Name: a simple dry sectioning method for obtaining whole-seed-sized resin section and its applications
Uploaded: 2021-01-23T13:00:00
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资助资金由国家自然科学基金（32071927）、扬州大学人才项目和江苏省高校重点学术项目开发提供。

1. 树脂嵌入种子的制备（图1）
<ol><li>在4°C下固定6个玉米成熟内核，在4°C下，在4°C下使用2.5%磷酸盐缓冲的谷氨酰胺（0.1M，pH7.2），48小时。研究人员可以根据研究目标和组织类型选择其他固定性混合物、固定浓度和固定条件。</li>
	<li>拿出内核，用锋利的双面刀片纵向或横向切成2-3毫米的厚度，再将它们固定在10 mL的2.5%磷酸盐缓冲性谷氨酰胺（0.1 M，pH 7.2）中，48小时。</li>
	<li>每次用 10 mL 的 0....

<ol>
	<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+structure+and+spatial+distribution+in+endosperm+of+high-amylose+rice+starch+granules+with+different+morphologies.">Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+defective+effect+of+starch+branching+enzyme+IIb+from+weak+to+strong+induces+the+formation+of+biphasic+starch+granules+in+amylose-extender+maize+endosperm.">The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm.</a> Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradually+decreasing+starch+branching+enzyme+expression+is+responsible+for+the+formation+of+heterogeneous+starch+granules.">Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules.</a> Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dek35+encodes+a+PPR+protein+that+affects+cis-splicing+of+mitochondrial+nad4+intron+1+and+seed+development+in+maize.">Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize.</a> Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).</li><li>Hu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+structure+characteristics+to+form+ultrahigh+oil+content+in+rapeseed.">Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed.</a> PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+VKS1+regulates+mitosis+and+cytokinesis+during+early+endosperm+development.">Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development.</a> Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).</li><li>Xu, A., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+and+applications+of+different+sections+in+investigating+the+microstructure+and+histochemistry+of+cereal+kernels.">Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels.</a> Plant Methods. 16, 8 (2020).</li><li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein.">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li><li>Zhao, L., Cai, C., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+processing+method+for+investigating+the+morphology+of+cereal+endosperm+cells.">An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells.</a> Biotech &amp; Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).</li><li>Borisjuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+architecture+shapes+embryo+metabolism+in+oilseed+rape.">Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).</li><li>Lott, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+bodies+in+seeds.">Protein bodies in seeds.</a> Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).</li><li>Jing, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+endosperm+cells+and+starch+granules+in+common+wheat.">Development of endosperm cells and starch granules in common wheat.</a> Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).</li></ol>

种子是食品、饲料和工业原料最重要的可再生资源，富含淀粉和蛋白质等储存材料。细胞的形态和数量以及储存材料的含量和结构影响种子7、12的重量和质量。虽然立体学和图像分析技术可以测量组织区域细胞的大小和数量，但许多实验室都缺乏这种技术。石蜡和树脂部分提供二维 （2D） 图像，无法分析细胞的真实大小和数量。然而，细胞在它们的任?...

