Name: spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells at JoVE.com

SB, SM e DM sono stati sostenuti da finanziamenti istituzionali del CNRS, dell'Inserm e dell'Università di Aix-Marseille e da sovvenzioni di programma dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR-17-CE15-0032-01 e ANR-18-CE15-0021-02) e dell'"Investissement d'Avenir" francese (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW riconosce "BioTechNan", un programma di studi di dottorato ambientale interdisciplinare KNOW nel campo delle biotecnologie e delle nanotecnologie. EB riconosce il sostegno finanziario del National Science Centre of Poland (NCN) nell'ambito del progetto n. 2016/21/D/NZ1/00285, nonché del governo francese e dell'Ambasciata di Francia in Polonia. MŁ riconosce il sostegno finanziario del Ministero dello Sviluppo polacco (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) e del Centro nazionale per la ricerca e lo sviluppo (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT riconosce il sostegno finanziario del National Science Center of Poland (NCN) nell'ambito del progetto n. 2016/21/B/NZ3/00343 e del Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo descritto l'implementazione del modulo svFCS su un microscopio fluorescente standard, un potente approccio sperimentale per decifrare la dinamica dell'organizzazione della membrana plasmatica nelle cellule viventi grazie all'analisi della legge di diffusione FCS. Concettualmente, lo svFCS si basa su un principio semplice: misure di correlazione della fluorescenza nel dominio del tempo variando le dimensioni dell'area di illuminazione23. Questa strategia è stata determinante nel dedurre informazioni nanoscopiche da misurazioni microscopiche, che aiutano a decifrare i principali elementi fisico-chimici che contribuiscono all'organizzazione della membrana plasmatica in stato stazionario25 e processi fisiologici 30,31,32,33. Complessivamente, queste analisi svFCS dimostrano inequivocabilmente l'esistenza di nanodomini lipidi-dipendenti in vari tipi di cellule e la loro implicazione diretta nella sintonizzazione di diversi eventi di segnalazione.
All'interno di questo quadro, ci sono alcuni aspetti ottici che devono essere considerati durante la costruzione della configurazione svFCS per ottimizzare il budget dei fotoni e ridurre al minimo le aberrazioni ottiche. Pertanto, si consiglia di utilizzare un microscopio da cui è possibile rimuovere la lente del tubo quando viene eseguita la misurazione svFCS. Inoltre, un singolo diaframma gioca un ruolo chiave nella configurazione svFCS: cambia la dimensione del fascio all'apertura posteriore dell'obiettivo, variando così direttamente la dimensione effettiva della vita (cioè il volume di eccitazione effettivo). Il diametro del fascio dovrebbe adattarsi alla pupilla posteriore dell'obiettivo per ottenere la più piccola dimensione della vita34. Questa opzione, che aiuta a regolare il girovita, garantisce l'ottimizzazione del budget dei fotoni ed è facile da implementare. Infine, un numero minimo di parti ottiche viene utilizzato lungo il percorso della luce; meno complesso è il sistema, meno fotoni si perdono. Tutte queste opzioni migliorano significativamente la robustezza degli esperimenti svFCS.
Per quanto riguarda il protocollo stesso, devono essere considerati alcuni passaggi critici. Il più importante è un allineamento appropriato dei percorsi ottici che è cruciale per il successo delle misurazioni svFCS (protocollo, sezione 2). Questo è facile da controllare analizzando il segnale di fluorescenza da una soluzione Rh6G da 2 nM, che dovrebbe essere ~ 200 kHz sotto l'illuminazione laser di 300 μW. Tutte le iridi devono essere aperte e gli ACF devono avere un'ampiezza importante (in genere G0 ~ 1,5-2,0). Un altro punto critico riguarda le cellule e la loro preparazione per l'analisi svFCS (protocollo, sezioni 4-8). La loro densità deve essere adattata in modo che le cellule isolate da osservare siano disponibili per l'analisi. Le cellule non aderenti devono essere immobilizzate su un vetro di copertura camerato utilizzando una soluzione di poli-L-lisina. Il segnale di fluorescenza dall'etichettatura delle celle non dovrebbe essere troppo forte, o si tradurrà in ACF molto piatti che sono difficili da adattare e i parametri di adattamento sono gravati da un errore importante. Inoltre, l'etichettatura non omogenea e gli aggregati di fluorescenza nelle cellule rendono le misurazioni svFCS estremamente difficili da interpretare. Infine, il trattamento con colesterolo ossidasi influisce sulla vitalità cellulare e l'analisi svFCS non deve superare un'ora dopo il trattamento. È anche meglio registrare le fluttuazioni di fluorescenza dalla membrana plasmatica superiore in quanto non è attaccata al supporto e non vi è alcun rischio di diffusione ostacolata delle molecole a causa delle interazioni fisiche con il supporto.
