Name: a simple dry sectioning method for obtaining whole-seed-sized resin section and its applications
Uploaded: 2021-01-23T13:00:00
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中国国立自然科学財団(32071927)、揚州大学の人材プロジェクト、江蘇高等教育機関の優先アカデミックプログラム開発によって資金提供されました。

1. 樹脂埋め込み種子の調製(図1)
<ol><li>トウモロコシ成熟したカーネルを10 mLの2.5%リン酸緩衝グルタルアルデヒド(0.1 M,pH7.2)で4°Cで48時間固定します。研究者は、研究目的と組織タイプに応じて、他の固定混合物、固定濃度、および固定条件を選択することができます。</li>
	<li>カーネルを取り出し、鋭利な両面ブレードを使用して2〜3mmの厚さに縦方向または経線状にスライスし、2.5%リン酸緩...

<ol>
	<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+structure+and+spatial+distribution+in+endosperm+of+high-amylose+rice+starch+granules+with+different+morphologies.">Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+defective+effect+of+starch+branching+enzyme+IIb+from+weak+to+strong+induces+the+formation+of+biphasic+starch+granules+in+amylose-extender+maize+endosperm.">The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm.</a> Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradually+decreasing+starch+branching+enzyme+expression+is+responsible+for+the+formation+of+heterogeneous+starch+granules.">Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules.</a> Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dek35+encodes+a+PPR+protein+that+affects+cis-splicing+of+mitochondrial+nad4+intron+1+and+seed+development+in+maize.">Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize.</a> Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).</li><li>Hu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+structure+characteristics+to+form+ultrahigh+oil+content+in+rapeseed.">Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed.</a> PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+VKS1+regulates+mitosis+and+cytokinesis+during+early+endosperm+development.">Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development.</a> Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).</li><li>Xu, A., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+and+applications+of+different+sections+in+investigating+the+microstructure+and+histochemistry+of+cereal+kernels.">Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels.</a> Plant Methods. 16, 8 (2020).</li><li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein.">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li><li>Zhao, L., Cai, C., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+processing+method+for+investigating+the+morphology+of+cereal+endosperm+cells.">An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells.</a> Biotech &amp; Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).</li><li>Borisjuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+architecture+shapes+embryo+metabolism+in+oilseed+rape.">Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).</li><li>Lott, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+bodies+in+seeds.">Protein bodies in seeds.</a> Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).</li><li>Jing, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+endosperm+cells+and+starch+granules+in+common+wheat.">Development of endosperm cells and starch granules in common wheat.</a> Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).</li></ol>

種子は、食品、飼料、工業原料のための最も重要な再生可能資源であり、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料が豊富です。細胞の形態と量、および貯蔵材料の内容と構成は、種子7、12の重量と品質に影響を与えます。ステテロロジーと画像解析技術は、組織領域内の細胞のサイズと量を測定することができますが、多くの研究室に欠けています?...

植物の種子は、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料を含み、人々にエネルギーと栄養を提供します。セルと保管材料の形状、サイズ、および量によって、シードの重量と品質が決まります。種子の異なる領域の細胞および貯蔵材料は、特にデンプン分岐酵素IIb1、2、3の阻害を伴ういくつかの高アミロース穀物作物について、著しく異なる形態を有する。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を調べることは非常に重要である。
パラフィン切片は、種サイズのセクション全体を調製する良い方法であり、種子の組織構造と種子4、5、6の異なる領域における貯蔵材料の蓄積を示すことができる。しかし、パラフィンセクションは通常、低解像度で6〜8μmの厚さを有する。したがって、細胞や貯蔵材料の形態を明確に観察し、定量的に分析することは非常に困難です。樹脂のセクションは、通常、1〜2 μmの厚さと高分解能を有し、細胞および貯蔵材料7の形態を観察し、分析するのに非常に適している。しかし、日常的な樹脂切断法は、特に大量の澱粉含有量の高い種子に対して、シードサイズのセクション全体を準備するのが難しい。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を観察し、分析する方法はありません。LRホワイト樹脂はアクリル樹脂であり、低粘度と強い透過性を示し、種子の樹脂部分、特に大量および高デンプン含有量の穀物成熟したカーネルの準備に優れた用途につながります。また、LRホワイト樹脂に埋め込まれた試料は、多くの化学染料で容易に染色でき、光顕微鏡または蛍光顕微鏡7の下で細胞や貯蔵材料の形態を明瞭に示すことができる。前回の論文では、LRホワイト樹脂に埋め込まれた成熟したシリアルカーネルの全種サイズのセクションを調製するためのドライセパリング方法を報告しました。この方法はまた、開発、発芽および調理された穀物カーネル8の全種サイズのセクションを準備することができます。得られた全種サイズのセクションは、特に種子8,9の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態差を明確に観察し定量的に分析するための、微量形態の観察および分析において多くの用途を有する。
この技術は、組織の微細構造と細胞の形状と大きさ、デンプン顆粒、および異なる種子領域のタンパク質体を光学顕微鏡を用いて観察したい研究者に適しています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体を示すために特別に染色された全種サイズのセクションの画像を形態解析ソフトウェアで解析し、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態パラメータを定量的に測定することができます。技術的な適用性と全種サイズのセクションアプリケーションを実証するために、我々は、トウモロコシと油糧種子菜種の成熟した種子と、この研究で米の開発、発芽、調理されたカーネルを調査しました。プロトコルには 4 つのプロセスが含まれています。ここでは、大量の澱粉含有量が多いためにシードサイズのセクション全体を準備する際に最も困難な成熟したトウモロコシカーネルを、工程を段階的に示すサンプルとして使用します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A501931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact glass staining jar (5-Place)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E678013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A100472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>F518211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided blade</td>
			<td>Gillette Shanghai Co., Ltd.</td>
			<td>74-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A500737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flattening table</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HI1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent brightener 28</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>910090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass strips</td>
			<td>Leica</td>
			<td>840031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 50% solution in water</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A500538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A507048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1281A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.</td>
			<td>9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A100512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>F518101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>F519022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic dodecahydrate</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A607793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A502805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple dry sectioning method for obtaining whole-seed-sized resin section and its applications

