Name: spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells at JoVE.com

एसबी, एसएम और डीएम को सीएनआरएस, इंसर्म और ऐक्स-मार्सिले विश्वविद्यालय से संस्थागत वित्त पोषण और फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (एएनआर -17-सीई 15-0032-01 और एएनआर -18-सीई 15-0021-02) और फ्रांसीसी "इन्वेस्टिसमेंट डी'एवेनिर" (एएनआर -10-आईएनबीएस -04 फ्रांस-बायोइमेजिंग, एएनआर -11) से कार्यक्रम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। किलोवाट जैव प्रौद्योगिकी और नैनो टेक्नोलॉजी के क्षेत्र में अंतःविषय पर्यावरण डॉक्टरेट अध्ययन ों का एक कार्यक्रम "बायोटेक्नान" स्वीकार करता है। ईबी परियोजना संख्या 2016/21/डी/एनजेड1/00285 के तहत पोलैंड के राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र (एनसीएन) के साथ-साथ फ्रांसीसी सरकार और पोलैंड में फ्रांस के दूतावास की वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है। एमओ पोलिश विकास मंत्रालय (सीबीआर पीओआईआर.02.01.00-00-0159/15-00/19) और नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च एंड डेवलपमेंट (इनोकेम पीओआईआर.01.02.00-00-0064/17) से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है। टीटी परियोजना संख्या 2016/21/बी/एनजेड3/00343 के तहत पोलैंड के राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र (एनसीएन) और व्रोकला जैव प्रौद्योगिकी केंद्र (जीओएन) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

यहां, हमने एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर एसवीएफसीएस मॉड्यूल के कार्यान्वयन का वर्णन किया है, एफसीएस प्रसार कानून विश्लेषण के लिए जीवित कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली संगठन की गतिशीलता को समझने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण। वैचारिक रूप से, एसवीएफसीएस एक सरल सिद्धांत पर आधारित है: रोशनी क्षेत्र23 के आकार को बदलते हुए समय डोमेन में प्रतिदीप्ति का सहसंबंध माप। यह रणनीति सूक्ष्म माप से नैनोस्कोपिक जानकारी को कम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जो स्थिर अवस्था 25 और शारीरिक प्रक्रियाओं 30,31,32,33 में प्लाज्मा झिल्ली संगठन में योगदान देने वाले मुख्य भौतिक रासायनिक तत्वों को समझने में मदद करती है। कुल मिलाकर, ये एसवीएफसीएस विश्लेषण विभिन्न सेल प्रकारों में लिपिड-निर्भर नैनोडोमेन के अस्तित्व और विभिन्न सिग्नलिंग घटनाओं को ट्यून करने में उनके प्रत्यक्ष निहितार्थ को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करते हैं।
इस ढांचे के भीतर, फोटॉन बजट को अनुकूलित करने और ऑप्टिकल विपथन को कम करने के लिए एसवीएफसीएस सेटअप का निर्माण करते समय कुछ ऑप्टिकल पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, हम एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सलाह देते हैं जिसमें से एसवीएफसीएस माप किए जाने पर ट्यूब लेंस को हटाया जा सकता है। इसके अलावा, एक एकल आईरिस एसवीएफसीएस सेटअप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: यह उद्देश्य के पीछे के एपर्चर पर बीम आकार को बदलता है, इस प्रकार सीधे प्रभावी कमर के आकार (यानी, प्रभावी उत्तेजना मात्रा) को बदलता है। बीम व्यास को सबसे छोटे कमर आकार34 प्राप्त करने के लिए उद्देश्य वापस पुतली को फिट करना चाहिए। यह विकल्प, जो कमर के आकार को ट्यून करने में मदद करता है, फोटॉन बजट का अनुकूलन सुनिश्चित करता है और इसे लागू करना आसान है। अंत में, प्रकाश पथ के साथ ऑप्टिकल भागों की एक न्यूनतम संख्या का उपयोग किया जाता है; सिस्टम जितना कम जटिल होगा, फोटॉन उतने ही कम खो जाएंगे। ये सभी विकल्प एसवीएफसीएस प्रयोगों की मजबूती में काफी सुधार करते हैं।
