Name: spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells at JoVE.com

SB, SM и DM были поддержаны институциональным финансированием cnRS, Inserm и Университета Экс-Марселя и программными грантами Французского национального исследовательского агентства (ANR-17-CE15-0032-01 и ANR-18-CE15-0021-02) и французским «Investissement d'Avenir» (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW признает «BioTechNan», программу междисциплинарных экологических докторских исследований KNOW в области биотехнологии и нанотехнологий. EB признает финансовую поддержку Национального научного центра Польши (NCN) в рамках проекта No 2016/21/D/NZ1/00285, а также правительства Франции и посольства Франции в Польше. MŁ признает финансовую поддержку со стороны Министерства развития Польши (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) и Национального центра исследований и разработок (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT признает финансовую поддержку со стороны Национального научного центра Польши (NCN) в рамках проекта No 2016/21/B/NZ3/00343 и Вроцлавского биотехнологического центра (KNOW).

Авторам нечего раскрывать.

Здесь мы описали реализацию модуля svFCS на стандартном флуоресцентном микроскопе, мощного экспериментального подхода к расшифровке динамики организации плазматической мембраны в живых клетках благодаря анализу закона диффузии FCS. Концептуально svFCS основан на простом принципе: корреляционные измерения флуоресценции во временной области при изменении размера областиосвещения 23. Эта стратегия сыграла важную роль в выведении наноскопической информации из микроскопических измерений, которая помогает расшифровать основные физико-химические элементы, способствующие организации плазматической мембраны в устойчивом состоянии25 и физиологических процессах 30,31,32,33. В целом, эти анализы svFCS однозначно демонстрируют существование липид-зависимых нанодоменов в различных типах клеток и их прямое влияние на настройку различных сигнальных событий.
В этих рамках существуют некоторые оптические аспекты, которые необходимо учитывать при построении установки svFCS для оптимизации бюджета фотонов и минимизации оптических аберраций. Таким образом, мы рекомендуем использовать микроскоп, из которого можно снять линзу трубки при измерении svFCS. Кроме того, одна радужка играет ключевую роль в настройке svFCS: она изменяет размер луча в задней диафрагме объектива, тем самым напрямую изменяя эффективный размер талии (т.е. эффективный объем возбуждения). Диаметр луча должен соответствовать объективному заднему зрачку, чтобы получить наименьший размер талии34. Этот вариант, который помогает настроить размер талии, обеспечивает оптимизацию бюджета фотонов и прост в реализации. Наконец, вдоль светового пути используется минимальное количество оптических частей; чем менее сложна система, тем меньше фотонов теряется. Все эти опции значительно повышают надежность экспериментов svFCS.
Что касается самого протокола, то необходимо рассмотреть несколько важных шагов. Наиболее важным является соответствующее выравнивание оптических путей, что имеет решающее значение для успешных измерений svFCS (протокол, раздел 2). Это легко проверить, проанализировав флуоресцентный сигнал от раствора Rh6G 2 нМ, который должен быть ~ 200 кГц при лазерной подсветке 300 мкВт. Все радужные оболочки должны быть открыты, а ACF должны иметь важную амплитуду (обычно G0 ~ 1,5-2,0). Еще один критический момент касается клеток и их подготовки к анализу svFCS (протокол, разделы 4–8). Их плотность должна быть адаптирована таким образом, чтобы изолированные клетки, подлежащие наблюдению, были доступны для анализа. Неадгезивные клетки должны быть иммобилизованы на камерном покровном стекле с использованием раствора поли-L-лизина. Флуоресцентный сигнал от маркировки клеток не должен быть слишком сильным, иначе это приведет к очень плоским ACF, которые трудно подходят, а параметры посадки обременены важной ошибкой. Кроме того, неоднородная маркировка и флуоресцентные агрегаты в клетках чрезвычайно затрудняют интерпретацию измерений svFCS. Наконец, лечение холестериноксидазой влияет на жизнеспособность клеток, и анализ svFCS не должен превышать одного часа после лечения. Также лучше регистрировать флуоресцентные флуктуации от верхней плазматической мембраны, так как она не прикреплена к опоре, и нет риска затрудненной диффузии молекул из-за физических взаимодействий с опорой.