種子中の細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態、大きさ、量は、種子の重量と品質を決定します。彼らは種子の異なる領域間で有意に異なっています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態を明確に表示し、それらの形態パラメータを正確に定量的に分析するためには、全種サイズのセクションが必要です。全体の種子サイズのパラフィンセクションは、種子中の貯蔵材料の蓄積を調査することができますが、厚いセクションの低解像度のために細胞や貯蔵材料の形態パラメータを定量的に分析することは非常に困難です。薄い樹脂部は高解像度を有するが、日常的な樹脂切断法は、大きな容積および高デンプン含量の成熟した種子の全種サイズのセクションを調製するのに適していない。本研究では、全種サイズの樹脂部を作製するための簡単なドライ切片方法を紹介する。この技術は、高デンプン含有量を有する大きな種子であっても、LRホワイト樹脂に埋め込まれたクロスおよび縦方向の全種サイズのセクションを調製することができます。全種サイズのセクションは、蛍光増白剤28、ヨウ素、およびクーマシーブリリアントブルーR250で染色することができ、細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態をそれぞれ明確に示す。得られた画像を定量的に分析して、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態パラメータを示すこともできます。

全種サイズの断面を得るための簡単なドライ断面法 LR-白色樹脂に埋め込まれた種全体サイズの部分を調製するための簡単なドライ切片方法を確立します(図1)。この方法は、2 μmの厚さの横断および縦方向の全種サイズのセクションを調製することができる(図2-5、補足図1-4)。例えば、油糧種子の成?...

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A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

この技術は、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒およびタンパク質体の観察と分析のための全種サイズの樹脂セクションの迅速かつ簡単な調製を可能にする。