Ci sono stati abbastanza progressi nella tecnica svFCS per il suo uso in diversi approcci a causa della diversità delle modalità per regolare il volume di rilevamento, rendendo possibile studiare vari processi biologici nelle cellule viventi. Un'alternativa alla regolazione della dimensione del volume di eccitazione consiste nell'utilizzare un espansore a fascio variabile35. È anche possibile modulare semplicemente la dimensione dell'area di illuminazione registrando il segnale fluorescente dall'intercettazione della membrana plasmatica lungo la direzione z36. Questo può essere fatto su un microscopio confocale standard per il quale è stato sviluppato un quadro teorico per derivare la legge di diffusione37,38.
Sebbene il metodo svFCS offra una risoluzione spazio-temporale, necessaria per la caratterizzazione dell'organizzazione laterale disomogenea della membrana plasmatica, le modalità geometriche di confinamento non si escludono a vicenda. Una deviazione di t0 in una direzione o nell'altra rivela esclusivamente un modo dominante di confinamento25. Inoltre, un'altra importante limitazione dell'attuale metodo svFCS deriva dal classico limite di diffrazione ottica (~200 nm). Questo è indiscutibilmente maggiore dei domini che confinano le molecole all'interno della membrana plasmatica cellulare. Pertanto, l'analisi del confinamento è dedotta dal valore t0 , estrapolato dalla legge di diffusione.
Questo inconveniente è stato superato implementando metodi alternativi. Inizialmente, l'uso di pellicole metalliche perforate con nanoaperture offriva la possibilità di illuminare un'area di membrana molto piccola (cioè al di sotto del limite di diffrazione ottica di singole aperture nanometriche di raggi variabili tra 75 e 250 nm)39. È stato così riportato il regime di transizione previsto dalla legge teorica di diffusione per l'organizzazione di domini isolati, che ha permesso un affinamento della dimensione caratteristica delle eterogeneità nanometriche della membrana e una stima quantitativa della superficie occupata dai nanodomini lipido-dipendenti39. In alternativa, l'illuminazione nanometrica è stata sviluppata anche utilizzando la microscopia ottica a scansione a campo vicino40 o nanoantenne ottiche planari41. Più recentemente, la combinazione di esaurimento delle emissioni stimolate (STED) e FCS ha fornito uno strumento potente e sensibile per documentare la legge di diffusione con una risoluzione spaziale molto elevata. Questo STED-FCS dà accesso alle caratteristiche di diffusione molecolare su scala nanometrica che si verificano in un breve periodo di tempo, consentendo lo studio dell'organizzazione dinamica delle sonde lipidiche sulla membranaplasmatica 42,43. Tuttavia, la soppressione incompleta della fluorescenza nel processo STED sfida l'analisi delle curve di auto-correlazione in FCS.
È stato sviluppato un nuovo modello di fitting per superare questa difficoltà, migliorando l'accuratezza dei tempi di diffusione e le misure medie del numero di molecole44. Infine, per una lenta diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, il principio svFCS può essere applicato ai dati registrati mediante spettroscopia di correlazione delle immagini45. Recentemente, è stato dimostrato che la combinazione della microscopia a forza atomica (AFM) con l'imaging a riflessione interna totale-FCS (ITIR-FCS) contribuisce al perfezionamento della natura del meccanismo che ostacola la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, specialmente vicino alla configurazione della membrana di soglia di percolazione a causa di un'alta densità di nanodomini46.
In conclusione, stabilire la legge di diffusione mediante svFCS ha fornito le prove sperimentali per dedurre l'eterogeneità locale creata da lipidi collettivi dinamici e associazioni di proteine di membrana. Come affermato da Wohland e colleghi46, "l'analisi della legge di diffusione FCS rimane uno strumento prezioso per dedurre caratteristiche strutturali e organizzative al di sotto del limite di risoluzione dalle informazioni dinamiche". Tuttavia, abbiamo bisogno di sviluppare nuovi modelli per perfezionare l'interpretazione della legge di diffusione che dovrebbe consentire una migliore comprensione della dinamica degli eventi molecolari che si verificano sulla membrana plasmatica.

