislik çizimine göre SolidWorks kullanarak PDMS kalıbının 3D bilgisayar destekli tasarım (CAD) modelini hazırlayın (<strong class="...

<ol>
	<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li><li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Sensing+of+Flow+Direction.">Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).</li><li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress.">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437, 426-431 (2005).</li><li>Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+and+compliance+of+endothelial+cells+after+shear+stress+in+vitro+or+from+different+aortic+regions:+Scanning+ion+conductance+microscopy+study.">Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study.</a> PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).</li><li>Asakura, T., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Patterns+and+Spatial+Distribution+of+Atherosclerotic+Lesions+in+Human.">Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human.</a> Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).</li><li>Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+evidence+for+a+change+in+the+pattern+of+aortic+wall+shear+stress+with+age.">Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).</li><li>Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fluid+mechanics+in+the+localization+and+detection+of+atherosclerosis.">The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis.</a> Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).</li><li>Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+rheological+system+for+studying+the+effect+of+fluid+shear+stress+on+cultured+cells.">Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells.</a> The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).</li><li>Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+and+orientation+of+cultured+endothelial+cells+in+response+to+shear+stress.">The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress.</a> Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).</li><li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells.">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li><li>Venugopal Menon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+microfluidic+3D+stenosis+model+to+study+leukocyte-endothelial+interactions+in+atherosclerosis.">A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis.</a> APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).</li><li>Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium:+A+review+of+the+orbital+shaker+method.">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li><li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator.">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).</li><li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture:+comparison+of+aortic,+venous,+capillary,+and+corneal+endothelium.">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li><li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS/MS.">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li><li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure.">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li><li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow.">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li><li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta.">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li></ol>

Dönen kuyu yöntemi, tek bir kuyuda karmaşık akış profilleri üretebilir - merkezde Düşük Büyüklükte Çok Yönlü Akış (LMMF) ve kuyunun kenarında Yüksek Büyüklükte Tek Eksenli Akış (HMUF). Bununla birlikte, çözünür aracılı kesme stresi salgıları dönen ortamda karıştırılacak ve tüm kuyudaki hücreleri etkileyecek ve belirli bir kesme stres profilinin hücreler üzerindeki gerçek etkisini maskeleyebilecektir.
Burada gösterilen kaplama yöntemi, hücrelerin b?...

