Name: spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells at JoVE.com

SB, SM og DM ble støttet av institusjonell finansiering fra CNRS, Inserm og Aix-Marseille Universitet og programtilskudd fra det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-17-CE15-0032-01 og ANR-18-CE15-0021-02) og den franske "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW anerkjenner "BioTechNan", et program for tverrfaglige miljø doktorgradsstudier KNOW innen bioteknologi og nanoteknologi. EB anerkjenner den økonomiske støtten fra National Science Centre of Poland (NCN) under prosjekt nr. 2016/21/D/NZ1/00285, samt den franske regjeringen og Frankrikes ambassade i Polen. MŁ anerkjenner den økonomiske støtten fra det polske utviklingsdepartementet (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) og Nasjonalt senter for forskning og utvikling (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT anerkjenner økonomisk støtte fra National Science Center of Poland (NCN) under prosjekt nr. 2016/21/B/NZ3/00343 og fra Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).

1. Innstillingsspesifikasjon for montering av et skreddersydd svFCS-oppsett
MERK: Enkelheten i det foreslåtte svFCS-oppsettet muliggjør enkel installasjon, drift og vedlikehold til en lav kostnad, samtidig som effektiviteten i fotongjenoppretting sikres. Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se Tilleggsmateriale.
<ol><li>Eksperimentelt rom og sikkerhet<ol>
<li>Installer systemet i et rom stabilisert ved rundt 21 °C.</li>
		<li>Unngå direkte luftstrøm på det passive (eller aktive) optiske bordet og følg lasersikkerhetsreglene for optisk justering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maskinvare og programvare MERK: Supplerende materiale beskriver installasjonstrinnene som er avbildet i figur 2.<ol>
<li>Skriv hovedprogramvaren for anskaffelse og kontroll i LabVIEW ved hjelp av en statlig maskin- og hendelsesstrukturarkitektur der et multifunksjonsinnkjøpskort driver de fleste kontrollerne. MERK: Korrelatoren, laseren og strømmåleren styres eller overvåkes av sin egen programvare.</li>
		<li>Tilpass maskinvare- og programvareinstallasjonsprosedyrene i henhold til maskinvaren som brukes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optisk oppsett MERK: Figur 3 illustrerer de optiske benkmodulene som brukes i de følgende avsnittene for å kontrollere kvaliteten på de optiske justeringene. Alle spesifikasjonene for optiske elementer er oppført i Materialtabellen. Prosedyren for å bygge oppsettet er mye detaljert i tilleggsmateriale. Dette systemet består av en kontinuerlig bølgelaser, et motorisert invertert mikroskop utstyrt med et nedsenkningsvannmål, en skredfotodiodedetektor koblet til en enkelt fotontellingsmodul og en maskinvarekorrelator. Et mikroskopinkubasjonskammer med vibrasjonsfrie varmeovner er spesialdesignet for å kontrollere temperaturen for eksperimenter på levende celler. Ved konvensjon tilsvarer XY-aksen den optiske banens vinkelrette plan, og Z-aksen tilsvarer den optiske banen.</li>
</ol>2. Daglig sjekkpunkt før eksperimentet kjøres
<ol><li>Kontroller eksitasjonsbanen (figur 3, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ03v2.jpg"> & <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ04v2.jpg">).<ol>
<li>Åpne alle irismembranene.</li>
		<li>Mål lasereffekten med strømmåleren, og hold den første irisen helt åpen.</li>
		<li>Vri halvbølgeplaten (HWP) for å finne maksimal effekt.</li>
		<li>Kontroller justeringen ved hjelp av irisene hvis lasereffekten er lavere enn vanlig, og flytt L1 og M1 vekselvis, om nødvendig.</li>
		<li>Legg merke til effektverdien i eksperimentets notatbok.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontroller deteksjonsbanen (figur 3, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ05v2.jpg"> & <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ06v2.jpg">).<ol>
<li>Plasser vannet, en dekslipp og en dråpe av en 2 nM rhodamin 6G (Rh6G) løsning på målet.</li>
		<li>Hvis fluorescenssignalet (tellenummer på APD, registrert med LabVIEW-programvaren) er lavere enn vanlig, må du lage Rh6G-løsningen på nytt, kontrollere plasseringen og dekslenes nummer på objektivlinsen, eller eliminere eventuelle bobler.<ol>
<li>Hvis fluorescenssignalet fortsatt er lavere enn vanlig, plasserer du strømmåleren inne i den optiske banen for å blokkere strålen.</li>
			<li>Slå av APD (heretter refererer APD til APD og enkeltfotontellingsmodulen).</li>
			<li>Fjern prøven.</li>
			<li>Rengjør og erstatt objektivlinsen med et reflekterende mål.</li>
			<li>Kontroller laserstrålen på det reflekterende målet ved å fjerne strømmåleren fra lysbanen. Forsikre deg om at målets stråle er sentrert, og at bakrefleksjonen når den første irisen på linjen <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ04v2.jpg"> (figur 3).</li>
			<li>Hvis ikke, juster senterposisjoneringen med M2 eller bakrefleksjonen med dikroisk speil.</li>
			<li>Hvis mikroskopkoblingen er riktig, skyver du objektivlinsen tilbake, legger til en dråpe vann, en deksler og en dråpe av en mer konsentrert Rh6G-løsning (dvs. 200 nM), og stiller inn en lavere lasereffekt enn for de klassiske målingene (få μW).</li>
			<li>Slå på APD og optimaliser APD- og pinholejustering vekselvis med sine respektive XYZ-justeringsskruer mens du overvåker intensitetssignalet (LabVIEW-programvare).</li>
