Name: development and testing of species-specific quantitative pcr assays for environmental dna applications
Uploaded: 2020-11-05T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications at JoVE.com

Astar geliştirme ve testlerinde yardımcı olan Alvi Wadud ve Trudi Frost'a teşekkür ederiz. Bu çalışmada bildirilen tahlil tasarımı için fon Savunma Bakanlığı Stratejik Çevre Araştırma ve Geliştirme Programı (RC19-1156) tarafından sağlanmıştır. Ticari, ürün veya firma adlarının herhangi bir şekilde kullanılması yalnızca açıklayıcı amaçlar içindir ve ABD Hükümeti tarafından onay anlamına gelmez. Bu çalışma sırasında oluşturulan veriler USGS veri yayınlama https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 olarak mevcuttur.

<ol>
	<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li><li>Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences.">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology. 10, 5 (1992).</li><li>Mauvisseau, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+accuracy,+repeatability+and+detection+probability+in+the+reliability+of+species-specific+eDNA+based+approaches.">Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches.</a> Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).</li><li>Hernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=60+specific+eDNA+qPCR+assays+to+detect+invasive,+threatened,+and+exploited+freshwater+vertebrates+and+invertebrates+in+Eastern+Canada.">60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada.</a> Environmental DNA. , (2020).</li><li>Klymus, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+the+limits+of+detection+and+quantification+for+environmental+DNA+assays.">Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays.</a> Environmental DNA. , (2019).</li><li>Thalinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validation+scale+to+determine+the+readiness+of+environmental+DNA+assays+for+routine+species+monitoring.">A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Helbing, C. C., Hobbs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+Standardization+Needs+for+Fish+and+Wildlife+Population+Assessments+and+Monitoring.">Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring.</a> CSA Group. , (2019).</li><li>Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Environmental+DNA+Methods+Ready+for+Aquatic+Invasive+Species+Management.">Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. , (2020).</li><li>Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+a+PCR+efficiency+estimate:+Recommendations+for+precise+and+robust+qPCR+efficiency+assessments.">How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).</li><li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA:+the+importance+of+primer+specificity.">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).</li><li>Prediger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+design+primers+and+probes+for+PCR+and+qPCR.">How to design primers and probes for PCR and qPCR.</a> IDT. , (2020).</li><li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+(qPCR)+primer+design+using+free+online+software.">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).</li><li>Owczarzy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDT+SciTools:+a+suite+for+analysis+and+design+of+nucleic+acid+oligomers.">IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers.</a> Nucleic Acids Research. 36, 163-169 (2008).</li><li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OligoCalc:+an+online+oligonucleotide+properties+calculator.">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Research. 35, 43-46 (2007).</li><li>Taylor, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+qPCR+Experiment:+Producing+Publication+Quality,+Reproducible+Data+the+First+Time.">The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time.</a> Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Local+Alignment+Search+Tool.">Basic Local Alignment Search Tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bio-Rad Vol. 5279. , (2020).</li><li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bio-Rad Vol. 6894. , (2020).</li><li>Eurogentec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eurogentec. Vol. 0708-V2. , (2020).</li><li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+primer+design+revisited.">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li><li>Hoorfar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+in+design+of+internal+amplification+controls+for+diagnostic+PCR+assays.">Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).</li><li>Goldberg, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+considerations+for+the+application+of+environmental+DNA+methods+to+detect+aquatic+species.">Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).</li><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+(eDNA)+Assays+for+Invasive+Populations+of+Black+Carp+in+North+America.">Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America.</a> Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).</li><li>Mosher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+molecular+detection+studies+require+clear+communication+among+diverse+research+partners.">Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners.</a> Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).</li><li>Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+DNA+barcoding:+low+species+coverage+and+numerous+unidentified+sequences.">An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences.</a> Cladistics. 28, 6 (2012).</li><li>Rees, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REVIEW:+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology.">REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).</li><li>Evans, N. T., Lamberti, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+fisheries+assessment+using+environmental+DNA:+A+primer+on+the+method,+its+potential,+and+shortcomings+as+a+conservation+tool.">Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool.</a> Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).</li><li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+(qPCR).">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li><li>Sengupta, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+for+improved+detection+and+environmental+surveillance+of+schistosomiasis.">Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).</li><li>Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+eDNA+shedding+rates+from+invasive+bighead+carp+Hypophthalmichthys+nobilis+and+silver+carp+Hypophthalmichthys+molitrix.">Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix.</a> Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun. Fon sponsorlarının çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanmasında, analizlerinde veya yorumlanmasında; yazının yazımında; veya sonuçların yayımlanması kararında.