В технике svFCS было достигнуто достаточно достижений для ее использования в различных подходах благодаря разнообразию модальностей для корректировки объема обнаружения, что позволяет изучать различные биологические процессы в живых клетках. Альтернативой регулировке размера объема возбуждения является использование расширителяпеременного пучка 35. Также можно просто модулировать размер области освещения путем записи флуоресцентного сигнала от перехвата плазматической мембраны вдоль направленияz 36. Это может быть сделано на стандартном конфокальном микроскопе, для которого была разработана теоретическая основа для получения закона диффузии37,38.
Хотя метод svFCS предлагает пространственно-временное разрешение, которое необходимо для характеристики неоднородной боковой организации плазматической мембраны, геометрические режимы удержания не являются взаимоисключающими. Отклонение t0 в ту или иную сторону обнаруживает исключительно доминирующий способ удержания25. Более того, еще одно важное ограничение настоящего метода svFCS вытекает из классического предела оптической дифракции (~200 нм). Это, несомненно, больше, чем домены, ограничивающие молекулы внутри клеточной плазматической мембраны. Поэтому анализ удержания выводится из значения t0 , экстраполированного из закона диффузии.
Этот недостаток был преодолен путем внедрения альтернативных методов. Первоначально использование металлических пленок, просверленных наноапертурами, предлагало возможность освещения очень малой площади мембраны (т.е. ниже предела оптической дифракции одиночных нанометрических апертур радиусов, варьирующихся между 75 и 250 нм)39. Таким образом, сообщалось о переходном режиме, предсказанном на основе теоретического закона диффузии для организации изолированных доменов, и это позволило уточнить характерный размер гетерогенностей нанометрической мембраны и количественную оценку площади поверхности, занимаемой липид-зависимыми нанодоменами39. Альтернативно, нанометрическое освещение также было разработано с использованием сканирующей оптической микроскопииближнего поля 40 или планарной оптической наноантенны41. Совсем недавно сочетание стимулированного истощения выбросов (STED) и FCS обеспечило мощный и чувствительный инструмент для документирования закона диффузии с очень высоким пространственным разрешением. Этот STED-FCS дает доступ к характеристикам молекулярной диффузии на наноуровне, происходящей в течение короткого периода времени, что позволяет изучать динамическую организацию липидных зондов на плазматической мембране42,43. Однако неполное подавление флуоресценции в процессе STED ставит под сомнение анализ кривых автокорреляции в FCS.
Для преодоления этой трудности была разработана новая модель подгонки, повышающая точность измерений времени диффузии и средних чисел молекул44. Наконец, для медленной молекулярной диффузии на плазматической мембране принцип svFCS может быть применен к данным, записанным с помощью спектроскопии корреляции изображений45. Недавно было продемонстрировано, что сочетание атомно-силовой микроскопии (АСМ) с визуализацией полного внутреннего отражения-FCS (ITIR-FCS) способствует уточнению природы механизма, препятствующего молекулярной диффузии на плазматической мембране, особенно вблизи конфигурации мембраны порога перколяции из-за высокой плотности нанодоменов46.
В заключение, установление закона диффузии с помощью svFCS предоставило экспериментальные доказательства для вывода локальной гетерогенности, созданной динамическими коллективными ассоциациями липидов и мембранных белков. Как заявили Воланд и его коллеги46, «анализ диффузионного права FCS остается ценным инструментом для вывода структурных и организационных особенностей ниже предела разрешения из динамической информации». Тем не менее, нам необходимо разработать новые модели для уточнения интерпретации закона диффузии, которые должны позволить лучше понять динамику молекулярных событий, происходящих на плазматической мембране.