			<li>Bytt deksler og legg til en lavere konsentrasjon av Rh6G (2 nM). Flytt pinhullet langs Z-aksen for å finne en posisjon der det molekylære lysstyrkeforholdet øker, og midjen er minimum.</li>
			<li>Lukk iris til signalet faller ned: laserstrålestørrelsen når den bakre blenderåpningsstørrelsen på målet (dvs. den minimale midjestørrelsen, se Tilleggsmateriale).</li>
			<li>Start korrelatorprogramvaren og registrer data (se avsnitt 7 for dataregistrering).</li>
			<li>Kontroller ACF, som skal vise en lav mengde støy, gi en liten midjestørrelse og en høy antallshastighet per molekyl per sekund (se avsnitt 7 for dataanalyse og evaluering av midjestørrelse).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generelle betraktninger for svFCS-dataregistrering og analyse
<ol><li>Registrer og analyser fluorescensdataene etter dette generelle skjemaet (se avsnitt 7, 8 og 9): (1) fluorescensopptak og ACF-generering (korrelatorprogramvare), (2) uventet kassering av data, et gjennomsnitt av beholdte data, passende med riktig modell (med hjemmelaget Igor Pro-programvare), (3) diffusjonslovplott (hjemmelaget MATLAB-programvare 1) og (4) valgfri diffusjonslovsammenligning (hjemmelaget MATLAB-programvare 2). De forskjellige programmene er tilgjengelige på forespørsel. MERK: Maskinvarekorrelatoren har en minste samplingstid på 12,5 ns (dvs. en samplingsfrekvens på 80 MHz). Det gir en tidsmessig oppløsning som er minst 1000 lavere enn den typiske beboertiden for fritt diffundering av små molekyler i oppløsning og 106 mindre enn diffusjonstiden for membranproteiner innenfor et konfokalt observasjonsvolum.</li>
</ol>4. Cellekultur og transfeksjon
<ol><li>Frø Cos7-cellene i 8-brønns kamret dekselglass med # 1.0 borosilikatglassbunn med en tetthet på 10.000 celler / brønn ved bruk av komplett Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 5% føtalt storfeserum, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 U / ml) og L-glutamin (1 mM).</li>
	<li>Dyrk cellene ved 37 °C i en fuktig atmosfære som inneholder 5 % CO2 i 24 timer.</li>
	<li>Fjern mediet, tilsett 300 μL av det ferske komplette kulturmediet per brønn, og preinkuber cellene i 30 minutter ved 37 °C.</li>
	<li>Fortynn 0,5 μg av plasmid-DNA som koder for Thy-1-protein smeltet sammen med eGFP25 i 50 μL serumfritt DMEM. Vortex kort å blande.</li>
	<li>Fortynn 1,5 μL av DNA-transfeksjonsreagenset i 50 μL serumfri DMEM, og bland oppløsningen godt.</li>
	<li>Tilsett det fortynnede transfeksjonsreagenset direkte i den fremstilte DNA-løsningen, og bland forbindelsene umiddelbart.</li>
	<li>Inkuber den tilberedte blandingen i 10 til 15 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Tilsett 10 μL av de kombinerte DNA / transfeksjonsreagenskompleksene dråpevis på mediet i hver brønn, og homogeniser ved forsiktig å virvle platen.</li>
	<li>Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 timer.</li>
	<li>Etter inkubasjonen erstatter du mediet som inneholder DNA / transfeksjonsreagenskomplekser med 400 μL fersk komplett DMEM, og dyrker cellene i 16 timer før svFCS-eksperimentet.</li>
</ol>5. Fremstilling av celler for svFCS-målinger
<ol><li>Fjern kulturmediet.</li>
	<li>Vask cellene forsiktig to til tre ganger med serumfri Hanks balanserte saltløsning (HBSS) buffer som inneholder Ca2+ og Mg2+ supplert med 10 mM (4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinetanesulfonsyre) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES).</li>
	<li>Oppretthold cellene i HBSS/HEPES-buffer under alle svFCS-oppkjøp.</li>
</ol>6. Farmakologisk behandling
<ol><li>Fjern kulturmediet, og vask cellene to til tre ganger med serumfri HBSS supplert med 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS / HEPES).</li>
	<li>Inkuber cellene med 1 U/ml kolesteroloksidase (COase) oppløsning i HBSS/HEPES buffer i 1 time ved 37 °C.</li>
	<li>Fjern oppløsningen, og hold cellene i nærvær av 0,1 U / ml COase i HBSS / HEPES-buffer mens du utfører svFCS-målingene.</li>
</ol>7. Kalibrering av punktstørrelse
<ol><li>Forvar mikroskopkammeret ved 37 °C.</li>
	<li>Forbered en standard 2 nM-løsning av Rh6G ved seriell fortynning.</li>
	<li>Dropp 200 μL 2 nM Rh6G-løsning på et glassdeksel plassert på vann-nedsenkingsmålet.</li>
	<li>Start all maskinvare og programvare.</li>
	<li>Mål og juster 488 nm laserstråleeffekten til 300 μW. Avhengig av lysstyrken og fotostabiliteten til fluorescerende sonden som brukes, må du tilpasse denne kraften i henhold til (1) fluorescensintensiteten (på LabVIEW-programvaren), som skal være stabil, (2) ACF-formen (på korrelatorprogramvaren), som skal ha en konstant form over tid, og (3) tilpasningsparametrene som gir en liten midjestørrelse og en høy tellehastighet per molekyl (fotoner per molekyl per sekund, vanligvis få titalls til hundrevis av fotoner per molekyl per sekund). MERK: Amplituden til ACF (kalt G (0)) er omvendt proporsjonal med antallet av molekylet (dvs. konsentrasjonen av fluorescerende sonde). For midjestørrelseskalibrering er dette en kandidatparameter for god kvalitetskontroll. Derfor bør G(0) være lik for samme konsentrasjon fra dag til dag, da den knytter midjestørrelsen og konsentrasjonen. For cellemålinger, da FCS er mer nøyaktig for lav konsentrasjon, bør G (0) være høy for riktig parametertilpasningsekstraksjon.</li>
	<li>Still inn svFCS-belysnings- / deteksjonsmikroskopporten med LabVIEW-programvaren.</li>