प्रोटोकॉल के बारे में ही, कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण ऑप्टिकल पथों का एक उपयुक्त संरेखण है जो सफल एसवीएफसीएस माप (प्रोटोकॉल, अनुभाग 2) के लिए महत्वपूर्ण है। यह 2 एनएम आरएच 6 जी समाधान से प्रतिदीप्ति संकेत का विश्लेषण करके जांचना आसान है, जो 300 μW लेजर रोशनी के तहत ~ 200 किलोहर्ट्ज़ होना चाहिए। सभी इरिस खोले जाने चाहिए, और एसीएफ में एक महत्वपूर्ण आयाम होना चाहिए (आमतौर पर जी0 ~ 1.5–2.0)। एक और महत्वपूर्ण बिंदु कोशिकाओं और एसवीएफसीएस विश्लेषण (प्रोटोकॉल, धारा 4-8) के लिए उनकी तैयारी की चिंता करता है। उनके घनत्व को अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि देखी जाने वाली पृथक कोशिकाएं विश्लेषण के लिए उपलब्ध हों। गैर-अनुयायी कोशिकाओं को पॉली-एल-लाइसिन समाधान का उपयोग करके एक कक्षीय कवरग्लास पर स्थिर किया जाना चाहिए। सेल लेबलिंग से प्रतिदीप्ति संकेत बहुत मजबूत नहीं होना चाहिए, या इसके परिणामस्वरूप बहुत सपाट एसीएफ होंगे जो फिट करना मुश्किल है, और फिट पैरामीटर एक महत्वपूर्ण त्रुटि के साथ बोझ हैं। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं में गैर-सजातीय लेबलिंग और प्रतिदीप्ति समुच्चय एसवीएफसीएस माप की व्याख्या करना बेहद मुश्किल बनाते हैं। अंत में, कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, और एसवीएफसीएस विश्लेषण उपचार के एक घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। ऊपरी प्लाज्मा झिल्ली से प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव को रिकॉर्ड करना भी बेहतर है क्योंकि यह समर्थन से जुड़ा नहीं है, और समर्थन के साथ शारीरिक बातचीत के कारण अणुओं के बाधित प्रसार का कोई खतरा नहीं है।
पता लगाने की मात्रा को समायोजित करने के लिए तौर-तरीकों की विविधता के कारण विभिन्न दृष्टिकोणों में इसके उपयोग के लिए एसवीएफसीएस तकनीक में पर्याप्त प्रगति हुई है, जिससे जीवित कोशिकाओं में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना संभव हो गया है। उत्तेजना मात्रा के आकार को समायोजित करने का एक विकल्प एक चर बीम विस्तारक35 का उपयोग करना है। जेड दिशा36 के साथ प्लाज्मा झिल्ली के अवरोधन से फ्लोरोसेंट सिग्नल रिकॉर्ड करके रोशनी क्षेत्र के आकार को संशोधित करना भी संभव है। यह एक मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है जिसके लिए प्रसार कानून37,38 प्राप्त करने के लिए एक सैद्धांतिक ढांचा विकसित किया गया है।
यद्यपि एसवीएफसीएस विधि स्थानिक-लौकिक संकल्प प्रदान करती है, जो प्लाज्मा झिल्ली के असजातीय पार्श्व संगठन के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है, कारावास के ज्यामितीय तरीके पारस्परिक रूप से अनन्य नहीं हैं। एक दिशा या दूसरे में टी 0 का विचलन विशेष रूप से कारावास25 के एक प्रमुख मोड को प्रकट करता है। इसके अलावा, वर्तमान एसवीएफसीएस विधि की एक और महत्वपूर्ण सीमा शास्त्रीय ऑप्टिकल विवर्तन सीमा (~ 200 एनएम) से उत्पन्न होती है। यह निर्विवाद रूप से कोशिका प्लाज्मा झिल्ली के भीतर अणुओं को सीमित करने वाले डोमेन से अधिक है। इसलिए, कारावास का विश्लेषण टी 0 मान से अनुमान लगाया जाता है, जो प्रसार कानून से एक्सट्रपलेशन किया जाता है।