Сложность организации плазматических мембран Современное понимание организации клеточных мембран должно учитывать несколько аспектов1. Во-первых, сложный липидный состав варьируется не только между типами клеток, но и внутри одной клетки (мембранные органеллы/плазматическая мембрана). Кроме того, ассоциированные или внутренние мембранные белки в основном организованы в динамические многомерные комплексы, с большими доменами, выходящими за пределы мембраны, что составляет значительно большую площадь, чем у одних только трансмембранных доменов. Кроме того, мембраноассоциированные белки проявляют специфические липидсвязывающие или липид-взаимодействующие способности, которые играют роль в регуляции функции белка. Они напрямую зависят от местного состава и доступности липидов2.
Наконец, наблюдается значительный уровень асимметрии между двумя мембранными листочками из-за внутренней асимметричной структуры мембранных белков и распределения липидов. Действительно, липидный метаболический баланс между синтезом и гидролизом в сочетании с липидным переворотом между листовками генерирует такое асимметричное распределение. Поскольку любой транспорт через бислой ограничен свободной энергией, необходимой для перемещения полярной головной группы через гидрофобную внутреннюю часть мембран, ему обычно помогают селективные транспортеры. Для каждого типа клеток асимметрия имеет тенденцию твердо поддерживаться. В совокупности эти факторы способствуют боковой неоднородности или компартментализации плазматической мембраны 3,4.
Мы обогащаем это представление плазматической мембраны, принимая во внимание внутреннюю молекулярную диффузию внутри и поперек бислоя, что способствует динамической боковой гетерогенности в масштабе от десятых до сотен нанометров и микросекунд до секунд. Например, липидозависимые мембранные нанодомены — так называемые липидные рафты, определяемые как холестерин, и богатые сфинголипидами сигнальные платформы — способствуют компартментализации плазматической мембраны 5,6. Однако современный взгляд на организацию мембран не ограничивается только липидными плотами. Мембранные нанодомены более сложны и неоднородны по составу, происхождению и функции. Тем не менее, их присутствие в плазматической мембране должно быть тесно скоординировано, а динамические взаимодействия между белками и липидами, по-видимому, важны для пространственного распределения и химической модификации мембранных нанодоменов 1,3,7,8.
Принцип svFCS и его применение для исследования организации плазматической мембраны Хотя в анализе мембранных доменов был достигнут значительный прогресс, главным образом с помощью биофизических методов, детерминанты, которые диктуют локальную организацию плазматической мембраны, должны быть уточнены с соответствующим пространственным и временным разрешением. Детерминанты, основанные на отслеживании отдельных молекул, обеспечивают отличную пространственную точность и позволяют характеризовать различные режимы движения 9,10,11,12, но имеют ограниченное временное разрешение с классической низкой частотой кадров камеры и требуют больше экспериментальных усилий для записи значительного количества траекторий. Альтернативно, коэффициент диффузии мембранных компонентов может быть оценен с помощью флуоресцентного восстановления после фотоотбеливания (FRAP)13 или флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS)14. Последнему уделяется больше внимания, главным образом из-за его высокой чувствительности и селективности, микроскопического объема обнаружения, низкой инвазивности и широкого динамического диапазона15.
Концептуальная основа FCS была введена Магде и его коллегами около 50 лет назад16,17. Он основан на регистрации флуктуаций флуоресцентного излучения с высоким временным разрешением (от мкс до с)18. В его современной версии измерения в живых клетках выполняются небольшим конфокальным объемом возбуждения (~0,3 фемтолитра), расположенным в интересующей области (например, на плазматической мембране); флуоресцентный сигнал, генерируемый диффузионными флуоресцентными молекулами, входящими и выходящими из объема наблюдения, собирается с очень высоким временным разрешением (т.е. временем прибытия каждого фотона на детектор). Затем сигнал вычисляется для генерации автокорреляционной функции (ACF), из которой извлекается среднее время td (время диффузии), в течение которого молекула остается в фокальном объеме, вместе со средним числом частиц (N), присутствующих в объеме наблюдения, которое обратно пропорционально амплитуде ACF. Этот последний параметр может быть полезной информацией о концентрации молекулы в объеме наблюдения.