	<li>Slå på APD.</li>
	<li>Lukk iris til signalet faller ned for å oppnå minimal midjestørrelse, eller lukk den for større midjestørrelse.</li>
	<li>Registrer flere ACFer av valgt varighet (nemlig en kjøring) for å forbedre statistisk reproduserbarhet, vanligvis 10 løp som varer i 20 s hver med korrelatorprogramvaren.</li>
	<li>Slå av APD.</li>
	<li>Bruk Igor Pro-programvaren til å sjekke og forkaste løpene med sterke svingninger på grunn av molekylære aggregater. Utfør dette trinnet manuelt – det skal være brukeruavhengig etter at brukerne har fått opplæring.</li>
	<li>Tilpass gjennomsnittet av de beholdte ACF-ene med en 3D-diffusjonsmodell.</li>
	<li>Trekk ut fra tilpasningsparametrene gjennomsnittlig diffusjonstid <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ02.jpg"> og lagre den i en ".txt" -fil (filformatet er diktert av Igor Pro-programvaren).</li>
	<li>Kontroller tellehastigheten per molekyl per sekund (en god ytelsesindikator) ved å dele gjennomsnittsintensiteten (ekstrahert fra fluorescenssporet) med antall molekyler (ekstrahert fra ACF). MERK: Sørg for at denne verdien er høy og stabil fra dag til dag for de samme anskaffelsesparametrene.</li>
	<li>Å vite diffusjonskoeffisienten til Rh6G i vandig løsning ved 37 ° C (D) og <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ02.jpg"> (se 7.13), beregne den eksperimentelle midjestørrelsen ω i henhold til: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ01.jpg">.</li>
	<li>Bruk prosedyren for hver midjestørrelsesmodifisering som kreves for å plotte FCS-diffusjonsloven og før noen ny eksperimentell serie svFCS-datainnsamling.</li>
</ol>8. svFCS datainnsamling på celler
<ol><li>Mål og juster stråleeffekten på 488 nm mellom 2 og 4 μW. Avhengig av lysstyrken og fotostabiliteten til den fluorescerende sonden som brukes, må du tilpasse denne kraften for å tillate en høy antall per molekyl (vanligvis flere tusen fotoner per molekyl per sekund), samtidig som fotoblekingen holdes lav (dvs. et stabilt intensitetsspor på LabVIEW-programvaren).</li>
	<li>Utjevne prøvene i 10 minutter ved 37 °C før målingene startes.</li>
	<li>Still inn epifluorescensbelysningsmikroskopet med LabVIEW-programvaren.</li>
	<li>Velg en celle med en passende fluorescerende sondeplassering og (lav) fluorescenssignalintensitet. MERK: Jo lavere fluorescensen er, desto bedre er FCS-målingene (se trinn 8.1).</li>
	<li>Still inn svFCS-belysnings- / deteksjonsmikroskopporten med LabVIEW-programvaren.</li>
	<li>Slå på APD.</li>
	<li>Utfør en xy-skanning av den valgte cellen med LabVIEW-programvaren.</li>
	<li>Utfør en z-skanning og finn konfokalpunktet ved maksimal fluorescensintensitet ved å velge plasmamembranen øverst og start datainnsamlingen. For å maksimere separasjonen mellom de to membranene, utfør fortrinnsvis skanningen i cellens kjerneområde.</li>
	<li>Ta opp en serie på 20 løp som varer i 5 s, hver med korrelatorprogramvaren. MERK: Forsikre deg om at varigheten av hver kjøring er lang nok til å få ACFer med redusert støy. Lange anskaffelser er utsatt for fotobleking eller uventede store variasjoner (f.eks. aggregater). Tilpass antall kjøringer, varighet og antall serier til utvalgene, men sørg for at de forblir konstante i samme mengde eksperimenter for reproduserbarhet.</li>
	<li>Slå av APD.</li>
	<li>Kast uventede kjøringer med Igor Pro-programvaren.</li>
	<li>Monter gjennomsnittlig ACF med en 2-arters 2D-diffusjonsmodell. Tilpass denne modellen til typen diffusjonsoppførsel til målmolekylet.</li>
	<li>Lagre tilpasningsparametrene i forrige fil (se trinn 7.13).</li>
	<li>Utfør 10 til 15 serier med opptak på minst 10 forskjellige celler, og gjengi trinn 8.3 til 8.13. Kontroller at enkeltfilen som er innhentet, inneholder midjestørrelsesinformasjon og tilpasningsparametere for de 10–15 opptakene.</li>
	<li>For å etablere en enkelt diffusjonslov, analyser minst fire midjestørrelser som varierer mellom 200 og 400 nm. Dette området er definert av den diffraksjonsoptiske grensen, men er objektiv- (numerisk blenderåpning) og laser (bølgelengde) avhengig. MERK: Siden midjestørrelseskalibreringen ikke er absolutt og har en viss grad av usikkerhet, ble en dedikert MATLAB-programvare28 som tar hensyn til x- og y-feilen (nemlig ω2 og td) bygget for å passe til diffusjonsloven.</li>
	<li>Start MATLAB-programvaren 1 og velg en mappe som inneholder alle ".txt" -filene som tilsvarer minst fire midjestørrelseseksperimenter.</li>
	<li>Plot <td> versus <ω2>, nemlig diffusjonsloven. To hovedparametere kan ekstraheres: y-akseavskjæringen (t0) og den effektive diffusjonskoeffisienten (Deff, omvendt proporsjonal med skråningen).</li>
</ol>9. Diffusjonslover for sammenligning av forskjellige eksperimentelle tilstander
MERK: Reproduser om nødvendig avsnitt 7 og 8 for forskjellige eksperimentelle forhold. En dedikert programvare (MATLAB-programvare 2) ble utviklet for å avgjøre om disse diffusjonslovene er like eller ikke i henhold til t0 - og Deff-verdiene 28. Den tester to hypoteser: de to verdiene er forskjellige, eller de to verdiene er ikke forskjellige ved en terskel satt over en sannsynlighet for falsk alarm (PFA). En vilkårlig PFA-verdi på 5 % (T = 3,8) regnes som den øvre signifikansgrensen mellom to parametere (t0 eller Deff), noe som indikerer at det bare er 5 % sjanse for at de to verdiene er identiske.