La complessità dell'organizzazione della membrana plasmatica L'attuale comprensione dell'organizzazione della membrana cellulare deve tenere conto di diversi aspetti1. In primo luogo, una composizione lipidica complessa varia non solo tra i tipi di cellule, ma anche all'interno di una singola cellula (organelli di membrana / membrana plasmatica). Inoltre, le proteine di membrana associate o intrinseche sono per lo più organizzate in complessi multimerici dinamici, con grandi domini che si estendono al di fuori della membrana, rappresentando un'area significativamente più ampia di quella dei soli domini transmembrana. Inoltre, le proteine associate alla membrana mostrano specifiche capacità di legame lipidico o di interazione lipidica che svolgono un ruolo nella regolazione della funzione proteica. Questi dipendono direttamente dalla composizione locale e dall'accessibilità dei lipidi2.
Infine, si osserva un livello significativo di asimmetria tra due foglietti di membrana a causa della struttura asimmetrica intrinseca delle proteine di membrana e della distribuzione dei lipidi. Infatti, un equilibrio metabolico lipidico tra sintesi e idrolisi, combinato con flip-flop lipidico tra i foglietti, genera tale distribuzione asimmetrica. Poiché qualsiasi trasporto attraverso il doppio strato è limitato dall'energia libera necessaria per spostare il gruppo di testa polare attraverso l'interno idrofobo delle membrane, di solito è assistito da trasportatori selettivi. Per ogni tipo di cellula, l'asimmetria tende ad essere mantenuta saldamente. Complessivamente, questi fattori contribuiscono alla disomogeneità laterale o alla compartimentazione della membranaplasmatica 3,4.
Arricchiamo questa rappresentazione della membrana plasmatica tenendo conto della diffusione molecolare intrinseca all'interno e attraverso il doppio strato, che contribuisce all'eterogeneità laterale dinamica su una scala da decimi a centinaia di nanometri e microsecondi a secondi. Ad esempio, i nanodomini di membrana lipidici-dipendenti – le cosiddette zattere lipidiche, definite come colesterolo, e le piattaforme di segnalazione ricche di sfingolipidi – contribuiscono alla compartimentazione della membranaplasmatica 5,6. Tuttavia, l'attuale visione dell'organizzazione della membrana non è limitata alle sole zattere lipidiche. I nanodomini di membrana sono più complessi ed eterogenei per composizione, origine e funzione. Tuttavia, la loro presenza sulla membrana plasmatica deve essere strettamente coordinata e le interazioni dinamiche tra proteine e lipidi sembrano essere importanti nella distribuzione spaziale e nella modifica chimica dei nanodomini di membrana 1,3,7,8.
Il principio svFCS e la sua applicazione per sondare l'organizzazione della membrana plasmatica Sebbene siano stati fatti molti progressi nell'analisi dei domini di membrana, principalmente attraverso tecniche biofisiche, i determinanti che dettano l'organizzazione locale della membrana plasmatica devono essere raffinati con un'appropriata risoluzione spaziale e temporale. I determinanti basati sul tracciamento di singole molecole forniscono un'eccellente precisione spaziale e consentono la caratterizzazione di diverse modalità di movimento 9,10,11,12, ma hanno una risoluzione temporale limitata con i classici frame rate bassi della telecamera e richiedono uno sforzo più sperimentale per registrare un numero significativo di traiettorie. In alternativa, il coefficiente di diffusione dei componenti della membrana può essere valutato mediante Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)13 o Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)14. Quest'ultimo ha ricevuto maggiore attenzione, principalmente a causa della sua elevata sensibilità e selettività, volume di rilevamento microscopico, bassa invasività e ampia gamma dinamica15.