वैकल्पिक तरीकों को लागू कर इस कमी को दूर किया गया है। प्रारंभ में, नैनोएपर्चर के साथ ड्रिल की गई धातु फिल्मों का उपयोग करके एक बहुत छोटे झिल्ली क्षेत्र को रोशन करने की संभावना की पेशकश की गई (यानी, 75 और 250 एनएम के बीच भिन्न त्रिज्या के एकल नैनोमेट्रिक एपर्चर की ऑप्टिकल विवर्तन सीमा से नीचे)39। पृथक डोमेन संगठन के लिए सैद्धांतिक प्रसार कानून से भविष्यवाणी की गई संक्रमण शासन इस प्रकार रिपोर्ट की गई थी, और इसने नैनोमेट्रिक झिल्ली विषमताओं के विशिष्ट आकार के शोधन और लिपिड-निर्भर नैनोडोमेन39 द्वारा कब्जा किए गए सतह क्षेत्र के मात्रात्मक अनुमान की अनुमति दी। वैकल्पिक रूप से, नैनोमेट्रिक रोशनी को निकट-क्षेत्र स्कैनिंग ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी40 या प्लानर ऑप्टिकल नैनोएंटेनास41 का उपयोग करके भी विकसित किया गया है। हाल ही में, उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी) और एफसीएस के संयोजन ने बहुत अधिक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ प्रसार कानून का दस्तावेजीकरण करने के लिए एक शक्तिशाली और संवेदनशील उपकरण प्रदान किया है। यह एसटीईडी-एफसीएस थोड़े समय के भीतर होने वाले नैनोस्केल पर आणविक प्रसार विशेषताओं तक पहुंच प्रदान करता है, जिससे प्लाज्मा झिल्ली42,43 पर लिपिड जांच के गतिशील संगठन के अध्ययन की अनुमति मिलती है। हालांकि, एसटीईडी प्रक्रिया में प्रतिदीप्ति का अधूरा दमन एफसीएस में ऑटो-सहसंबंध घटता के विश्लेषण को चुनौती देता है।
इस कठिनाई को दूर करने के लिए एक नया फिटिंग मॉडल विकसित किया गया है, प्रसार समय की सटीकता में सुधार और औसत अणु संख्या माप44. अंत में, प्लाज्मा झिल्ली पर धीमी आणविक प्रसार के लिए, एसवीएफसीएस सिद्धांत को छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी45 द्वारा दर्ज डेटा पर लागू किया जा सकता है। हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इमेजिंग कुल आंतरिक प्रतिबिंब-एफसीएस (आईटीआईआर-एफसीएस) के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का संयोजन प्लाज्मा झिल्ली पर आणविक प्रसार में बाधा डालने वाले तंत्र की प्रकृति के शोधन में योगदान देता है, विशेष रूप से नैनोडोमेन46 के उच्च घनत्व के कारण परकोलेशन थ्रेशोल्ड झिल्ली कॉन्फ़िगरेशन के पास।
अंत में, एसवीएफसीएस द्वारा प्रसार कानून की स्थापना ने गतिशील सामूहिक लिपिड और झिल्ली प्रोटीन के संघों द्वारा बनाई गई स्थानीय विषमता का अनुमान लगाने के लिए प्रयोगात्मक साक्ष्य प्रदान किए हैं। जैसा कि वोलैंड और सहकर्मियों46 द्वारा कहा गया है, "एफसीएस प्रसार कानून विश्लेषण गतिशील जानकारी से संकल्प सीमा से नीचे संरचनात्मक और संगठनात्मक सुविधाओं का अनुमान लगाने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बना हुआ है"। फिर भी, हमें प्रसार कानून की व्याख्या को परिष्कृत करने के लिए नए मॉडल विकसित करने की आवश्यकता है जो प्लाज्मा झिल्ली पर होने वाली आणविक घटनाओं की गतिशीलता की बेहतर समझ की अनुमति देनी चाहिए।

प्लाज्मा झिल्ली संगठन की जटिलता कोशिका झिल्ली संगठन की वर्तमान समझ को कई पहलुओं को ध्यान में रखना होगा1. सबसे पहले, एक जटिल लिपिड संरचना न केवल कोशिका प्रकारों के बीच भिन्न होती है, बल्कि एक एकल कोशिका (झिल्ली ऑर्गेनेल / इसके अलावा, संबद्ध या आंतरिक झिल्ली प्रोटीन ज्यादातर गतिशील मल्टीमेरिक परिसरों में व्यवस्थित होते हैं, झिल्ली के बाहर फैले बड़े डोमेन के साथ, अकेले ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन की तुलना में काफी बड़े क्षेत्र के लिए लेखांकन। इसके अलावा, झिल्ली से जुड़े प्रोटीन विशिष्ट लिपिड-बाइंडिंग या लिपिड-इंटरैक्टिंग क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं जो प्रोटीन फ़ंक्शन को विनियमित करने में भूमिका निभाते हैं। ये सीधे लिपिड की स्थानीय संरचना और पहुंच पर निर्भर करते हैं2.