<ol><li>Opprett en ".xls"-fil som inneholder de karakteristiske diffusjonslovverdiene for hver betingelse for å sammenligne (dvs. en fil som inneholder t0, t0-feilen , Deff - og Deff-feilen for de ikke-behandlede (NT) og behandlede (COase) forholdene som en tabell).<ol>
<li>Start MATLAB-programvaren 2.</li>
		<li>Velg filen ".xls".</li>
		<li>Analyser det genererte fargekodede 2D-plottet, der de statistiske testene t0 og Deff skal plottes på henholdsvis x- og y-aksene (figur 4). Jo høyere T er, desto større er forskjellen mellom de sammenlignede verdiene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Kolesterol konsentrasjon målinger
<ol><li>Cellebehandling og lysis<ol>
<li>Frø Cos7-cellene i tredobles i 6-brønns plater ved 4 × 105 celler / brønn og inkuberer i 2 ml komplett DMEM ved 37 ° C med 5% CO2 over natten for å la cellene feste seg til platen.</li>
		<li>Fjern kulturmediet og vask cellene tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS).</li>
		<li>Tilsett 1 ml HBSS/HEPES-buffer som inneholder (eller ikke, for kontroller) 1 U/ml Coase, og inkuber i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2.</li>
		<li>Erstatt mediet med 1 ml HBSS/HEPES inneholdende 0,1 U/ml Coase, og inkuber i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2.</li>
		<li>Fjern løsningen og høst cellene.</li>
		<li>Vask cellene tre ganger med PBS, og sentrifuger ved 400 × g i 5 minutter ved romtemperatur.</li>
		<li>Lyse cellene med radioimmunoprecipitation assay buffer (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM etylendiamin tetraeddiksyre, 2% glyserol, protease og fosfatasehemmer cocktail) i 30 min på is.</li>
		<li>Sentrifuger lysatene ved 10000 × g i 10 min ved 4 °C og samle supernatanten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kvantifiser total proteinkonsentrasjon for hver prøve ved å modifisere Bradfords proteinanalyse ved hjelp av arbeidsløsningen i henhold til produsentens anbefalinger.</li>
	<li>Måling av kolesterolkonsentrasjon<ol>
<li>For å bestemme totalt cellulært kolesterolnivå enzymatisk, bruk riktig sett (f.eks. Amplex Red Cholesterol Assay Kit) i henhold til produsentens anbefalinger.</li>
		<li>For hver reaksjon blandes prøven som inneholder 5 μg protein med Amplex Red-reagens/pepperrotperoksidase/kolesteroloksidase/kolesterolesterase-arbeidsløsning, og ruger i 30 minutter ved 37 °C i mørket.</li>
		<li>Mål fluorescensen ved hjelp av eksitasjon på 520 nm, og detekter utslippet ved 560–590 nm ved hjelp av en mikroplateleser.</li>
		<li>Trekk bakgrunnen fra den endelige verdien, og bestem kolesterolkonsentrasjonen ved hjelp av en standardkurve.</li>
		<li>Beregn det endelige kolesterolinnholdet i ng kolesterol per μg protein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Her har vi beskrevet implementeringen av svFCS-modulen på et standard fluorescerende mikroskop, en kraftig eksperimentell tilnærming for å dechiffrere dynamikken i plasmamembranorganisasjonen i levende celler takket være FCS diffusjonslovanalyse. Konseptuelt er svFCS basert på et enkelt prinsipp: korrelasjonsmålinger av fluorescens i tidsdomenet mens du varierer størrelsen på belysningsområdet23. Denne strategien har vært medvirkende til å utlede nanoskopisk informasjon fra mikroskopiske målinger, noe som bidrar til å dechiffrere de viktigste fysisk-kjemiske elementene som bidrar til plasmamembranorganisasjonen i steady state25 og fysiologiske prosesser 30,31,32,33. Til sammen demonstrerer disse svFCS-analysene utvetydig eksistensen av lipidavhengige nanodomener i forskjellige celletyper og deres direkte implikasjoner ved innstilling av forskjellige signalhendelser.
Innenfor dette rammeverket er det noen optiske aspekter som må vurderes mens du bygger svFCS-oppsettet for å optimalisere fotonbudsjettet og minimere optiske avvik. Derfor anbefaler vi å bruke et mikroskop som rørlinsen kan fjernes fra når svFCS-målingen utføres. Videre spiller en enkelt iris en nøkkelrolle i svFCS-oppsettet: den endrer strålestørrelsen ved baksiden av målet, og varierer dermed direkte den effektive midjestørrelsen (dvs. det effektive eksitasjonsvolumet). Strålediameteren skal passe til den objektive bakre eleven for å oppnå den minste midjestørrelsen34. Dette alternativet, som hjelper til med å justere midjestørrelsen, sikrer optimalisering av fotonbudsjettet og er enkelt å implementere. Til slutt brukes et minimalt antall optiske deler langs lysbanen; jo mindre komplekst systemet er, jo færre fotoner går tapt. Alle disse alternativene forbedrer robustheten til svFCS-eksperimenter betydelig.