Damar hücrelerinin mekanik ortamlarına verdikleri yanıtlar kan damarlarının normal fonksiyonlarında ve hastalığın gelişiminde önemlidir1. Tüm kan damarlarının iç yüzeyini hizalayan endotel hücrelerinin (VC) mekanobiyolojisi, mekanobiyolojik araştırmaların özel bir odağı olmuştur, çünkü VC'ler doğrudan üzerlerindeki kan akışının yarattığı kesme stresini yaşarlar. İnflamatuar yanıtlar, değişen sertlik ve morfoloji, vazoaktif maddelerin salınımı ve kavernasyonel proteinlerin lokalizasyonu ve ekspresyonu gibi çeşitli fenotipik değişiklikler, EC'nin kesme stresine maruz kalmasına bağlıdır2,3,4. Kesmeye bağımlı endotel özellikleri de ateroskleroz 5 ,6,7gibi hastalıkların yamalı gelişimini açıklayabilir.
Stresin kontrol edilebildiği ve WC'lerin diğer hücre tiplerinden izole edilebildiği kültürde makasın VC'ler üzerindeki etkisini incelemek faydalıdır. VC'lere kesme stresi uygulamak için yaygın olarak kullanılan in vitro cihazlar paralel plaka akış odası ve koni ve plaka viskometresini içerir, ancak sadece tek eksenli sabit, salınımlı ve pulsatil akışuygulanabilir 8,9. Konik veya dallanma geometrili modifiye akış odaları ve stenotik geometriyi taklit eden mikroakışkan yongalar geliştirilmiş olsa da, düşük verimleri ve mümkün olan nispeten kısa kültür süresi10, 11.
Bir orbital çalkalayıcının platformuna yerleştirilen standart hücre kültürü plastik eşyalarında hücrelerin yetiştirildiği endotel mechanotransduction çalışması için orbital çalkalayıcı (veya iyi dönen) yöntem, yüksek verimli IC'lere kronik olarak karmaşık, mekansal olarak değişen kesme stres desenleri uygulayabildiği için giderek daha fazla dikkat çekmektedir (bkz. Warboys vd.12). Dönen bir kuyuda kesme stresinin mekansal ve zamansal varyasyonunu karakterize etmek için Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) simülasyonları sunuldu. Plakanın yerleştiği çalkalayıcı platformun yörüngesel hareketinin neden olduğu kültür ortamının dönen hareketi, merkezde Düşük Büyüklükte Çok Yönlü Akışa (LMMF veya putatif olarak aterojenik akışa) ve 6 kuyulu bir plakanın kuyularının kenarında Yüksek Büyüklükteki Tek Eksenli Akışa (HMUF veya putatif olarak ateroprotektif akış) yol açar. Örneğin, zaman ortalamalı duvar kesme stresi (TAWSS) merkezde yaklaşık 0,3 Pa ve 5 mm yörünge yarıçapı 13 olan 150 rpm'de dönen 6 kuyu plakasının kenarında0,7 Pa'dır. Yöntem sadece ticari olarak kullanılabilen plastik eşyalar ve orbital çalkalayıcının kendisini gerektirir.
Bununla birlikte, yöntemin (ve diğer akışların in vitro olarak empoze edilmesine) bir dezavantajı vardır: VC'ler çözünür mediatörleri ve mikropartikülleri kesmeye bağımlı bir şekilde serbest bırakır14,15,16 ve bu secretome, dönen ortamdaki karıştırma nedeniyle kuyunun salındıkları bölgelerde VC'leri etkileyebilir. Bu, kesme stresinin EC fenotip üzerindeki gerçek etkilerini maskeleyebilirsiniz. Örneğin, Ghim ve arkadaşları, bunun farklı kesme profillerinin büyük parçacıkların hücrelerarası taşınması üzerindeki görünüşte aynı etkisini oluşturduğunu tahmin etmişler17.
Burada, yüzeyi pas geçirmek ve başka bir yerde büyümeyi önlemek için Pluronic F-127 kullanırken fibronektin kaplama kullanarak 6 kuyulu bir plakanın belirli bölgelerinde insan göbek damarı endotel hücresi (HUVEC) yapışıklığı teşvik etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, hücre büyümesini segmentlere ayırarak, VC'lerin yalnızca bir tür kesme profili yaşadığı ve kuyunun başka bir yerindeki diğer profillere maruz kalan VC'lerden gelen salgılardan etkilenmediği için yukarıda açıklanan sınırlamayı çözer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-a</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg</td>
			<td>RS</td>
			<td>832-0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel 316</td>
			<td>Metal Supermarket</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Farnell</td>
			<td>101697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5mM)</td>
			<td>Bio Status</td>
			<td>DR50200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&#160;</td>
			<td>SHA7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Ring Pliers</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWP32-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining Rings/Internal/C-Type</td>
			<td>Misumi</td>
			<td>RTWS35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2+3-D printer</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cura 2.6.2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks 2016</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

segmenting growth of endothelial cells in 6-well plates on an orbital shaker for mechanobiological studies