La base concettuale di FCS è stata introdotta da Magde e colleghi circa 50 anni fa16,17. Si basa sulla registrazione della fluttuazione dell'emissione di fluorescenza con un'alta risoluzione temporale (da μs a s)18. Nella sua versione moderna, le misurazioni nelle cellule viventi sono eseguite da un piccolo volume di eccitazione confocale (~ 0,3 femtolitri) posizionato all'interno di una regione di interesse (ad esempio, alla membrana plasmatica); il segnale di fluorescenza generato dalla diffusione di molecole fluorescenti che entrano ed escono dal volume di osservazione viene raccolto con una risoluzione temporale molto elevata (cioè il tempo di arrivo di ciascun fotone sul rivelatore). Quindi, il segnale viene calcolato per generare la funzione di autocorrelazione (ACF), da cui viene estratto il tempo medio td (tempo di diffusione) per il quale una molecola rimane all'interno del volume focale, insieme al numero medio di particelle, (N), presenti nel volume di osservazione, che è inversamente proporzionale all'ampiezza dell'ACF. Quest'ultimo parametro potrebbe essere un'informazione utile sulla concentrazione della molecola all'interno del volume di osservazione.
Da allora, un numero crescente di modalità FCS è stato implementato grazie al rapido sviluppo della strumentazione in biofotonica, che consente la descrizione dei fenomeni dinamici che si verificano nei sistemi viventi. Tuttavia, una specie molecolare sperimenterebbe una distribuzione più sovrapposta dei valori del coefficiente di diffusione, che di solito si riflette in una caratteristica di diffusione anomala, in cui le molecole si diffondono con una relazione non lineare nel tempo19, e difficoltà nell'identificare il significato biologico di questa sottodiffusione anomala. In passato, questa difficoltà è stata in qualche modo superata registrando la diffusione molecolare da parte di FRAP da aree di varie dimensioni, piuttosto che da una sola area, fornendo così ulteriori informazioni spaziali. Ciò ha permesso, ad esempio, la concettualizzazione dei microdomini di membrana 20,21,22.
Una traduzione di questa strategia in misure FCS (cioè la cosiddetta spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS)) è stata stabilita variando la dimensione del volume focale di osservazione, consentendo di registrare la fluttuazione della fluorescenza su diverse scale spaziali23. Pertanto, l'approccio svFCS fornisce informazioni spaziali indirette che consentono l'identificazione e la determinazione delle modalità di diffusione molecolare e del tipo di partizionamento della membrana (domini isolati rispetto a domini contigui24) delle molecole studiate. Tracciando il tempo di diffusione td in funzione delle varie scale spaziali definite dal valore di vita (ω), che corrisponde alla dimensione del raggio del fascio di rilevazione in questo caso23,25, si può caratterizzare la legge di diffusione di una data molecola in una data condizione fisiologica. L'svFCS è, quindi, un perfetto analogo al tracciamento a singola particella nel dominio del tempo26. Sotto il vincolo di diffusione browniana, ci si dovrebbe aspettare una relazione strettamente lineare tra il tempo di diffusione td e la vita ω (Figura 1)23,25. L'origine della deviazione della legge di diffusione da questo schema può essere attribuita a ragioni non esclusive, come la rete citoscheletrica, l'affollamento molecolare, il partizionamento dinamico nei nanodomini o qualsiasi combinazione di questi e altri effetti (Figura 1), e deve essere testata sperimentalmente25.
Qui forniamo tutti i checkpoint di controllo necessari per l'uso quotidiano di un sistema ottico svFCS su misura costruito da zero, che integra le nostre precedenti revisioni del protocollo27,28 su quell'approccio sperimentale. Inoltre, come prova di concetto, forniamo linee guida riguardanti la calibrazione della configurazione, la preparazione delle cellule, l'acquisizione dei dati e l'analisi per l'istituzione della legge di diffusione svFCS (DL) per Thy1-GFP, una proteina ancorata al glicosilfosfatidilinositolo della membrana plasmatica, che è nota per essere localizzata nei nanodomini della zattera lipidica29. Infine, dimostriamo come la parziale destabilizzazione dei nanodomini lipidici da parte del trattamento con colesterolo ossidasi influisca sulle proprietà di diffusione di Thy1-GFP. Inoltre, una descrizione dettagliata della costruzione di una configurazione svFCS da zero è fornita in Materiale supplementare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aligment tool</td>
			<td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPW602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td>
			<td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BNC 50 &#937; plug to 50 &#937; plug lead 2 m</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>742-4315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &#937; With connector, 1.22 m, RoHS2</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>885-8172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tee 50&#937; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &#8594; 1GHz</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>546-4948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &#8211; French Extension Lead, 230 V</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>768-5500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>452-8394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>792-4079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filtering</td>
			<td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F47-539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&#176; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F43-088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F37-496</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware correlator</td>
			<td>80 MHz Digital Correlator</td>
			<td>Correlator.com</td>
			<td>Flex02-12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td>
			<td>Lasos</td>
			<td>BLD-XT 488100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety</td>