अंत में, झिल्ली प्रोटीन की आंतरिक असममित संरचना और लिपिड के वितरण के कारण दो झिल्ली पत्रकों के बीच विषमता का एक महत्वपूर्ण स्तर देखा जाता है। दरअसल, संश्लेषण और हाइड्रोलिसिस के बीच एक लिपिड चयापचय संतुलन, पत्रक के बीच लिपिड फ्लिप-फ्लॉप के साथ संयुक्त, इस तरह के असममित वितरण उत्पन्न करता है। चूंकि बाइलेयर में कोई भी परिवहन झिल्ली के हाइड्रोफोबिक इंटीरियर के माध्यम से ध्रुवीय सिर समूह को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक मुक्त ऊर्जा से विवश होता है, इसलिए इसे आमतौर पर चयनात्मक ट्रांसपोर्टरों द्वारा सहायता प्रदान की जाती है। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए, विषमता को दृढ़ता से बनाए रखा जाता है। कुल मिलाकर, ये कारक प्लाज्मा झिल्ली 3,4 के पार्श्व विषमता या विभाजन में योगदान करते हैं।
हम प्लाज्मा झिल्ली के इस प्रतिनिधित्व को बाइलेयर के भीतर और पार आंतरिक आणविक प्रसार को ध्यान में रखते हुए समृद्ध करते हैं, जो दसवें से सैकड़ों नैनोमीटर और माइक्रोसेकंड से सेकंड के पैमाने पर गतिशील पार्श्व विषमता में योगदान देता है। उदाहरण के लिए, लिपिड-निर्भर झिल्ली नैनोडोमेन-तथाकथित लिपिड राफ्ट, कोलेस्ट्रॉल के रूप में परिभाषित, और स्फिंगोलिपिड-समृद्ध सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म-प्लाज्मा झिल्ली 5,6 के विभाजन में योगदान करते हैं। हालांकि, झिल्ली संगठन का वर्तमान दृश्य अकेले लिपिड राफ्ट तक सीमित नहीं है। झिल्ली नैनोडोमेन संरचना, उत्पत्ति और कार्य में अधिक जटिल और विषम हैं। फिर भी, प्लाज्मा झिल्ली में उनकी उपस्थिति को कसकर समन्वित किया जाना चाहिए, और प्रोटीन और लिपिड के बीच गतिशील बातचीत झिल्ली नैनोडोमेन 1,3,7,8 के स्थानिक वितरण और रासायनिक संशोधन में महत्वपूर्ण प्रतीत होती है।
प्लाज्मा झिल्ली के संगठन की जांच करने के लिए एसवीएफसीएस सिद्धांत और इसका अनुप्रयोग यद्यपि झिल्ली डोमेन के विश्लेषण में बहुत प्रगति हुई है, मुख्य रूप से बायोफिजिकल तकनीकों के माध्यम से, प्लाज्मा झिल्ली के स्थानीय संगठन को निर्देशित करने वाले निर्धारकों को उचित स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ परिष्कृत करने की आवश्यकता है। व्यक्तिगत अणुओं पर नज़र रखने के आधार पर निर्धारक उत्कृष्ट स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करते हैं और गति 9,10,11,12 के विभिन्न तरीकों के लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं, लेकिन शास्त्रीय कम कैमरा फ्रेम दरों के साथ एक सीमित अस्थायी रिज़ॉल्यूशन होता है और प्रक्षेपवक्र की एक महत्वपूर्ण संख्या को रिकॉर्ड करने के लिए अधिक प्रयोगात्मक प्रयास की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, झिल्ली घटकों के प्रसार गुणांक का मूल्यांकन फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) 13 या प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) 14 के बाद प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध को अधिक ध्यान दिया गया है, मुख्य रूप से इसकी उच्च संवेदनशीलता और चयनात्मकता, सूक्ष्म पहचान की मात्रा, कम आक्रामकता और विस्तृत गतिशील रेंज15 के कारण।