С тех пор все большее число модальностей FCS было реализовано благодаря быстро развивающейся аппаратуре в биофотонике, позволяющей описывать динамические явления, происходящие в живых системах. Тем не менее, молекулярный вид будет испытывать более перекрывающееся распределение значений коэффициента диффузии, что обычно отражается аномальной характеристикой диффузии, в которой молекулы диффундируют с нелинейной зависимостью во времени19, и трудностями в определении биологического значения этой аномальной субдиффузии. В прошлом эта трудность была несколько преодолена путем регистрации молекулярной диффузии FRAP из областей различных размеров, а не только из одной области, тем самым обеспечивая дополнительную пространственную информацию. Это позволило, например, концептуализировать мембранные микродомены 20,21,22.
Перевод этой стратегии в измерения FCS (т.е. так называемая точечная вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (svFCS)) был установлен путем изменения размера фокального объема наблюдения, что позволило регистрировать флуктуации флуоресценции на разных пространственных масштабах23. Таким образом, подход svFCS предоставляет косвенную пространственную информацию, позволяющую идентифицировать и определять режимы молекулярной диффузии и тип мембранного разделения (изолированные и смежные домены24) исследуемых молекул. Построив время диффузии td как функцию различных пространственных масштабов, определяемых значением талии (ω), которое соответствует размеру радиуса луча обнаружения в данном случае23,25, можно охарактеризовать закон диффузии данной молекулы в данном физиологическом состоянии. Таким образом, svFCS является идеальным аналогом отслеживания одной частицы вовременной области 26. В соответствии с броуновским диффузионным ограничением следует ожидать строго линейной зависимости между временем диффузии td и талией ω (рисунок 1)23,25. Происхождение отклонения закона диффузии от этой схемы можно отнести к неисключительным причинам, таким как сетка цитоскелетов, молекулярная скученность, динамическое разделение в нанодоменах или любая комбинация этих и других эффектов (фиг.1), и нуждается в экспериментальном испытании25.
Здесь мы предоставляем все необходимые контрольные точки управления для ежедневного использования изготовленной на заказ оптической системы svFCS, построенной с нуля, которая дополняет наши предыдущие обзоры протокола27,28 по этому экспериментальному подходу. Кроме того, в качестве доказательства концепции мы даем рекомендации относительно калибровки установки, подготовки клеток, сбора данных и анализа для установления закона диффузии svFCS (DL) для Thy1-GFP, плазматической мембраны гликозилфосфатидинозитол-анкированного белка, который, как известно, локализован в липидных плотовых нанодоменах29. Наконец, мы демонстрируем, как частичная дестабилизация липидно-рафтовых нанодоменов при обработке холестериноксидазой влияет на диффузионные свойства Thy1-GFP. Кроме того, подробное описание сборки установки svFCS с нуля приведено в дополнительном материале.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aligment tool</td>
			<td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPW602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td>
			<td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BNC 50 &#937; plug to 50 &#937; plug lead 2 m</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>742-4315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &#937; With connector, 1.22 m, RoHS2</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>885-8172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tee 50&#937; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &#8594; 1GHz</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>546-4948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &#8211; French Extension Lead, 230 V</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>768-5500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>452-8394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>792-4079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filtering</td>
			<td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F47-539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&#176; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F43-088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F37-496</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware correlator</td>
			<td>80 MHz Digital Correlator</td>
			<td>Correlator.com</td>
			<td>Flex02-12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td>
			<td>Lasos</td>
			<td>BLD-XT 488100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety</td>
			<td>High-Performance Black Masking Tape, 1&#34; x 180&#39; (25 mm x 55 m) Roll</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T743-2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope 
			Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS 
			(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421767-9971-711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical path</td>