Her çalışmada olduğu gibi, ele alınacak soruyu tanımlamak ilk adımdır ve eDNA testinin tasarımı çalışmanın kapsamına bağlıdır.26. Örneğin, araştırmanın veya anketin amacı bir veya birkaç türü tespit etmekse, hedeflenen bir sonda tabanlı test en iyisidir. Bununla birlikte, amaç türlerin daha büyük bir paketini veya montajını değerlendirmekse, yüksek verimli sıralama metabarkodlama tahlilleri daha uygundur. Hangi yaklaşımın benimseyeceği belirlendikten sonra, tahlil tasarımı, test ve optimizasyon içeren bir pilot çalışma önerilir.24. Tahlil tasarımı, Şekil 1. Bu liste, bir tahlilin özgüllük ve uygulanabileceği coğrafi aralık açısından ne kadar iyi performans gösterdiğini anlamanın temelini oluşturacaktır.6,10. Testin belirli bir coğrafi alan için tasarlanması, tasarımcının o bölgedeki diğer türlere karşı çapraz reaktivite için bir testi daha iyi test etmesini ve bunun bir testin hedef türün oluşabileceği diğer alanlara genişletilmesindeki sınırlamaların farkında olmasını sağlamak teşvik edilir.24. Liste tamamlandıktan sonra, diziler genel genetik veritabanlarından indirilebilir. Bu veritabanları eksik olduğundan27, tahlil tasarımında kullanılacak dizilerin yerel referans veritabanını tamamlamak için listedeki mümkün olduğunca çok türü evde sıralamalıdır. Birlikte meydana gelen yakından ilişkili türlere öncelik vermek, çünkü bunlar en olası hedef olmayanlardır. Hedef türle aynı cins veya aile içindeki tüm türlere odaklanmak başlamak için iyi bir yerdir. Yakından ilişkili türlerle yapılan karşılaştırmalar, hedef türlere özgü sıra bölgelerini belirlemeye yardımcı olacaktır. Bu, tahlillerin diğer sistemlerde veya konumlarda nasıl performans gösterebileceğini bildirmeye yardımcı olabilir. Mitokondriyal bölgeler tahlil gelişimi için olağan seçimdir, çünkü yaşam projelerinin barkodunda kullanılan mitokondriyal genlerde daha çeşitli türlerden daha fazla dizi bilgisi mevcuttur ve mitokondriyal DNA, kopyalarda / hücrede nükleer DNA'dan çok daha fazla konsantrasyonda bulunur.24,28,29. Dizi kapsamı genetik depo veritabanlarındaki takson arasında değiştiği için daha fazla test gelişimi için birden fazla gen bölgesi değerlendirilmelidir. Bu yerel başvuru dizileri veritabanı oluşturulduktan sonra, astar/prob tahlillerini tasarlamak için hizalanmış sıra verilerinin ve bilgisayar yazılım programlarının manuel görselleştirilmesinin bir kombinasyonu kullanılır. Hangi tahlillerin test edilmesi gerektiğini belirlemek için kesinlikle yazılıma güvenmemek gerekir. Bir PCR'de nasıl davranabileceklerini daha iyi anlamak için astarların ve probların hedeflere ve hedef olmayanlara oturduğu hizalamalarda görsel olarak doğrulamak önemlidir. Son olarak tahlil tarama ve optimizasyon üç seviye içerir (siliko, in vitro ve in situ)6,7,24,25. Siliko tasarımında ve testlerinde başarı şansı yüksek kısa bir test listesi üretmek önemlidir, ancak ampirik (in vitro) test, tahlilleri en iyi gerçek performansla seçmek için çok önemlidir. In vitro optimizasyonu ve tahlillerin test edilmesi, reaksiyon verimliliğinin ölçülmesi ve testin hassasiyetinin ve özgüllüğünün tanımlanmasını içerir. Algılama ve niceleme sınırları, tahlil geliştirmede sıklıkla göz ardı edilen ancak veri yorumlama için önemli olan iki parametredir. Bir test için standart eğrilerin birden fazla çoğaltmasını çalıştırarak, LOD ve LOQ kolayca ölçülebilir1,5,30. Çok az çalışma, testin LOD veya LOQ'su ile ilgili sonuçları tartışır, ancak Sengupta ve arkadaşları (2019), sonuçlarının daha net anlaşılması için testlerinin LOD ve LOQ'larını veri yorumlama ve grafiklerine dahil eder.31. dahili pozitif kontroller de tasarlanan teste çoklayıcı olmalıdır. Örneklerde PCR inhibisyonu testi yapılmadan, yanlış negatifler oluşabilir24,32. PCR inhibisyon testi için en kolay yöntem olarak hedef test ile çok yönlü bir IPC testinin kullanılmasını öneriyoruz23. Son olarak, saha ve laboratuvardan toplanan numunelerden yapılan testin yerinde test edilmesi, çevresel örneklerde hedef amplifikasyonun gerçekleşmesini sağlamak için gereklidir.24.