Kanın akışı ile arteriyel duvara uygulanan kesme stresi endotel hücre morfolojisini ve fonksiyonunu etkiler. Düşük büyüklük, salınımlı ve multiliksiyonel kesme gerilmelerinin tümü endotel hücrelerinde pro-aterosklerotik fenotipi uyarmak için öne sürülmüştür, yüksek büyüklük ve tek yönlü veya tek eksenli kesmenin endotel homeostazı teşvik ettiği düşünülmektedir. Bu hipotezler daha fazla araştırma gerektirir, ancak geleneksel in vitro tekniklerin sınırlamaları vardır ve hücrelere çok yönlü kesme gerilmeleri uygulama konusunda özellikle zayıftır. 
Giderek artan bir kullanım elde eden bir yöntem, endotel hücrelerini bir yörünge çalkalayıcı platformunda standart çok kuyulu plakalarda kültüre etmektir; Bu basit, düşük maliyetli, yüksek verimli ve kronik yöntemde, dönen ortam kuyunun farklı bölgelerinde çok yönlü kesme de dahil olmak üzere farklı kesme desenleri ve büyüklükleri üretir. Bununla birlikte, önemli bir sınırlamaya sahiptir: bir bölgedeki hücreler, bir akış türüne maruz kalan, kuyunun diğer bölümlerindeki hücreleri etkileyen, farklı akışlara maruz kalan ortama aracılar bırakabilir, bu nedenle akış ve fenotip arasındaki belirgin ilişkiyi bozabilir. 
Burada, hücrelerin yalnızca belirli kesme stresi özelliklerine maruz kalmalarını sağlayan yöntemin kolay ve uygun fiyatlı bir modifikasyonunun sunulmasını sunuyoruz. Hücre tohumlama, ilgi çekici bölgeyi fibronektin ile kaplayarak kuyunun tanımlanmış bir bölgesiyle sınırlandırılır, ardından passivating çözeltisi kullanılarak pasivasyon yapılır. Daha sonra, plakalar çalkalayıcı üzerinde döndürebilir, bu da hücrelerin konumlarına bağlı olarak düşük büyüklükte çok yönlü kesme veya yüksek büyüklükte tek eksenli kesme gibi iyi tanımlanmış kesme profillerine maruz kalmasına neden olur. Daha önce olduğu gibi, standart hücre kültürü plastik yazılımının kullanımı, hücrelerin daha basit bir şekilde daha fazla analizini sağlar. Değişiklik, endotelden tanımlanmış kesme stresi özellikleri altında salınan ve kuyunun başka bir yerinde bulunan hücreleri etkileyen çözünür mediatörlerin gösterilmesine zaten izin vermiştir.

HUVEC'lerin fibronektin ile kaplanmamış kuyu plakası bölgelerine yapışması Pluronic F-127 pasivasyonu ile kırıldı; büyüme, kesme stresi uygulaması ile ve olmadan 72 saat kültürden sonra bile fibronektin ile kaplanmış bölge ile sınırlıydı (Şekil 4A, Şekil 4C). Pluronic F-127 pasivasyonu olmadan, HUVEC'ler fibronektin olmadan yüzeye tutturuldu ve 72 saat kültürle daha da çoğaldı (?...

Watch this Scientific Journal Video about Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies at JoVE.com

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Bu protokol, endotel hücre büyümesini yörüngesel çalkalayıcı modelini kullanarak kesme gerilme uygulaması için 6 kuyulu bir plakanın belirli bir bölgesiyle sınırlamak için bir kaplama yöntemini açıklar.

Mechanobiyolojik Çalışmalar için Orbital Çalkalayıcıda Endotel Hücrelerinin 6 Kuyu Plakalarında Parçalanması