			<td>High-Performance Black Masking Tape, 1&#34; x 180&#39; (25 mm x 55 m) Roll</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T743-2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope 
			Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS 
			(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421767-9971-711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical path</td>
			<td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25 &#181;m mounted pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P25S I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH10M-488 (HWP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RSP1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100B/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adjustable Prism Clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LB1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID25/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Optic Holder, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Stackable Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount for 1&#34; optic-usable depth &#189;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount For 1&#34;Optic-usable Depth 2&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 600mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA600/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 75mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 150mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA150/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&#34;x 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#189; &#34; (12mm) Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Clamps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black Rubberized Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ball Driver kit/ 6 tools</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BD-KIT/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP6M4M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Mount for 25.4mm optic</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 FC/APC Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S120C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, 
			L=50 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR75/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>USB Power and Energy Meter Interface</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L750/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L350/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25W3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25A90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black posterboard 20&#34; x 30&#34; (508 mm x 762 mm), 1/16&#34; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M4 Cap Screw Kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL5-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&#216;0.8 - &#216;12 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1D12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#216;1&#34; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&#216;1 mm Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1-MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1HB10-15-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Optical Table support, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1TS05-12-06-AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample nano-positionning</td>
			<td>Precision XYZ Nanopositioning</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI P527-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V 
			Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI E727-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature chamber</td>
			<td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_MTC_2000_DUO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Two Vibration Free Heater Modules</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_150_VF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PT100 Temperature Sensor</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_P100_TS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture and transfection</td>
			<td>Cos7 cells</td>
			<td>ATCC&#174;</td>
			<td>CRL-1651&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>8- well Lab-Tek chambers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PolyJet Transfection Reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol content measurement</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87786</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ROTI Nanoquant Working Solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>svFCS measurements</td>
			<td>HBSS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hepes buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cholesterol oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8868</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83697-1G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

I processi biologici dinamici nelle cellule viventi, compresi quelli associati all'organizzazione della membrana plasmatica, si verificano su varie scale spaziali e temporali, che vanno rispettivamente dai nanometri ai micrometri e dai microsecondi ai minuti. Una gamma così ampia di processi biologici sfida gli approcci convenzionali alla microscopia. Qui, descriviamo in dettaglio la procedura per l'implementazione di misurazioni di spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) utilizzando un microscopio a fluorescenza classico che è stato personalizzato. Il protocollo include uno specifico controllo delle prestazioni del setup svFCS e le linee guida per le misure di diffusione molecolare da parte di svFCS sulla membrana plasmatica di cellule viventi in condizioni fisiologiche. Inoltre, forniamo una procedura per interrompere i nanodomini della zattera della membrana plasmatica mediante il trattamento della colesterolo ossidasi e dimostriamo come questi cambiamenti nell'organizzazione laterale della membrana plasmatica potrebbero essere rivelati dall'analisi svFCS. In conclusione, questo metodo basato sulla fluorescenza può fornire dettagli senza precedenti sull'organizzazione laterale della membrana plasmatica con l'appropriata risoluzione spaziale e temporale.