Türlere özgü, prob tabanlı qPCR testlerinin eDNA örnekleriyle kullanımı için sınırlamalar mevcuttur. Örneğin, test için birden fazla tahlil tasarımı sıra kullanılabilirliği ile sınırlı olabilir ve test performansının yönleri üzerinde uzlaşma gerekebilir. Bu seçimler çalışmanın hedeflerine göre yönlendirilmeli ve sonuçlarla birlikte bildirilmelidir26. Örneğin, amaç nadir bir türün tespiti ise ve birkaç pozitif bekleniyorsa, tüm algılamalar sıralama ile doğrulanacaksa kusurlu özgüllüğe sahip bir tahlil (yani hedef olmayan türlerin amplifikasyonu) kullanılabilir. Amaç bir türün coğrafi aralığını izlemekse ve eDNA konsantrasyon verilerine gerek yoksa, kusurlu verimliliğe sahip bir test kullanılabilir ve veriler yalnızca yüzde tespiti olarak bildirilebilir. Ayrıca, tüm potansiyel spesifikler laboratuvarda test edilmediği sürece, ki bu nadiren mümkündür, bir testin gerçek özgüllüğünü kesin olarak bilemez. Örneğin, test Clinch Nehri'ndeki birkaç tatlı su midye türüne karşı tasarlanmış ve test edilmiştir. Bu testi farklı bir nehir sisteminde kullanmak için, yeni yerdeki bir tür paketine karşı test etmemiz gerekir. Test gelişimi sırasında test olmayan türler veya popülasyon içindeki genetik varyasyon da özgüllüğü etkileyebilir. Son olarak, bir tahlil yüksek teknik performansa sahip olduğu doğrulanmış olsa bile; alanda çalışırken koşullar değişir. Su akışı, pH ve hayvan davranışı gibi testle ilgili olmayan koşullar, farklı eDNA toplama ve çıkarma protokollerinin kullanılabileceği gibi eDNA algılanabilirliğini değiştirebilir. Optimize edilmiş ve iyi tanımlanmış tahlillerin kullanılması, bu tür parametrelerin eDNA algılaması üzerindeki etkisinin anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
eDNA alanı, keşif analizi aşamasının ötesinde, yöntem ve tekniklerin standardizasyonunu artırmaya kadar olgunlaşmaktır. Bu gelişmeler eDNA tekniklerini, yeteneklerini ve sınırlamalarını anlamamızı geliştirecektir. Yukarıda özetlediğimiz optimizasyon süreci, bir analizin hassasiyetini, özgüllüğünü ve tekrarlanabilirliğini geliştirir. Bu iyileştirmenin ve eDNA yöntemlerinin standardizasyonunun nihai amacı, araştırmacıların eDNA verilerine dayalı çıkarımlar yapma yeteneklerini geliştirmek ve sonuçlara olan son kullanıcı ve bahis sahibi güvenini artırmaktır.

Araştırmacılar ve yöneticiler, tür tespiti için çevresel DNA testlerinin kullanımıyla giderek daha fazla ilgilenmeye başladı. Otuz yıldır, nicel veya gerçek zamanlı PCR (qPCR / rtPCR) nükleik asitlerin diziye özgü tespiti ve nicelleştirilmesi için çok sayıda alanda 1,2. EDNA araştırmasının nispeten yeni alanında, bu tahlillerin, eDNA örneğinin hacmi veya ağırlığı başına hedef DNA kopyalarının ölçülmesi için standart bir eğri ile kullanılması artık rutin bir uygulama haline gelmiştir. Mitokondriyal DNA dizileri genellikle eDNA tahlillerinde hedeflenir, çünkü mitokondriyal genom hücre başına binlerce kopyada bulunur, ancak nükleer DNA veya RNA dizileri için tahliller de mümkündür. eDNA örnekleri için yayınlanan testlerin performansta her zaman eşit olmadığını anlamak çok önemlidir. Bir testin yalnızca bir hedef türün DNA'sını (yani özgüllüğü) tespit etmedeki güvenilirliği ve düşük miktarda hedef DNA'nın (yani hassasiyet) tespit edilmesi, testin nasıl tasarlandığı, seçildiği, optimize edildiği ve test edildiği konusundaki farklılıklar nedeniyle önemli ölçüde değişebilir. Test performansının nicel önlemlerinin rapor edildiği daha önce büyük ölçüde göz ardı edilmiştir, ancak son zamanlarda tahlil gelişiminde şeffaflığı artırmaya yönelik standartlar ortaya çıkıyor 3 ,4,5,6,7,8.