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Bu protokol, endotel hücre büyümesini yörüngesel çalkalayıcı modelini kullanarak saf stres uygulaması için 6 kuyulu bir plakanın belirli bir bölgesiyle sınırlamak için bir kaplama yöntemini açıklar. Akışın endotel üzerindeki etkilerini incelemenin yaygın bir yolu, çok kuyulu kültür plakalarındaki endotel hücrelerini bir yörünge çalkalayıcı üzerinde kültüre etmektir. Yörüngesel çalkalayıcı kuyunun etrafında dönen bir dalgaya neden oldu.Kuyunun merkezindeki hücreler, ateroskleroza yol açacağı düşünülen akışları yaşarlar. Kenara daha yakın hücreler, koruyucu olduğu düşünülen akışı yaşar. Her bölgedeki hücrelerin özelliklerinin yaşadıkları saf streslere bağlı olduğu varsayılır.Ancak, bu mantıkta potansiyel bir zemin vardır. Endotel hücreleri, arabulucuları akışa bağlı bir şekilde serbest bırakır. Bu aracılar dönen ortamda tek tip bir konsantrasyona ulaşacak ve bu nedenle salındıkları bölge dışındaki bölgelerdeki hücreleri etkileyecektir.Bu, kesmenin hücre davranışı üzerindeki gerçek etkilerini bozabilir veya gizleyebilir. Etki dönen kuyu sistemi ile sınırlı değildir. Paralel plaka akış odası gibi basit modellerde bile ortaya çıkabilir.Sistemin sadece bir bölümünde hücre yetiştirilerek önlenebilir. Burada, hücre yapışıklığına izin veren yöntemleri sadece merkezde veya sadece dönen kuyunun kenarında açıklıyoruz. Paslanmaz çelik modülün imalatı.Paslanmaz çelik modülü, sağlanan bir mühendislik çizimine göre 316 paslanmaz çelikten üretin. PDM'lerde 3D baskı. Sağlanan mühendislik çizimine göre SOLIDWORKS kullanarak PDM'lerin kalıplarının 3D CAD modelini hazırlayın.CAD modelini bir STL dosyasına verin ve STL dosyasını Cura 2.6.2'ye alın. Modeli saniyede 50 milimetre baskı hızı ve %60 dolum yoğunluğu ile katmanlar halinde dilimleyin Dosyayı GCode olarak dışa aktarın. Yazdırma için ultimaker 3D yazıcıya yükledim.Baskı malzemesi olarak polilaktik asit kullanın. PDMS halkasının dökümü. PDMS tabanını ve kürleme maddesini %90,9 baz ve %9,1 kürleme maddesi oranıyla iyice karıştırın.İyi karıştırılır çözeltiyi 3D baskılı kalıba dökün. Vakum gaz giderme odasında kabarcıkları çıkarın. 80 derecelik bir fırında bir saat boyunca tedavi edin.PDMS halkasının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Daha sonra kürlenmiş PDMS halkasını kalıptan dikkatlice çıkarın. %1 Pluronic F-127 hazırlanması.Beş gram Pluronic F-127 tartın. Cam şişeye dökün. Daha sonra cam şişeye yüz milyon Milli-Q su ekleyin.Bu% 5 Pluronic F-127 çözümü verir. Tüm Pluronic F-127 tozlarının suya batırıldığından emin olun. Kapağı kapatın ve sıvı sterilizasyon döngüsü programı kullanarak otoklavlayın.Kullanmadan önce çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın. %1 Pluronic F-127 çözümü yapmak için 40 milyon otomatik kapatılmış Milli-Q suya 10 milyon %5 Pluronic F-127 çözeltisi ekleyin. Seyreltme işlemi biyogüvenlik kabini davlumbazında gerçekleştirin.Oda sıcaklığında hem %1 hem de %5 Pluronic F-127 depolayın. 6 kuyu plakası kaplaması. Kullanmadan önce paslanmaz çelik modülü, PDMS halkasını ve cımbızı otoklavlav.Sonraki tüm prosedürleri bir BSC davlumbazında gerçekleştirin ve steriliteyi sağlamak için aseptik teknikleri gözlemleyin. PDMS halkasını cımbız kullanarak 6 kuyuya yerleştirin. PDMS halkasını kuyu içinde merkezi olarak hizalamak için PDMS halkasının dış kenarını kullanın.Sadece doku kültürü ile tedavi edilmemiş kuyu plakaları kullanılmalıdır. Paslanmaz çelik modülü cımbız kullanarak PDMS halkasının üzerine yerleştirin. İç tutucu halka pensesinin uçlarını tutucu halkanın tutma muhafazalarına yerleştirin.tutucunun çapını azaltmak için tutucuyu sıkın. 