植物种子含有淀粉和蛋白质等储存材料，为人们提供能量和营养。细胞和储存材料的形状、大小和数量决定了种子的重量和质量。种子不同区域的细胞和储存材料具有显著不同的形态，特别是对于一些高淀粉分枝酶Ib1、2、3的抑制高淀粉谷类作物。因此，研究种子不同区域细胞和储存材料的形态是非常重要的。
石蜡分段是准备全种子尺寸部分的一个很好的方法，可以展示种子的组织结构和种子4、5、6等不同区域储存材料的积累。然而，石蜡部分通常有6-8 μm厚度和低分辨率;因此，很难对细胞和储存材料的形态进行清晰观察和定量分析。树脂部分通常有1-2μm的厚度和高分辨率，非常适合观察和分析细胞和存储材料的形态7。然而，常规树脂分节法在制备全种子尺寸部分时有困难，尤其是对于体积大、淀粉含量高的种子;因此，没有办法观察和分析种子不同区域细胞和储存材料的形态。LR白树脂是一种丙烯酸树脂，具有低粘度和强渗透性，在制备种子树脂部分方面具有良好的应用，特别是对于体积大、淀粉含量高的谷类成熟内核。此外，嵌入在LR白树脂中的样品可以很容易地用许多化学染料染色，以清楚地显示细胞和储存材料在光或荧光显微镜下7的形态。在之前的一篇论文中，我们报告了一种干燥分段方法，用于制备嵌入在LR白树脂中的成熟谷仁全种子大小的部分。该方法还可以准备开发、发芽和煮熟的谷仁8的整籽大小部分。获得全种子大小的部分在微形态观察和分析方面有许多应用，特别是用于清晰观察和定量分析种子8、9等不同区域细胞和储存材料的形态差异。
这项技术适合研究人员使用光显微镜观察组织微观结构以及不同种子区域的细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形状和大小。通过形态分析软件，可对专为展示细胞、淀粉颗粒和蛋白质体而染色的整籽大小部分的图像进行定量测量，定量测量种子不同区域细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态参数。为了论证技术适用性和全种子尺寸部分应用，我们研究玉米和油菜的成熟种子以及水稻的发育、发芽和熟核。该协议包含四个进程。在这里，我们使用成熟的玉米仁，这是最难准备整个种子大小的部分，由于体积大，淀粉含量高，作为一个样本，以逐步展示的过程。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A501931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact glass staining jar (5-Place)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E678013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A100472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>F518211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided blade</td>
			<td>Gillette Shanghai Co., Ltd.</td>
			<td>74-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A500737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flattening table</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent brightener 28</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>910090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass strips</td>
			<td>Leica</td>
			<td>840031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% solution in water</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A500538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A507048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.</td>
			<td>9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A100512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>F518101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>F519022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dodecahydrate</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A607793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A502805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple dry sectioning method for obtaining whole-seed-sized resin section and its applications

种子中细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态、大小和数量决定了种子的重量和质量。它们在不同的种子区域之间有显著差异。为了清晰地查看细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态，并定量分析其形态参数，需要全种子大小的部分。虽然全种子大小的石蜡部分可以研究种子中储存材料的积累，但由于厚段的低分辨率，很难定量分析细胞和储存材料的形态参数。薄树脂部分具有高分辨率，但常规树脂分段方法不适合准备体积大、淀粉含量高的成熟种子全种子尺寸部分。本研究提出了一种简单的干截面方法，用于制备全种子大小的树脂部分。该技术可以准备交叉和纵向全种子大小的部分开发，成熟，发芽，煮熟的种子嵌入在LR白树脂，甚至为高淀粉含量的大种子。全种子大小的部分可以染色荧光增白剂28，碘，和库马西辉煌的蓝色R250，以具体地分别显示细胞，淀粉颗粒和蛋白质体的形态。获得的图像还可以定量分析，以显示不同种子区域细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态参数。

简单的干截面方法，用于获取全种子大小的截面 我们建立了一个简单的干截面方法，用于制备嵌入在LR-白色树脂中的种子的整种子大小的部分（图1）。该方法可以制备厚度为2μm的横向和纵向全种子尺寸部分（图2-5，补充图1-4）。例如，油菜的成熟种子可以横向和纵向分段（图2）。</str...

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A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