Når det gjelder selve protokollen, må noen få kritiske trinn vurderes. Det viktigste er en hensiktsmessig justering av de optiske banene som er avgjørende for vellykkede svFCS-målinger (protokoll, avsnitt 2). Dette er enkelt å kontrollere ved å analysere fluorescenssignalet fra en 2 nM Rh6G-løsning, som skal være ~200 kHz under 300 μW laserbelysning. Alle iriser skal åpnes, og ACFene skal ha en viktig amplitude (typisk G0 ~ 1,5-2,0). Et annet kritisk punkt gjelder cellene og deres forberedelse til svFCS-analyse (protokoll, seksjon 4–8). Dens tetthet må tilpasses slik at isolerte celler som skal observeres, er tilgjengelige for analyse. Ikke-klebende celler må immobiliseres på et kammerglass ved bruk av poly-L-lysinløsning. Fluorescenssignalet fra cellemerking bør ikke være for sterkt, eller det vil resultere i svært flate ACFer som er vanskelige å passe, og passformparametrene er belastet med en viktig feil. I tillegg gjør ikke-homogen merking og fluorescensaggregater i celler svFCS-målingene ekstremt vanskelige å tolke. Endelig påvirker kolesteroloksidasebehandling cellens levedyktighet, og svFCS-analysen bør ikke overstige en time etter behandlingen. Det er også bedre å registrere fluorescensfluktuasjonene fra den øvre plasmamembranen, da den ikke er festet til støtten, og det er ingen risiko for hindret diffusjon av molekyler på grunn av de fysiske interaksjonene med støtten.
Det har vært nok fremskritt i svFCS-teknikken for bruk i forskjellige tilnærminger på grunn av mangfoldet av modaliteter for å justere deteksjonsvolumet, noe som gjør det mulig å studere ulike biologiske prosesser i levende celler. Et alternativ til å justere størrelsen på eksitasjonsvolumet er å bruke en variabel stråleutvidelse35. Det er også mulig å ganske enkelt modulere størrelsen på belysningsområdet ved å registrere det fluorescerende signalet fra avskjæringen av plasmamembranen langs z-retning36. Dette kan gjøres på et standard konfokalt mikroskop som det er utviklet et teoretisk rammeverk for for å utlede diffusjonsloven37,38.
Selv om svFCS-metoden tilbyr spatio-temporal oppløsning, som er nødvendig for karakterisering av den inhomogene laterale organisasjonen av plasmamembranen, er de geometriske modusene for inneslutning ikke gjensidig utelukkende. Et avvik på t0 i den ene eller den andre retningen avslører utelukkende en dominerende modus for innesperring25. Videre er en annen viktig begrensning av den nåværende svFCS-metoden et resultat av den klassiske optiske diffraksjonsgrensen (~ 200 nm). Dette er utvilsomt større enn domenene som begrenser molekylene i celleplasmamembranen. Derfor er analysen av inneslutningen avledet fra t0-verdien , ekstrapolert fra diffusjonsloven.
Denne ulempen har blitt overvunnet ved å implementere alternative metoder. I utgangspunktet ga bruk av metallfilmer boret med nanoapertures muligheten til å belyse et svært lite membranområde (dvs. under den optiske diffraksjonsgrensen for enkelt nanometriske åpninger av radier som varierer mellom 75 og 250 nm) 39. Overgangsregimet spådd fra den teoretiske diffusjonsloven for isolert domeneorganisasjon ble dermed rapportert, og det tillot en forfining av den karakteristiske størrelsen på de nanometriske membran heterogenitetene og et kvantitativt estimat av overflatearealet okkupert av lipidavhengige nanodomener39. Alternativt har nanometrisk belysning også blitt utviklet ved hjelp av nærfeltsskanning optisk mikroskopi40 eller plan optisk nanoantennas41. Mer nylig har kombinasjonen av STIMULERT utslippsutarming (STED) og FCS gitt et kraftig og følsomt verktøy for å dokumentere diffusjonsloven med svært høy romlig oppløsning. Denne STED-FCS gir tilgang til molekylære diffusjonsegenskaper på nanoskala som forekommer innen kort tid, noe som gjør det mulig å studere den dynamiske organisasjonen av lipidprober ved plasmamembranen42,43. Den ufullstendige undertrykkelsen av fluorescens i STED-prosessen utfordrer imidlertid analysen av autokorrelasjonskurvene i FCS.
En ny tilpasningsmodell er utviklet for å overvinne denne vanskeligheten, og forbedre nøyaktigheten av diffusjonstidene og gjennomsnittlige molekyltallmålinger44. Til slutt, for langsom molekylær diffusjon ved plasmamembranen, kan svFCS-prinsippet brukes på data registrert ved bildekorrelasjonsspektroskopi45. Nylig har det blitt vist at kombinasjon av atomkraftmikroskopi (AFM) med avbildning av total intern refleksjon-FCS (ITIR-FCS) bidrar til forfining av mekanismens natur som hindrer molekylær diffusjon ved plasmamembranen, spesielt nær perkolasjonsterskelmembrankonfigurasjonen på grunn av en høy tetthet av nanodomener46.
Avslutningsvis har etablering av diffusjonslov av svFCS gitt eksperimentelle bevis for å utlede lokal heterogenitet skapt av dynamiske kollektive lipider og membranproteiners foreninger. Som det fremgår av Wohland og medarbeidere46, "FCS diffusjonslovanalyse er fortsatt et verdifullt verktøy for å utlede strukturelle og organisatoriske trekk under oppløsningsgrensen fra dynamisk informasjon". Likevel må vi utvikle nye modeller for å avgrense tolkningen av diffusjonsloven som skal muliggjøre en bedre forståelse av dynamikken til de molekylære hendelsene som forekommer ved plasmamembranen.