एफसीएस का वैचारिक आधार लगभग 50 साल पहले16,17 साल पहले मैगडे और सहयोगियों द्वारा पेश किया गया था। यह एक उच्च अस्थायी संकल्प (μs से s) 18 के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के उतार-चढ़ाव को रिकॉर्ड करने पर आधारित है। इसके आधुनिक संस्करण में, जीवित कोशिकाओं में माप ब्याज के क्षेत्र (जैसे, प्लाज्मा झिल्ली पर) के भीतर स्थित एक छोटे से कॉन्फोकल उत्तेजना मात्रा (~ 0.3 फेम्टोलीटर) द्वारा किया जाता है; अवलोकन मात्रा के अंदर और बाहर जाने वाले फ्लोरोसेंट अणुओं को फैलाने से उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेत बहुत उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन (यानी, डिटेक्टर पर प्रत्येक फोटॉन के आगमन का समय) के साथ एकत्र किया जाता है। फिर, सिग्नल की गणना ऑटोकोरिलेशन फ़ंक्शन (एसीएफ) उत्पन्न करने के लिए की जाती है, जिसमें से औसत समयटी डी (प्रसार समय) जिसके लिए एक अणु फोकल वॉल्यूम के भीतर रहता है, साथ में कणों की औसत संख्या, (एन), अवलोकन मात्रा में मौजूद है, जो एसीएफ के आयाम के विपरीत आनुपातिक है। यह अंतिम पैरामीटर अवलोकन मात्रा के भीतर अणु एकाग्रता पर उपयोगी जानकारी हो सकती है।
तब से, एफसीएस तौर-तरीकों की बढ़ती संख्या को बायोफोटोनिक्स में तेजी से विकसित इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए धन्यवाद लागू किया गया है, जिससे जीवित प्रणालियों में होने वाली गतिशील घटनाओं का वर्णन हो सकता है। फिर भी, एक आणविक प्रजाति प्रसार गुणांक मूल्यों के अधिक अतिव्यापी वितरण का अनुभव करेगी, जो आमतौर पर एक विषम प्रसार विशेषता द्वारा परिलक्षित होती है, जिसमें अणु समय19 में एक गैर-रेखीय संबंध के साथ फैलते हैं, और इस विषम उपविभाजन के जैविक अर्थ की पहचान करने में कठिनाई होती है। अतीत में, इस कठिनाई को केवल एक क्षेत्र के बजाय विभिन्न आकारों के क्षेत्रों से एफआरएपी द्वारा आणविक प्रसार को रिकॉर्ड करके कुछ हद तक दूर किया गया है, जिससे अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान की जाती है। इसने सक्षम किया, उदाहरण के लिए, झिल्ली माइक्रोडोमेन20,21,22 की अवधारणा।
एफसीएस माप (यानी, तथाकथित स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसवीएफसीएस)) के लिए इस रणनीति का अनुवाद अवलोकन की फोकल मात्रा के आकार को बदलकर स्थापित किया गया था, जिससे प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव को विभिन्न स्थानिक तराजू23 पर दर्ज किया जा सकता है। इस प्रकार, एसवीएफसीएस दृष्टिकोण अप्रत्यक्ष स्थानिक जानकारी प्रदान करता है जो आणविक प्रसार मोड और झिल्ली विभाजन के प्रकार (पृथक बनाम सन्निहित डोमेन24) अध्ययन किए गए अणुओं की पहचान और निर्धारण की अनुमति देता है। कमर (ω) मूल्य द्वारा परिभाषित विभिन्न स्थानिक तराजू के एक समारोह के रूप में प्रसार समयटी डी की साजिश रचकर, जो इस मामले में पता लगाने वाले बीम त्रिज्या आकार से मेल खाती है23,25, कोई किसी दिए गए शारीरिक स्थिति में किसी दिए गए अणु के प्रसार कानून को चिह्नित कर सकता है। इसलिए, एसवीएफसीएस समय डोमेन26 में एकल-कण ट्रैकिंग के लिए एक आदर्श एनालॉग है। ब्राउनियन प्रसार बाधा के तहत, किसी को प्रसार समयटी डी और कमर ω (चित्रा 1)23,25 के बीच कड़ाई से रैखिक संबंध की उम्मीद करनी चाहिए। इस योजना से प्रसार कानून के विचलन की उत्पत्ति को गैर-अनन्य कारणों से जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जैसे साइटोस्केलेटन जालवर्क, आणविक भीड़, नैनोडोमेन में गतिशील विभाजन, या इन और अन्य प्रभावों के किसी भी संयोजन (चित्रा 1), और प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण करने की आवश्यकता है25.