6 kuyuya koyun, paslanmaz çelik modüle sıkıca bastırın ve PDMS halkasını kuyuda sabitlemek için penseyi serbest bırakın. PDMS halkası ve paslanmaz çelik modülün açılmasıyla, ilgi alanına bağlı olarak kuyunun ortasına veya kenarına mikroliter fibronektin başına beş mikrogramdan bir milyon mil ekleyin.Fibronektin çözeltisinin tüm ilgi çekici bölgeyi kapsadığından emin olmak için plakayı döndürün. %95 hava ve %5 CO2 altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatır. Fibronektin çözeltisini kuyudan çıkarın.Ve şimdi PBS ile iki kez yıkayın. Tamamlandığında, PBS'yi kuyudan tamamen çıkarın. Saklama halkasını, paslanmaz çelik modülü ve PDMS halkasını kuyudan çıkarın.Kuyuya 1,5 milyon% 1 Pluronic F-127 ekleyin ve kaplamasız yüzeyi geçmek için oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Pluronic F-127 çözeltisini kuyudan çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Yıkandıktan sonra, kaplanmışı hemen iyi kullanın veya kaplanmış kuyuda PBS tabakası ile iki haftaya kadar dört derecede saklayın.Endotel hücrelerinin tohumlama. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 180.000 hücreyi 1,5 milyon ön-ılık hücre kültürü ortamında kaplanmış 6 kuyulu bir plakaya koyun. Hücrelerin kuyuda eşit şekilde dağılmasını sağlamak için kuyu plakasını yanal olarak sallayın.Bir gecede % 95 havanın altında ve% 5 CO2'nin altında 37 derece nemlendirilmiş bir inkübatörde bırakın. Yörüngesel çalkalayıcı kullanarak kesme gerilme uygulaması. Hücreler üç günlük büyümeden sonra birleştiğine ulaşmalıdır.İki milimetre yüksekliğe ulaşmak için ortamı 1,9 milyon önceden uyarı hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde yörüngesel çalkalayıcının platformuna iyi bir plaka yerleştirin ve üç gün boyunca 150 RPM'de döndürün. İsteğe bağlı olarak, iki günlük kesmeden sonra, sitokinler ve saf stres arasındaki etkileşimi araştırmak için hücre kültürü ortamına sitokinler eklenebilir.Tedaviden sonra, hücreleri başka bir gün için kesin. Bu çalışmada hücreleri aktive etmek için TNF-alfa kullanılmıştır. Üç günlük kesme stresi uygulamasından sonra analiz yapın.Mikroskop görüntüleri, Pluronic F-127'nin fibronektin kaplaması olmadan bölgeye HUVEC yapışıklıklarını önlediğini göstermektedir. Kuyu yüzeyinin 24 saat sonra Pluronic F-127'nin geçişinden önce fibronektin ile ön işlem yapılmamış kısmına A ve 72 saat olarak C olarak büyüme olarak hiçbir HUVEC bağlanmamıştır. Pluronic F-127 pasivasyonu olmadan, HUVEC'ler fibronektin olmadan yüzeye, tohumlamadan 24 saat sonra, B şekliyle tutturuldu ve D.Skala çubuğu 500 mikrometreye eşittir.Nükleer Kırmızı leke, tam bir kuyunun kenarında, merkezde A ve B'de yamluklu HUVEC'lerin morfolojisini gösterir. Ölçek çubuğu yüz mikrometreye eşittir. A ve B ayrıca ZO-1'in immünostainasyonu ile tanımlanmış hücre ana hatlarını gösterir.Kenardaki hücrelerin hizalanmasına ve uzamasına dikkat edin, ancak ortada değil. Nükleer şekil indeksinde, yuvarlaklığı gösteren önemli bir fark göstermez, tam olarak iyi yetiştirilen HUVEC'ler arasında ve tedavi edilmemiş veya TNF alfa ile tedavi edilmiş HUVEC'ler için segmentli kuyular görülmüştür. Hücreler kuyunun kenarına yakın daha uzundu.TNF alfa ile işlenmiş HUVEC'lerde daha fazla uzama eğilimi, konumlar arasında sürekli olarak anlamlı değildi. Farklı radyal konumlarda A, işlenmemiş ve B, TNF alfa ile işlenmiş HUVEC'lerin yoğunluk sayısında tam ve parçalı kuyular arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Her iki durumda da, kenarda birim alan başına kuyunun ortasına göre daha fazla hücre vardı.Sonuç olarak, burada özetlediğimiz yöntem, dönen kuyunun sadece bir bölgesinde veya gerçekten de herhangi bir plastik tabanlı hücre kültürü sisteminde hücre yetiştirmenizi sağlar. Bu, kuyunun bir bölümündeki hücrelerin bir akış türünün farklı akışlar yaşayan başka bir bölgedeki hücrelerden salınan aracılardan etkilenmediği anlamına gelir. Sadece bu değil, bir bölgede yetişen hücrelere bakabiliriz, diğer bölgelerde hücre yetiştirilse de yetiştirilmeden de.Bu, bu tür çözünür arabulucuların etkilerinin gösterilmesini sağlar. Şartlandırılmış ortamın naif hücreler üzerindeki etkilerini test etmek de aynı şeye izin verir. Durum ortamı analiz edilerek, aracılar tanımlanabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

Genetik olarak tadil edilmiş hücre transplantasyonu için Micropatterned kültür plakalarında Sferoid hücrelere karşı gene

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...