Kompleksiteten av plasmamembranorganisasjon Den nåværende forståelsen av cellemembranorganisasjon må ta hensyn til flere aspekter1. For det første varierer en kompleks lipidsammensetning ikke bare mellom celletyper, men også innenfor en enkelt celle (membranorganeller / plasmamembran). Dessuten er assosierte eller inneboende membranproteiner for det meste organisert i dynamiske multimere komplekser, med store domener som strekker seg utenfor membranen, og står for et betydelig større område enn transmembrandomenene alene. Videre utviser membranassosierte proteiner spesifikke lipidbindende eller lipidinteraksjonerende kapasiteter som spiller roller i regulering av proteinfunksjon. Disse avhenger direkte av den lokale sammensetningen og tilgjengeligheten av lipidene2.
Endelig observeres et signifikant nivå av asymmetri mellom to membranbrosjyrer på grunn av den indre asymmetriske strukturen av membranproteiner og fordelingen av lipider. Faktisk genererer en lipidmetabolismebalanse mellom syntese og hydrolyse, kombinert med lipid flip-flop mellom brosjyrene, en slik asymmetrisk fordeling. Ettersom enhver transport over dobbeltlaget er begrenset av den frie energien som kreves for å flytte den polare hodegruppen gjennom det hydrofobe indre av membranene, blir det vanligvis assistert av selektive transportører. For hver celletype har asymmetri en tendens til å bli godt vedlikeholdt. Til sammen bidrar disse faktorene til lateral inhomogenitet eller compartmentalization av plasmamembranen 3,4.
Vi beriker denne representasjonen av plasmamembranen ved å ta hensyn til den iboende molekylære diffusjonen i og over dobbeltlaget, noe som bidrar til den dynamiske laterale heterogeniteten på en skala fra tiendedeler til hundrevis av nanometer og mikrosekunder til sekunder. For eksempel bidrar lipidavhengige membrannanodomener - de såkalte lipidflåtene, definert som kolesterol og sfingolipidrike signalplattformer - til compartmentalization av plasmamembranen 5,6. Det nåværende synet på membranorganisering er imidlertid ikke begrenset til lipidflåter alene. Membran nanodomener er mer komplekse og heterogene i sammensetning, opprinnelse og funksjon. Likevel må deres tilstedeværelse ved plasmamembranen koordineres tett, og dynamiske interaksjoner mellom proteiner og lipider synes å være viktige i den romlige fordelingen og kjemisk modifikasjon av membran nanodomener 1,3,7,8.
SvFCS-prinsippet og dets anvendelse for å undersøke organisasjonen av plasmamembranen Selv om det er gjort store fremskritt i analysen av membrandomener, hovedsakelig gjennom biofysiske teknikker, må determinantene som dikterer den lokale organisasjonen av plasmamembranen raffineres med passende romlig og tidsmessig oppløsning. Determinanter basert på sporing av individuelle molekyler gir utmerket romlig presisjon og tillater karakterisering av forskjellige bevegelsesmåter 9,10,11,12, men har en begrenset tidsmessig oppløsning med klassiske lave kamerabildefrekvenser og krever mer eksperimentell innsats for å registrere et betydelig antall baner. Alternativt kan diffusjonskoeffisienten til membrankomponenter evalueres ved fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP)13 eller fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS)14. Sistnevnte har fått mer oppmerksomhet, hovedsakelig på grunn av sin høye følsomhet og selektivitet, mikroskopisk deteksjonsvolum, lav invasivitet og bredt dynamisk område15.
Det konseptuelle grunnlaget for FCS ble introdusert av Magde og kolleger for rundt 50 år sidenfor 16,17. Den er basert på registrering av svingninger i fluorescensutslipp med høy tidsmessig oppløsning (fra μs til s)18. I sin moderne versjon utføres målinger i levende celler av et lite konfokalt eksitasjonsvolum (~ 0,3 femtoliters) plassert innenfor et område av interesse (f.eks. Ved plasmamembranen); fluorescenssignalet som genereres ved å diffundere fluorescerende molekyler som går inn og ut av observasjonsvolumet, samles med svært høy tidsmessig oppløsning (dvs. ankomsttidspunktet for hvert foton på detektoren). Deretter beregnes signalet for å generere autokorrelasjonsfunksjonen (ACF), hvorfra gjennomsnittstiden td (diffusjonstid) som et molekyl holder seg innenfor fokalvolumet ekstraheres, sammen med gjennomsnittlig antall partikler, (N), tilstede i observasjonsvolumet, som er omvendt proporsjonalt med amplituden til ACF. Denne siste parameteren kan være nyttig informasjon om molekylkonsentrasjonen i observasjonsvolumet.
Siden da har et økende antall FCS-modaliteter blitt implementert takket være raskt utviklende instrumentering i biofotonikk, noe som gjør det mulig å beskrive dynamiske fenomener som forekommer i levende systemer. Likevel vil en molekylær art oppleve en mer overlappende fordeling av diffusjonskoeffisientverdiene, som vanligvis reflekteres av en uregelmessig diffusjonskarakteristikk, der molekyler diffunderer med et ikke-lineært forhold i tid19, og vanskeligheter med å identifisere den biologiske betydningen av denne uregelmessige subdiffusjonen. Tidligere har denne vanskeligheten blitt noe overvunnet ved å registrere molekylær diffusjon av FRAP fra områder av forskjellige størrelser, i stedet for fra bare ett område, og dermed gi ytterligere romlig informasjon. Dette muliggjorde for eksempel konseptualisering av membranmikrodomener 20,21,22.