全種サイズ樹脂断面の簡易ドライ断面化方法とその応用

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

形態学の科学と細胞の品質、デンプン顆粒、およびカーネル内のタンパク質体は、種子の重量と品質を決定します。本研究では、LRホワイト樹脂に埋め込まれたカーネル全体の単純な集団として提示し、カーネル全体の単純なドライ吸引方法を確立する。2つの大きな理由から、組み込み媒体としてLRホワイト樹脂を選択します。第一に、それは低粘度と強い透過性であり、種子のこの強大なセクション、特に大量および高デンプン含有量を有する穀物成熟したカーネルのために準備する上で、その良いアプリケーションにつながります。第2に、LRホワイト樹脂に埋め込まれた試料を、蛍光顕微鏡で光下でサンプルの形態を明瞭に示すために、多くの化学染料で容易に染色することができる。作製したセクションは、細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体を明確に表すために染色することができ、また、形態学的パラメータも定量的に分析することができる。この方法にはスタディが含まれています。ここでは、プロセスを段階的に示すために、より大きなボリュームと高デンプン含有量を持つ成熟したトウモロコシカーネルをサンプルとして使用します。まず、カーネルを単純なボトルにクリップします。約10ミリメートルの2.5%リン酸緩衝型グルタルアルデヒドを加えます。もう1つのpH 7.2を置き、それらを両方を修正するために48時間摂氏4度でそれを置きます。次に、これらのカーネルを取り出し、2〜3ミリメートルの厚さで縦または横方向にスライスします。鋭い両面ブレードが必要です。そして、さらに48時間それらを修正します。次に、サンプルを約10ミリメートルで3回洗うので、0.1 Mリン酸緩衝液、pH 7.2を毎回30分間洗浄します。サンプルを段階的に水和するには、まず30%エタノール水溶液の約10ミリメートルに30分間浸し、10ミリメートルに連続して浸漬し、50%70%90%を1回、100%3回浸します。サンプルをステップごとに浸透させるために、1回25%50%75%のエタノールで希釈したLRホワイト樹脂溶液を10ミリメートルずつ、摂氏4度で100%2回毎回12時間ずつ回収します。埋め込む前に、サンプル用の台座を用意する必要があります。2ミリメートルの遠心管に250マイクロリットルの純LRホワイト樹脂を加え、摂氏6度で48時間重合します。次に、500マイクロリットルの純LR白樹脂を連続して加え、試料をペダーで遠心管に浸潤させる。解剖学的針でサンプルをまっすぐにした後、樹脂を6度のオーブンに48時間入れます。遠心管からこれらの埋め込みカーネルを取り出し、鋭い刃を使用してサンプルの周りに余分な樹脂を切り取ります。マイクロトーンのサンプルホルダーに樹脂ブロックを置き、余分な樹脂をサンプルの表面とブレードでサンプルの周囲に切り取ります。さらに完全な部分が形成されるまでガラスナイフでサンプルの表面をさらに研磨します。今では2ミクロンの厚さでこの素晴らしいセクションを準備する時間です。スライスする前に、小さな銅を刃の端の約2ミリメートル上に置き、セクションがカールするのを防ぎます。セクションが伸びるにつれて、それをサポートするためにセクションの下にスポークを置きます。次に、100マイクロリットルの水を未突出スライドに加え、完全な切れ目のない部分を慎重に処理器と一緒に水に移します。50度で加熱乾燥し、しわの部分を滑らかにします。最後に、2つの重要なヒントに注意が必要です。まず、セクションが崩れたり涙を流したりした場合、サンプルの樹脂浸潤ごとに時間を延長する。次に、セクションにナイフに平行な線がある場合は、サンプルブロックをしっかりとクランプします。セクションがナイフに垂直のいくつかの線を持っている場合は、新しいナイフを使用してください。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態を観察するために、蛍光増白剤28、ヨウ素溶液、およびクマシーブリリアントブルーR250でそれぞれセクションを染色することができます。他の特定の汚れについては、提案研究に基づいてそれを行います。ここでは、澱粉顆粒を染色するヨウ素溶液を例に用います。40マイクロリットルのヨウ素溶液を加える。そして、1分間瓶の中に保管してください。そして、カバースリーブでサンプルをカバーします。そして、その周りの過剰なエージェントソリューションを消してください。CCTVカメラを搭載した照明顕微鏡の下でサンプルを直ちに観察し、撮影します。画像の領域、長いまたは短いアクセス、および異なる領域の細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の丸みを、形態解析ソフトウェアを使用して処理し、定量的に分析することができます。カーネルサイズのセクション全体をLRホワイト樹脂に保持するための簡単なドライ切片法を確立します。この方法は、2ミクロンのカーネル全体の横方向および縦方向のセクションを準備することができます。または例えば、油糧種子菜種の成熟した種子全体を横断的かつ縦方向に切り離すことができる。より大きなボリュームを持つトウモロコシの成熟したカーネル全体のセクションも正常に準備することができます。また、開発中のカーネル、調理されたカーネル、および発芽したカーネルも、この方法を用いて調査することができる。カーネル全体の準備されたセクションには、以下のアプリケーションがあります。まず、カーネル全体のセクションを使用して、種子の組織構造を観察することができます。例えば、サフラニンで染色された油糧種子菜種の全胚のセクションは、それが明確にラジカル、ハイパーカジュアル、内側および外側のカーネル全体のセクションを細胞の形態を観察し、分析するために使用することができる。例えば、油糧種子菜種の全胚の横切片は蛍光増輝体28で染色され、細胞油は特異的に染色される。全胚の任意の領域における細胞の微小形態は高倍率で表示することができる。層状細胞の形態パラメータは、形態解析ソフトウェアを用いて定量的に解析することができ、胚の多様な領域に若干の違いを示すことができる。蛍光増輝体28で染色されたトウモロコシの全核の横切片は、細胞の形態としても発揮でき、また、細胞の形態パラメータは、子宮内精子の多様な領域において異なっている。全体のカーネルのセクションは、澱粉顆粒のその形態を示すためにヨウ素溶液で染色することができ、例えば、横の横、ヨウ素で染色されたトウモロコシカーネルの縦断面は、デンプン顆粒のその形態をはっきりと示すことができる。多様な領域のデンプン顆粒は、子宮内精子細胞の形態、大きさ、量が大きく異なっています。したがって、デンプン顆粒の形態学的パラメータの定量分析は、それらが子宮内精子の多様な領域で有意に異なっていることを示している。このセクションは、タンパク質体の形態を観察し、分析するために使用することができます。例えば、澱粉タンパク質は、クマシーブリリアントブルーR250を用いて青色に染色される。油糧種子菜種の胚全体におけるデンプンタンパク質の空間分布は、低倍率で観察することができ、微細構造は高倍率で明確に発揮することができる。また、選択した領域におけるタンパク質体の数値誤差指数および形態パラメータも定量的に分析することができる。この技術は、開発および成熟した種子からカーネル全体の樹脂セクションの最初かつ簡単な準備を提供します。全カーネルの組織構造における断面の適用、そして、細胞、デンプン顆粒、および全カーネルの異なる領域におけるタンパク質体の形態を調査する。取得した画像を定量的に分析して、細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態パラメータを示し、さらにカーネル全体の異なる領域でそれらを比較することができます。

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