			<td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25 &#181;m mounted pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P25S I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH10M-488 (HWP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RSP1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100B/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adjustable Prism Clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LB1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID25/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Optic Holder, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Stackable Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount for 1&#34; optic-usable depth &#189;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount For 1&#34;Optic-usable Depth 2&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 600mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA600/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 75mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 150mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA150/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&#34;x 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#189; &#34; (12mm) Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Clamps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black Rubberized Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ball Driver kit/ 6 tools</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BD-KIT/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP6M4M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Mount for 25.4mm optic</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 FC/APC Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S120C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, 
			L=50 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR75/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>USB Power and Energy Meter Interface</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L750/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L350/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25W3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25A90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black posterboard 20&#34; x 30&#34; (508 mm x 762 mm), 1/16&#34; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M4 Cap Screw Kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL5-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&#216;0.8 - &#216;12 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1D12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#216;1&#34; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&#216;1 mm Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1-MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1HB10-15-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Optical Table support, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1TS05-12-06-AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample nano-positionning</td>
			<td>Precision XYZ Nanopositioning</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI P527-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V 
			Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI E727-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature chamber</td>
			<td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_MTC_2000_DUO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Two Vibration Free Heater Modules</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_150_VF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PT100 Temperature Sensor</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_P100_TS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture and transfection</td>
			<td>Cos7 cells</td>
			<td>ATCC&#174;</td>
			<td>CRL-1651&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>8- well Lab-Tek chambers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PolyJet Transfection Reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol content measurement</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87786</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ROTI Nanoquant Working Solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>svFCS measurements</td>
			<td>HBSS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hepes buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cholesterol oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8868</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83697-1G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

Динамические биологические процессы в живых клетках, в том числе связанные с организацией плазматической мембраны, происходят в различных пространственных и временных масштабах, начиная от нанометров до микрометров и микросекунд до минут соответственно. Такой широкий спектр биологических процессов бросает вызов традиционным подходам микроскопии. Здесь мы подробно описываем процедуру реализации измерений флуоресцентной корреляционной спектроскопии (svFCS) с использованием классического флуоресцентного микроскопа, который был настроен. Протокол включает в себя специальную проверку производительности установки svFCS и руководство по измерениям молекулярной диффузии svFCS на плазматической мембране живых клеток в физиологических условиях. Кроме того, мы предоставляем процедуру разрушения нанодоменов плота плазматической мембраны путем лечения холестериноксидазой и демонстрируем, как эти изменения в боковой организации плазматической мембраны могут быть выявлены анализом svFCS. В заключение, этот метод, основанный на флуоресценции, может предоставить беспрецедентные подробности о боковой организации плазматической мембраны с соответствующим пространственным и временным разрешением.