En oversettelse av denne strategien til FCS-målinger (dvs. den såkalte punktvariasjonen Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (svFCS)) ble etablert ved å variere størrelsen på fokalvolumet av observasjon, slik at svingningen i fluorescens kunne registreres på forskjellige romlige skalaer23. Dermed gir svFCS-tilnærmingen indirekte romlig informasjon som muliggjør identifisering og bestemmelse av molekylære diffusjonsmoduser og type membranpartisjonering (isolerte versus sammenhengende domener24) av studerte molekyler. Ved å plotte diffusjonstiden td som en funksjon av de forskjellige romlige skalaene definert av midjeverdien (ω), som tilsvarer deteksjonsstrålens radiusstørrelse i dette tilfellet23,25, kan man karakterisere diffusjonsloven til et gitt molekyl i en gitt fysiologisk tilstand. svFCS er derfor en perfekt analog til enkeltpartikkelsporing itidsdomenet 26. Under den brownske diffusjonsbegrensningen bør man forvente et strengt lineært forhold mellom diffusjonstiden td og midjen ω (figur 1)23,25. Opprinnelsen til avviket fra diffusjonsloven fra denne ordningen kan tilskrives ikke-eksklusive årsaker, for eksempel cytoskelettmasking, molekylær trengsel, dynamisk partisjonering i nanodomener, eller en hvilken som helst kombinasjon av disse og andre effekter (figur 1), og må testes eksperimentelt25.
Her gir vi alle nødvendige kontrollpunkter for daglig bruk av et skreddersydd svFCS optisk system bygget fra bunnen av, som utfyller våre tidligere protokollanmeldelser27,28 på den eksperimentelle tilnærmingen. Videre, som et bevis på konseptet, gir vi retningslinjer for kalibrering av oppsettet, fremstilling av celler, datainnsamling og analyse for etablering av svFCS diffusjonslov (DL) for Thy1-GFP, et plasmamembranglykosylfosfatidylinositolforankret protein, som er kjent for å være lokalisert i lipidflåte nanodomains29. Til slutt demonstrerer vi hvordan den delvise destabiliseringen av lipidflåte nanodomainer ved kolesteroloksidasebehandling påvirker diffusjonsegenskapene til Thy1-GFP. I tillegg er en detaljert beskrivelse av å bygge et svFCS-oppsett fra bunnen av gitt i tilleggsmateriale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aligment tool</td>
			<td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPW602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td>
			<td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BNC 50 &#937; plug to 50 &#937; plug lead 2 m</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>742-4315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &#937; With connector, 1.22 m, RoHS2</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>885-8172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tee 50&#937; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &#8594; 1GHz</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>546-4948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &#8211; French Extension Lead, 230 V</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>768-5500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>452-8394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>792-4079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filtering</td>
			<td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F47-539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&#176; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F43-088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F37-496</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware correlator</td>
			<td>80 MHz Digital Correlator</td>
			<td>Correlator.com</td>
			<td>Flex02-12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td>
			<td>Lasos</td>
			<td>BLD-XT 488100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety</td>
			<td>High-Performance Black Masking Tape, 1&#34; x 180&#39; (25 mm x 55 m) Roll</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T743-2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope 
			Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS 
			(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421767-9971-711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical path</td>
			<td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25 &#181;m mounted pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P25S I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH10M-488 (HWP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RSP1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100B/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adjustable Prism Clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LB1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID25/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Optic Holder, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Stackable Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount for 1&#34; optic-usable depth &#189;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount For 1&#34;Optic-usable Depth 2&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 600mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA600/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 75mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 150mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA150/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&#34;x 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#189; &#34; (12mm) Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Clamps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black Rubberized Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ball Driver kit/ 6 tools</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BD-KIT/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP6M4M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Mount for 25.4mm optic</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 FC/APC Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S120C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, 
			L=50 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR75/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>USB Power and Energy Meter Interface</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L750/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L350/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25W3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25A90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black posterboard 20&#34; x 30&#34; (508 mm x 762 mm), 1/16&#34; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M4 Cap Screw Kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL5-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&#216;0.8 - &#216;12 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1D12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#216;1&#34; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&#216;1 mm Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1-MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1HB10-15-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Optical Table support, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1TS05-12-06-AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample nano-positionning</td>
			<td>Precision XYZ Nanopositioning</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI P527-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V 
			Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI E727-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature chamber</td>
			<td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_MTC_2000_DUO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Two Vibration Free Heater Modules</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_150_VF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PT100 Temperature Sensor</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_P100_TS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture and transfection</td>
			<td>Cos7 cells</td>
			<td>ATCC&#174;</td>
			<td>CRL-1651&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>8- well Lab-Tek chambers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PolyJet Transfection Reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol content measurement</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87786</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ROTI Nanoquant Working Solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>svFCS measurements</td>
			<td>HBSS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hepes buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cholesterol oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8868</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83697-1G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

Dynamiske biologiske prosesser i levende celler, inkludert de som er forbundet med plasmamembranorganisasjon, forekommer på forskjellige romlige og tidsmessige skalaer, alt fra henholdsvis nanometer til mikrometer og mikrosekunder til minutter. Et så bredt spekter av biologiske prosesser utfordrer konvensjonelle mikroskopitilnærminger. Her beskriver vi prosedyren for implementering av punktvariasjon Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (svFCS) målinger ved hjelp av et klassisk fluorescensmikroskop som er tilpasset. Protokollen inkluderer en spesifikk ytelseskontroll av svFCS-oppsettet og retningslinjene for molekylære diffusjonsmålinger av svFCS på plasmamembranen til levende celler under fysiologiske forhold. I tillegg gir vi en prosedyre for å forstyrre plasmamembranflåte nanodomains ved kolesteroloksidasebehandling og demonstrere hvordan disse endringene i den laterale organisasjonen av plasmamembranen kan avsløres ved svFCS-analyse. Avslutningsvis kan denne fluorescensbaserte metoden gi enestående detaljer om den laterale organisasjonen av plasmamembranen med passende romlig og tidsmessig oppløsning.