यहां हम स्क्रैच से निर्मित कस्टम-निर्मित एसवीएफसीएस ऑप्टिकल सिस्टम के दैनिक उपयोग के लिए सभी आवश्यक नियंत्रण चौकियां प्रदान करते हैं, जो उस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण पर हमारे पिछले प्रोटोकॉल समीक्षा27,28 का पूरक है। इसके अलावा, अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम सेटअप के अंशांकन, कोशिकाओं की तैयारी, डेटा अधिग्रहण और थाइ 1-जीएफपी के लिए एसवीएफसीएस प्रसार कानून (डीएल) की स्थापना के लिए विश्लेषण के बारे में दिशानिर्देश देते हैं, एक प्लाज्मा झिल्ली ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-लंगर प्रोटीन, जिसे लिपिड-बेड़ा नैनोडोमेन29 में स्थानीयकृत करने के लिए जाना जाता है। अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार द्वारा लिपिड-राफ्ट नैनोडोमेन का आंशिक अस्थिरता थाइ 1-जीएफपी के प्रसार गुणों को कैसे प्रभावित करता है। इसके अतिरिक्त, स्क्रैच से एसवीएफसीएस सेटअप बनाने का एक विस्तृत विवरण पूरक सामग्री में प्रदान किया गया है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aligment tool</td>
			<td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPW602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td>
			<td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BNC 50 &#937; plug to 50 &#937; plug lead 2 m</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>742-4315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &#937; With connector, 1.22 m, RoHS2</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>885-8172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tee 50&#937; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &#8594; 1GHz</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>546-4948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &#8211; French Extension Lead, 230 V</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>768-5500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>452-8394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>792-4079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filtering</td>
			<td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F47-539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&#176; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F43-088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F37-496</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware correlator</td>
			<td>80 MHz Digital Correlator</td>
			<td>Correlator.com</td>
			<td>Flex02-12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td>
			<td>Lasos</td>
			<td>BLD-XT 488100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety</td>
			<td>High-Performance Black Masking Tape, 1&#34; x 180&#39; (25 mm x 55 m) Roll</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T743-2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope 
			Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS 
			(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421767-9971-711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical path</td>
			<td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25 &#181;m mounted pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P25S I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH10M-488 (HWP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RSP1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100B/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adjustable Prism Clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LB1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID25/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Optic Holder, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Stackable Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount for 1&#34; optic-usable depth &#189;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount For 1&#34;Optic-usable Depth 2&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 600mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA600/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 75mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 150mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA150/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&#34;x 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#189; &#34; (12mm) Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Clamps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black Rubberized Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ball Driver kit/ 6 tools</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BD-KIT/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP6M4M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Mount for 25.4mm optic</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 FC/APC Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S120C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, 