该技术允许快速、简朴地制备全种子大小的树脂部分，用于观察和分析种子不同区域的细胞、淀粉颗粒和蛋白质体。

获得全种子尺寸树脂部分的简单干截块方法及其应用

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

形态学科学与细胞、淀粉颗粒和核蛋白体的质量决定了种子的重量和质量。在这项研究中，我们提出了一个嵌入在LR白树脂中的整个内核的简单群体，并建立了一个简单的全内核干吸法。出于两个主要原因，我们选择LR白树脂作为嵌入式介质。首先，它的粘度低，渗透性强，在制备这一强大的种子部分方面具有良好的应用，特别是对于体积大、淀粉含量高的谷物成熟内核。其次，嵌入在LR白树脂中的样品可以很容易地用许多化学染料染色，用荧光显微镜清楚地显示样品在光下的形态。所准备的部分可以专门染色，以显示细胞，淀粉颗粒，蛋白质体明显出现整个内核，形态参数也可以定量分析。该方法包含研究。在这里，我们使用体积大、淀粉含量高的成熟玉米仁作为样品，逐步展示工艺过程。首先，将内核切成简单的瓶子。加入约10毫米2.5%磷酸盐缓冲的谷胱甘肽。多一个 pH 7.2， 并把它们放在 4 摄氏度 48 小时， 以修复他们两个。然后拿出这些内核，纵向或横向切开，厚度为两到三毫米。你需要一个锋利的双面刀片。再修48小时接下来，用约10毫米洗样品三次，所以0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.2每次30分钟。逐步对样品进行水合，先在约10毫米的30%乙醇水溶液中浸泡30分钟，然后连续浸泡在10毫米中，50%70%90%一次，100%三次。为了逐步渗透样品，先后用10毫米的LR白树脂溶液，用乙醇稀释25%50%75%一次，100%两次在4摄氏度下每次12小时。在嵌入之前，我们需要为样本准备基座。将250微升纯LR白树脂加入两毫米离心管中，在6摄氏度下聚合48小时。接下来，连续添加500微升纯LR白树脂，用基座将样品渗入离心管。用解剖针拉直样品后，将树脂在6摄氏度的烤箱中放入48小时。从离心管中拿出这些嵌入的内核，并使用锋利的刀片在样品周围切掉多余的树脂。将树脂块放在微酮样品架中，用刀片修剪样品表面和样品周围的多余树脂。最后用玻璃刀进一步抛光样品表面，直到形成完整的部分。现在是时候准备这个惊人的部分与两微米厚度。在切片之前，将一个小铜在刀片边缘上方约两毫米左右，以防止一个部分卷曲。当节拉长时，在节下放一个辐条来支持它。接下来，在未拉伸的幻灯片上添加 100 微升水，并小心地将完整且不间断的部分与处理器一起转移到水中。加热并在50摄氏度干燥，以平滑皱纹部分。最后，两个重要的提示需要注意。首先，如果该部分碎裂或撕裂，延长样品每次树脂渗透的时间。其次，如果该部分有一些平行于刀的线，则紧夹样品块。如果该部分有一些垂直于刀的线，请使用新刀。为了观察细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态，我们可以分别用荧光增白剂28、碘溶液和库马西亮蓝色R250染色。对于其他特定的污渍，基于建议研究。在这里，我们用碘溶液来染色淀粉颗粒作为例子。加入40微升碘溶液，浸入该部分。在罐子里留一分钟然后用盖套盖住样品。并污点掉它周围的多余的代理解决方案。立即在配备闭路电视摄像机的光学显微镜下观察和拍摄样品。我们可以使用形态分析软件对不同区域的面积、长访问或短访问、细胞、淀粉颗粒和蛋白质体圆度进行处理和定量分析。我们建立了一个简单的干截面方法，用于在LR白树脂中保留整个内核大小的截面。该方法可以准备两微米的整个内核的横向和纵向部分。或举例说，油菜的成熟整种可以横向和纵向分段。玉米成熟整核的部分，体积较大，也可以成功准备。此外，还可以使用该方法对开发内核、熟食内核和发芽内核进行调查。整个内核的准备部分具有以下应用程序。首先，整个内核的部分可以用来观察种子的组织结构。例如，沾有沙夫兰素的油菜油菜整个胚胎的部分可以清楚地显示它是一个激进的，超随意的，内和外的部分整个内核的部分可以用来观察和分析细胞的形态。例如，油菜整个胚胎的横向部分被荧光增白剂28染色，细胞油被专门染色。整个胚胎任何区域细胞的微形态都可以以高放大率显示。通过形态分析软件对表质细胞的形态参数进行定量分析，并表现出胚胎不同区域的一些差异。用荧光增白剂28染色的玉米整核的横向部分也可以作为细胞的形态表现出来，细胞的形态参数在内膜的不同区域是不同的。整片内核的各部分可以染色碘溶液，以表现淀粉颗粒的形态，例如，沾染碘的玉米仁的横向和纵向部分可以清晰地表现出淀粉颗粒的形态。不同区域的淀粉颗粒在内分泌细胞的形态、大小和数量上表现出显著差异。因此，对淀粉颗粒形态参数的定量分析表明，淀粉颗粒在不同区域内膜的内分值差异显著。这些部分可用于观察和分析蛋白质体的形态。例如，淀粉蛋白是染色蓝色使用库马西辉煌的蓝色R250。在低放大率中可以观察到油菜整个胚胎中淀粉蛋白的空间分布，在高放大率下可以明显地表现出微观结构。此外，还可以定量分析选定区域蛋白质体的数字误差指数和形态参数。该技术从发育和成熟种子中首次简单制备了整个内核的树脂部分。部分应用在全核组织结构中，然后研究整个内核不同区域的细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的结构。可以定量分析采集的图像，以显示细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态参数，并进一步比较整个内核的不同区域。

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