Vi genererte en DL for Thy1-GFP uttrykt i Cos-7-celler (figur 4, svarte firkanter). Diffusjonsloven har en positiv t0-verdi (19,47 ms ± 2 ms), noe som indikerer at Thy1-GFP er begrenset i nanodomenestrukturer i plasmamembranen. Kolesteroloksidasebehandlingen av cellene som uttrykker Thy1-GFP resulterte i skiftet av DL t0-verdien til 7,36 ± 1,34 ms (figur 4, grå firkanter). Denne observasjonen bekrefter at arten av Thy1-GFP inneslutning avhenger av kolesterolinnholdet og er forbundet med lipidflåte nanodomains. Disse to diffusjonslovene er vist å være forskjellige i henhold til den statistiske testen beskrevet ovenfor (se trinn 9.1.3) når det gjelder t0 og Deff-verdier . I tillegg vurderte vi konsentrasjonen av totalt cellulært kolesterol i ikke-behandlede Cos-7-celler versus cellene behandlet med COase. Ved COasebehandling observeres en liten, men signifikant reduksjon i totalt kolesterolinnhold (figur 5). Siden dette enzymet bare virker på kolesterolbassenget som er tilgjengelig ved den ytre brosjyren til plasmamembranen, antar vi at den observerte reduksjonen i kolesterol bare er forbundet med plasmamembranen og resulterer i destabilisering av lipidflåte nanodomains.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Figur 1: Simulert fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS) diffusjonslover etablert ved punktvariasjon FCS for ulike former for membranorganisasjon. (Øvre paneler) Skjematisk representasjon av membranorganisasjon - (A) fri diffusjon, (B) meshwork barrierer og (C) felle / domene inneslutninger - med banen trukket for et enkelt molekyl (rødt). Blå sirkler betegner skjæringspunktet mellom membranen og laserstrålen i midjen ω. (Nedre paneler) FCS diffusjonslover representert ved å plotte diffusjonstiden td som en funksjon av den kvadrerte radiusen ω2. Diffusjonslovprojeksjon (grønn stiplet linje) avskjærer tidsaksen ved (A) origo (t0 = 0) ved fri diffusjon; (B) i negativ akse (t0 < 0) når det er maskebarrierer, eller (C) i positiv akse (t0 > 0) når det er feller og domener (lipidflåter). D er den laterale diffusjonskoeffisienten for brownsk bevegelse; Deff, den effektive diffusjonskoeffisienten; Dmikro, den mikroskopiske diffusjonskoeffisienten inne i meshwork feller; Di, diffusjonskoeffisienten i domener; Dut, diffusjonskoeffisienten utenfor domener; L, størrelsen på siden av et firkantet domene; og rD, radiusen til et sirkulært domene. Denne figuren er modifisert fra He og Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Figur 2: Skjematisk visning av svFCS maskinvarekontroll. Datamaskinen styrer alle enhetene gjennom forskjellige kommunikasjonsprotokoller: seriell (mikroskop, ekstern lukker), USB (XYZ piezoelektrisk stadium, korrelator) og PCI (oppkjøpskort). DAQ: datainnsamling bord, APD: skred fotodiode, SPCM: single-photon telling modul, DO: digital utgang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Figur 3: Skjematisk visning av eksitasjons- og emisjonsoptiske baner i svFCS-oppsettet. svFCS-oppsettet inneholder fire moduler: (1) utgangen av en fiberbasert 488 nm laser kollimeres, (2) en kombinasjon av en halvbølgeplate og polariserende strålesplitter setter den optiske effekten, (3) laserstrålen fokusert på prøven etter å ha reist gjennom et rørlinsefritt motorisert mikroskop, og (4) fluorescensen oppdages gjennom en konfokallignende deteksjonsbane på en skredfotodiode koblet til en enkelt fotontellingsmodul, som leverer et signal til en maskinvarekorrelator. Enkelhet gir systemet følsomhet, robusthet og brukervennlighet (mye kommentert i tilleggsmateriale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Figur 4: SvFCS-diffusjonslovene generert fra diffusjonsanalyse av Thy1-GFP uttrykt i Cos-7. svFCS diffusjonslover av Cos-7-celler uten behandling (NT, svarte firkanter) og etter kolesteroloksidasebehandling (COase, grå sirkler). Innstikket i grafen representerer statistisk testing av en signifikant forskjell mellom de to presenterte svFCS-diffusjonslovene (ifølge Mailfert et al.28). Testverdien (T) bør være over terskelen satt til 3,8 når begge diffusjonslovene er forskjellige. Jo høyere det er, desto større er forskjellen mellom diffusjonslovene. Verdien av T er fargekodet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Figur 5: Sammenligning av totalt kolesterolinnhold i Cos-7-celler. Cos-7-celler ble enten ikke-behandlet (NT) eller behandlet med 1 U / ml kolesteroloksidase (COase) i 1 time. Dataene representerer et eksempel på ett eksperiment i tre eksemplarer. En tosidig, uparret t-test ble brukt for å vurdere den statistiske forskjellen (α = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell over materialer: Listen over optiske elementer som kreves for svFCS-oppsettet.
Supplerende materiale: Dette dokumentet beskriver byggingen av et svFCS-oppsett fra bunnen av. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells at JoVE.com

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Denne artikkelen tar sikte på å presentere en protokoll om hvordan man bygger et flekkvariasjon Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (svFCS) mikroskop for å måle molekylær diffusjon ved plasmamembranen til levende celler.

Spotvariasjon Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi for analyse av molekylær diffusjon ved plasmamembranen til levende celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Automatisert protokoller for Macromolecular krystallisering ved MRC molekylærbiologi

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Måle Trans-Plasma membran elektronet Transport av C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...