Abbiamo generato un DL per Thy1-GFP espresso in celle Cos-7 (Figura 4, quadrati neri). La legge di diffusione ha un valore t 0 positivo (19,47 ms ± 2 ms), indicando che Thy1-GFP è confinato in strutture nanodominio della membrana plasmatica. Il trattamento con colesterolo ossidasi delle cellule che esprimono Thy1-GFP ha comportato lo spostamento del valore DL t0 a 7,36 ± 1,34 ms (Figura 4, quadrati grigi). Questa osservazione conferma che la natura del confinamento Thy1-GFP dipende dal contenuto di colesterolo ed è associata a nanodomini di zattera lipidica. Queste due leggi di diffusione si sono dimostrate diverse secondo il test statistico sopra descritto (vedi punto 9.1.3) in termini di valori t0 e Deff. Inoltre, abbiamo valutato la concentrazione di colesterolo cellulare totale nelle cellule Cos-7 non trattate rispetto alle cellule trattate con COase. Una piccola, ma significativa, diminuzione del contenuto di colesterolo totale è osservata durante il trattamento con COase (Figura 5). Poiché questo enzima agisce solo sul pool di colesterolo accessibile al foglietto esterno della membrana plasmatica, assumiamo che la diminuzione osservata del colesterolo sia associata solo alla membrana plasmatica e si traduca nella destabilizzazione dei nanodomini della zattera lipidica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Figura 1: Leggi di diffusione della spettroscopia di correlazione di fluorescenza simulata (FCS) stabilite da FCS a variazione spot per diverse forme di organizzazione della membrana. (Pannelli superiori) Rappresentazione schematica dell'organizzazione della membrana - (A) diffusione libera, (B) barriere a rete e (C) confinamenti trappola / dominio - con la traiettoria disegnata per una singola molecola (rosso). I cerchi blu denotano l'intersezione della membrana e del raggio laser della vita ω. (Pannelli inferiori) Leggi di diffusione FCS rappresentate tracciando il tempo di diffusione td in funzione del raggio quadrato ω2. La proiezione della legge di diffusione (linea tratteggiata verde) intercetta l'asse temporale a (A) l'origine (t0 = 0) nel caso di diffusione libera; (B) in asse negativo (t0 < 0) quando ci sono barriere a maglie, o (C) in asse positivo (t0 > 0) quando ci sono trappole e domini (zattere lipidiche). D è il coefficiente di diffusione laterale per il moto browniano; Deff, il coefficiente di diffusione effettivo; Dmicro, il coefficiente di diffusione microscopico all'interno delle trappole a maglie; Din, il coefficiente di diffusione all'interno dei domini; Dout, il coefficiente di diffusione al di fuori dei domini; L, la dimensione del lato di un dominio quadrato; e rD, il raggio di un dominio circolare. Questa figura è stata modificata da He e Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Figura 2: Visualizzazione schematica del controllo hardware svFCS. Il computer controlla tutti i dispositivi attraverso diversi protocolli di comunicazione: seriale (microscopio, otturatore esterno), USB (stadio piezoelettrico XYZ, correlatore) e PCI (scheda di acquisizione). DAQ: scheda di acquisizione dati, APD: fotodiodo a valanga, SPCM: modulo di conteggio a singolo fotone, DO: uscita digitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Figura 3: Vista schematica dei percorsi ottici di eccitazione ed emissione della configurazione svFCS. La configurazione svFCS contiene quattro moduli: (1) l'uscita di un laser a fibra da 488 nm è collimata, (2) una combinazione di una piastra a mezza onda e di uno splitter a fascio polarizzante imposta la potenza ottica, (3) il raggio laser focalizzato sul campione dopo aver viaggiato attraverso un microscopio motorizzato privo di lenti tubolari e (4) la fluorescenza viene rilevata attraverso un percorso di rilevamento simile a quello confocale su un fotodiodo a valanga accoppiato a un singolo modulo di conteggio dei fotoni, che fornisce un segnale a un correlatore hardware. La semplicità conferisce al sistema sensibilità, robustezza e facilità d'uso (ampiamente commentata nel materiale supplementare). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Figura 4: Le leggi di diffusione svFCS generate dall'analisi di diffusione di Thy1-GFP espresse in Cos-7. leggi di diffusione svFCS delle cellule Cos-7 senza trattamento (NT, quadrati neri) e dopo trattamento con colesterolo ossidasi (COasi, cerchi grigi). L'inserto nel grafico rappresenta la verifica statistica di una differenza significativa tra le due leggi di diffusione svFCS presentate (secondo Mailfert et al.28). Il valore di prova (T) deve essere superiore alla soglia impostata a 3,8 quando entrambe le leggi di diffusione sono diverse. Più è alto, maggiore è la differenza tra le leggi di diffusione. Il valore di T è codificato a colori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Figura 5: Confronto del contenuto di colesterolo totale nelle cellule Cos-7. Le cellule Cos-7 sono state non trattate (NT) o trattate con 1 U / mL di colesterolo ossidasi (COasi) per 1 ora. I dati rappresentano un esempio di un esperimento in triplice copia. Un t-test a due code e spaiato è stato utilizzato per valutare la differenza statistica (α = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella dei materiali: Elenco degli elementi ottici necessari per la configurazione svFCS.
Materiale supplementare: Questo documento descrive la creazione di una configurazione svFCS da zero. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Questo articolo si propone di presentare un protocollo su come costruire un microscopio per spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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