			L=50 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR75/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>USB Power and Energy Meter Interface</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L750/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L350/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25W3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25A90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black posterboard 20&#34; x 30&#34; (508 mm x 762 mm), 1/16&#34; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M4 Cap Screw Kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL5-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&#216;0.8 - &#216;12 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1D12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#216;1&#34; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&#216;1 mm Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1-MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1HB10-15-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Optical Table support, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1TS05-12-06-AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample nano-positionning</td>
			<td>Precision XYZ Nanopositioning</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI P527-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V 
			Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI E727-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature chamber</td>
			<td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_MTC_2000_DUO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Two Vibration Free Heater Modules</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_150_VF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PT100 Temperature Sensor</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_P100_TS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture and transfection</td>
			<td>Cos7 cells</td>
			<td>ATCC&#174;</td>
			<td>CRL-1651&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>8- well Lab-Tek chambers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PolyJet Transfection Reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol content measurement</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87786</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ROTI Nanoquant Working Solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>svFCS measurements</td>
			<td>HBSS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hepes buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cholesterol oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8868</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83697-1G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

प्लाज्मा झिल्ली संगठन से जुड़े लोगों सहित जीवित कोशिकाओं में गतिशील जैविक प्रक्रियाएं क्रमशः नैनोमीटर से माइक्रोमीटर और माइक्रोसेकंड से मिनटतक विभिन्न स्थानिक और लौकिक तराजू पर होती हैं। जैविक प्रक्रियाओं की इस तरह की एक विस्तृत श्रृंखला पारंपरिक माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण को चुनौती देती है। यहां, हम एक शास्त्रीय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसवीएफसीएस) माप को लागू करने की प्रक्रिया का विस्तार करते हैं जिसे अनुकूलित किया गया है। प्रोटोकॉल में एसवीएफसीएस सेटअप की एक विशिष्ट प्रदर्शन जांच और शारीरिक स्थितियों के तहत जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर एसवीएफसीएस द्वारा आणविक प्रसार माप के लिए दिशानिर्देश शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, हम कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार द्वारा प्लाज्मा झिल्ली बेड़ा नैनोडोमेन को बाधित करने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि प्लाज्मा झिल्ली के पार्श्व संगठन में इन परिवर्तनों को एसवीएफसीएस विश्लेषण द्वारा कैसे प्रकट किया जा सकता है। अंत में, यह प्रतिदीप्ति-आधारित विधि उपयुक्त स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ प्लाज्मा झिल्ली के पार्श्व संगठन पर अभूतपूर्व विवरण प्रदान कर सकती है।