Мы сгенерировали DL для Thy1-GFP, экспрессируемого в клетках Cos-7 (рисунок 4, черные квадраты). Закон диффузии имеет положительное значение t0 (19,47 мс ± 2 мс), указывающее на то, что Thy1-GFP ограничен нанодоменовыми структурами плазматической мембраны. Лечение холестериноксидазой клеток, экспрессирующих Thy1-GFP, привело к смещению значения DL t0 до 7,36 ± 1,34 мс (рисунок 4, серые квадраты). Это наблюдение подтверждает, что характер удержания Thy1-GFP зависит от содержания холестерина и связан с нанодоменами липидного плота. Показано, что эти два закона диффузии различаются в соответствии со статистическим тестом, описанным выше (см. шаг 9.1.3) в терминах значений t0 и Deff . Кроме того, мы оценили концентрацию общего клеточного холестерина в необработанных клетках Cos-7 по сравнению с клетками, обработанными COase. Небольшое, но значительное снижение содержания общего холестерина наблюдается при лечении COase (рисунок 5). Поскольку этот фермент действует только на пул холестерина, доступный на внешнем листке плазматической мембраны, мы предполагаем, что наблюдаемое снижение холестерина связано только с плазматической мембраной и приводит к дестабилизации нанодоменов липидного рафта.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Рисунок 1: Смоделированные флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) диффузионные законы, установленные точечной вариацией FCS для различных форм мембранной организации. (Верхние панели) Схематическое изображение мембранной организации — (A) свободная диффузия, (B) сетчатые барьеры и (C) ловушки / доменные ограничения — с траекторией, нарисованной для одной молекулы (красный). Синие круги обозначают пересечение мембраны и лазерного луча талии ω. (Нижние панели) Законы диффузии FCS представлены построением времени диффузии td как функции квадратного радиуса ω2. Проекция закона диффузии (зеленая пунктирная линия) перехватывает ось времени при (A) начале координат (t0 = 0) в случае свободной диффузии; (B) в отрицательной оси (t0 < 0), когда имеются сетчатые барьеры, или (C) в положительной оси (t0 > 0), когда имеются ловушки и домены (липидные плоты). D — коэффициент боковой диффузии для броуновского движения; Deff, эффективный коэффициент диффузии; Dmicro, микроскопический коэффициент диффузии внутри сетчатых ловушек; Din, коэффициент диффузии внутри доменов; Dout, коэффициент диффузии вне доменов; L, размер стороны квадратного домена; и rD — радиус круговой области. Этот рисунок был изменен с He и Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Схематическое представление аппаратного управления svFCS. Компьютер управляет всеми устройствами через различные протоколы связи: последовательный (микроскоп, внешний затвор), USB (пьезоэлектрический каскад XYZ, коррелятор) и PCI (плата сбора). DAQ: плата сбора данных, APD: лавинный фотодиод, SPCM: однофотонный модуль подсчета, DO: цифровой выход. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Рисунок 3: Схематическое представление оптических путей возбуждения и излучения установки svFCS. Установка svFCS содержит четыре модуля: (1) выход волоконного лазера 488 нм коллимирован, (2) комбинация полуволновой пластины и поляризационного луча-разветвителя задает оптическую мощность, (3) лазерный луч, сфокусированный на образце после прохождения через безпанланзионный моторизованный микроскоп, и (4) флуоресценция обнаруживается через конфокальный путь обнаружения на лавинном фотодиоде, соединенном с одним модулем подсчета фотонов, который подает сигнал на аппаратный коррелятор. Простота придает системе чувствительность, надежность и простоту использования (широко комментируется в дополнительном материале). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Рисунок 4: Законы диффузии svFCS, полученные в результате диффузионного анализа Thy1-GFP, выраженного в Cos-7. Законы диффузии svFCS клеток Cos-7 без лечения (NT, черные квадраты) и после лечения холестериноксидазой (COase, серые круги). Вставка на графике представляет собой статистическое тестирование существенной разницы между двумя представленными законами диффузии svFCS (согласно Mailfert et al.28). Испытательное значение (T) должно быть выше порогового значения, установленного на уровне 3,8, когда оба закона диффузии различны. Чем она выше, тем больше разница между законами диффузии. Значение T имеет цветовую кодировку. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Рисунок 5: Сравнение содержания общего холестерина в клетках Cos-7. Клетки Cos-7 либо не обрабатывали (NT), либо обрабатывали 1 Ед/мл холестериноксидазы (COase) в течение 1 ч. Данные представляют собой пример одного эксперимента в трех экземплярах. Для оценки статистической разницы использовался двуххвостый непарный T-тест (α=0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица материалов: Список оптических элементов, необходимых для установки svFCS.
Дополнительные материалы: В этом документе описывается построение установки svFCS с нуля. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells at JoVE.com

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Целью этой статьи является представление протокола о том, как построить микроскоп точечной флуоресцентной корреляционной спектроскопии (svFCS) для измерения молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток.

Точечная вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия для анализа молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Автоматизированные протоколы для высокомолекулярных кристаллизации в MRC лаборатории молекулярной биологии

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Измерения транс плазмы мембраны переноса электронов, C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...