हमने कॉस -7 कोशिकाओं (चित्रा 4, काले वर्गों) में व्यक्त थाइ 1-जीएफपी के लिए एक डीएल उत्पन्न किया। प्रसार कानून में एक सकारात्मक टी0 मान (19.47 एमएस ± 2 एमएस) है, यह दर्शाता है कि थाइ1-जीएफपी प्लाज्मा झिल्ली के नैनोडोमेन संरचनाओं में सीमित है। थाय 1-जीएफपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार के परिणामस्वरूप डीएल टी0 मान को 7.36 ± 1.34 एमएस (चित्रा 4, ग्रे वर्ग) में स्थानांतरित कर दिया गया। यह अवलोकन पुष्टि करता है कि थाइ1-जीएफपी कारावास की प्रकृति कोलेस्ट्रॉल सामग्री पर निर्भर करती है और लिपिड बेड़ा नैनोडोमेन से जुड़ी होती है। इन दो प्रसार कानूनों को ऊपर वर्णित सांख्यिकीय परीक्षण के अनुसार अलग-अलग दिखाया गया है (चरण 9.1.3 देखें) टी 0 और डीईएफएफ मानों के संदर्भ में। इसके अलावा, हमने गैर-उपचारित कॉस -7 कोशिकाओं में कुल सेलुलर कोलेस्ट्रॉल की एकाग्रता का आकलन किया, बनाम सीओएएस के साथ इलाज की गई कोशिकाएं। कुल कोलेस्ट्रॉल सामग्री में एक छोटी, लेकिन महत्वपूर्ण कमी कोओज़ उपचार (चित्रा 5) पर मनाया जाता है। चूंकि यह एंजाइम केवल प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक पर सुलभ कोलेस्ट्रॉल पूल पर कार्य करता है, इसलिए हम मानते हैं कि कोलेस्ट्रॉल में देखी गई कमी केवल प्लाज्मा झिल्ली से जुड़ी होती है और इसके परिणामस्वरूप लिपिड बेड़ा नैनोडोमेन का अस्थिरीकरण होता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> चित्रा 1: झिल्ली संगठन के विभिन्न रूपों के लिए स्पॉट-भिन्नता एफसीएस द्वारा स्थापित नकली प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) प्रसार कानून। (ऊपरी पैनल) झिल्ली संगठन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व- (ए) मुक्त प्रसार, (बी) जालवर्क बाधाएं, और (सी) जाल / डोमेन कारावास - एक एकल अणु (लाल) के लिए खींचे गए प्रक्षेपवक्र के साथ। नीले वृत्त झिल्ली के प्रतिच्छेदन और कमर ω के लेजर बीम को दर्शाते हैं। (निचले पैनल) एफसीएस प्रसार कानून प्रसार समय की साजिश रचकर दर्शाया गया है टीघ वर्ग त्रिज्या के एक समारोह के रूप में ω2. प्रसार कानून प्रक्षेपण (हरी धराशायी रेखा) मुक्त प्रसार के मामले में (ए) मूल (टी 0 = 0) पर समय अक्ष को रोकता है; (बी) नकारात्मक अक्ष (टी 0 < 0) में जब जालवर्क बाधाएं होती हैं, या (सी) सकारात्मक अक्ष में (टी 0 > 0) जब जाल और डोमेन (लिपिड राफ्ट) होते हैं। डी ब्राउनियन गति के लिए पार्श्व प्रसार गुणांक है; डीईएफएफ, प्रभावी प्रसार गुणांक; डीमाइक्रो, मेषवर्क जाल के अंदर सूक्ष्म प्रसार गुणांक; डीमें, डोमेन के अंदर प्रसार गुणांक; डीआउट, डोमेन के बाहर प्रसार गुणांक; एल, एक वर्ग डोमेन के पक्ष का आकार; और आरडी, एक परिपत्र डोमेन की त्रिज्या। इस आंकड़े को हे और मार्गुएट 6 से संशोधित किया गयाहै। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> चित्रा 2: एसवीएफसीएस हार्डवेयर नियंत्रण का योजनाबद्ध दृश्य। कंप्यूटर विभिन्न संचार प्रोटोकॉल के माध्यम से सभी उपकरणों को नियंत्रित करता है: धारावाहिक (माइक्रोस्कोप, बाहरी शटर), यूएसबी (एक्सवाईजेड पीजोइलेक्ट्रिक चरण, कोरिलेटर), और पीसीआई (अधिग्रहण बोर्ड)। डीएक्यू: डेटा अधिग्रहण बोर्ड, एपीडी: हिमस्खलन फोटोडायोड, एसपीसीएम: एकल-फोटॉन गिनती मॉड्यूल, डीओ: डिजिटल आउटपुट। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> चित्रा 3: एसवीएफसीएस सेटअप के उत्तेजना और उत्सर्जन ऑप्टिकल पथ का योजनाबद्ध दृश्य। एसवीएफसीएस सेटअप में चार मॉड्यूल होते हैं: (1) एक फाइबर वाले 488 एनएम लेजर का आउटपुट कोलिमेट किया जाता है, (2) आधा-तरंग प्लेट और ध्रुवीकरण बीम-स्प्लिटर का संयोजन ऑप्टिकल पावर सेट करता है, (3) लेजर बीम ट्यूब-लेंस मुक्त मोटर चालित माइक्रोस्कोप के माध्यम से यात्रा करने के बाद नमूने पर केंद्रित होता है, और (4) प्रतिदीप्ति का पता लगाया जाता है एक हिमस्खलन फोटोडायोड पर एक कंफोकल-जैसे पता लगाने के पथ के माध्यम से युग्मित जो एक हार्डवेयर कोरिलेटर को सिग्नल देता है। सादगी प्रणाली को इसकी संवेदनशीलता, मजबूती और उपयोग में आसानी देती है ( पूरक सामग्री में व्यापक रूप से टिप्पणी की गई)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> चित्रा 4: सीओएस -7 में व्यक्त थाइ 1-जीएफपी के प्रसार विश्लेषण से उत्पन्न एसवीएफसीएस प्रसार कानून। उपचार के बिना कॉस -7 कोशिकाओं के एसवीएफसीएस प्रसार कानून (एनटी, काले वर्ग) और कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार (सीओएएस, ग्रे सर्कल) के बाद। ग्राफ में सम्मिलित दो प्रस्तुत एसवीएफसीएस प्रसार कानूनों (मेलफर्ट एट अल 28 के अनुसार) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर के सांख्यिकीय परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है। परीक्षण मूल्य (टी) 3.8 पर सेट थ्रेसहोल्ड से ऊपर होना चाहिए जब दोनों प्रसार कानून अलग-अलग होते हैं। यह जितना अधिक होगा, प्रसार कानूनों के बीच का अंतर उतना ही अधिक होगा। टी का मान रंग-कोडित है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> चित्रा 5: कॉस -7 कोशिकाओं में कुल कोलेस्ट्रॉल सामग्री की तुलना। सीओएस -7 कोशिकाओं को या तो गैर-इलाज (एनटी) किया गया था या 1 घंटे के लिए कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज (सीओएएस) के 1 यू / डेटा ट्रिप्लिकेट में एक प्रयोग के एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय अंतर (α = 0.05) का आकलन करने के लिए एक दो-पूंछ, अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
सामग्री की तालिका: एसवीएफसीएस सेटअप के लिए आवश्यक ऑप्टिकल तत्वों की सूची।
अनुपूरक सामग्री: यह दस्तावेज़ स्क्रैच से एसवीएफसीएस सेटअप के निर्माण का वर्णन करता है। <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

इस लेख का उद्देश्य जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर आणविक प्रसार को मापने के लिए एक स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसवीएफसीएस) माइक्रोस्कोप बनाने के तरीके पर एक प्रोटोकॉल पेश करना है।

जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर आणविक प्रसार के विश्लेषण के लिए स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी

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