EDNA anket sonuçlarının eDNA anket sonuçlarının incelenmesi ve yorumlanmasında tahlil performans yardımcılarının optimizasyonu ve raporlanması. Hedef olmayan tür DNA'sı ile çapraz reaksiyon gösteren tahliller yanlış pozitif tespitlere yol açabilirken, hassasiyeti zayıf olan tahliller örnekte mevcut olsa bile hedef tür DNA'sını tespit edemeyebilir (yanlış negatifler). Test hassasiyeti ve seçicilik anlayışı, nadir türleri tespit etmek için gereken örnekleme çabasını bilgilendirmeye yardımcı olacaktır. eDNA'da birçok doğal varyasyon kaynağı olduğundan, çalışmalar kontrol edilebilir varyasyon kaynaklarını mümkün olduğunca sınırlamalıdır, eDNA testini tamamen optimize etmek ve karakterize etmek de dahil olmak üzere3.
Bir tahlilin özgüllüğünü veya hassasiyetini doğrudan etkileyen koşullar, tahlilin performansını değiştirecektir. Bu, farklı laboratuvar koşullarında (örneğin, farklı reaktifler, kullanıcılar, makineler vb.) oluşabilir. Bu nedenle, yeni koşullar altında bir tahlil uygulanırken bu protokol yeniden ele alınmalıdır. Literatürde iyi karakterize edilen tahliller bile, yeni bir laboratuvar tarafından benimsendiğinde veya farklı reaktifler (örneğin, ana karışım çözeltisi)5,9. Test farklı bir coğrafi bölgeye uygulandığında test özgüllüğü değişebilir, çünkü test, testin test edilmemiş olduğu hedef olmayan türleri içerebilecek yeni bir biyotik topluluktan alınan örneklere uygulanmaktadır ve hedef türlerde genetik varyasyon meydana gelebilir. Yine, test yeni bir konumda kullanıldığında yeniden değerlendirilmelidir. Saha koşulları laboratuvar koşullarından farklıdır, çünkü sahada PCR inhibitörlerinin numunelerde bulunma olasılığı daha yüksektir. PCR inhibitörleri amplifikasyon reaksiyonu doğrudan etkiler ve böylece tahlil performansını etkiler. Bu nedenle, bir eDNA tahlili geliştirirken dahili bir pozitif kontrol gereklidir.
Son olarak, alandaki çevresel koşullar, hedef türün DNA moleküllerini ve DNA bozulması, taşınması ve tutulması yoluyla yakalanmasını etkileyebilir. Ayrıca, DNA toplama ve çıkarma için farklı protokoller, DNA'yı tutma verimliliklerine ve yeteneklerine göre değişir. Bununla birlikte, bu süreçlerin eDNA'nın tespit edilebilirliğini etkilediğini, ancak moleküler bir tahlil performansını etkilemediğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, alan örneklerinde hedef türlerden DNA'nın tespit edilebilirliği, hem qPCR testinin teknik performansının hem de saha koşullarının ve toplama, depolama ve çıkarma protokollerinin bir işlevidir. İyi karakterize edilmiş ve yüksek performanslı bir tahlil kullanırken, kullanıcılar tahlil yeteneklerinden emin hissedebilirler; araştırmacıların artık eDNA algılamasını etkileyen dış tahlil faktörlerini (yani çevresel değişkenler, yakalama veya çıkarma protokollerindeki farklılıklar) anlamaya odaklanmalarını sağlar.
Burada özellikle titiz tasarım ve optimizasyon yoluyla teknik performansı test etmeye odaklanıyoruz. Protokolü, ABD'nin Clinch Nehri'nde örnek alınan sudan bir tatlı su midyesi olan mucket'in(Actinonaias ligamentina)tespiti için geliştirilen sonda bazlı bir tahlil kullanarak gösteriyoruz. Son zamanlarda Thalinger ve arkadaşları (2020), hedeflenen eDNA testlerinin doğrulanması için yönergeler sundu. Protokolümüzü takip eden tahlil tasarımı Thalinger ve arkadaşlarının seviye 4'üne bir test artı seviye 56'yadoğru ek bir adım getirecektir. Bu noktada bir tahlil teknik performansı optimize edilecek, laboratuvar ve saha uygulamalarında düzenli kullanıma hazır hale gelecektir. Tahlillerin laboratuvar, mezokozm ve saha deneylerinde daha fazla kullanılması, eDNA tespiti ve tespit edilebilirliği etkileyen faktörler, seviye 5 doğrulama6için son adımlar ile ilgili soruları ele alabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Place Reversible Racks with Covers</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>456355AST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.)</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>43431, 55090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2681332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC forward and reverse primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge machine</td>
			<td>Various</td>
			<td>-</td>
			<td>Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 1000 &#181;L F 768A/8</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 20 &#181;L F 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 200 &#181;L F 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Various</td>
			<td>Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Environmental Master Mix 2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4396838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target forward and reverse primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target synthetic gBlock gene fragment</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product. used for qPCR standard dilution series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50728002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and testing of species-specific quantitative pcr assays for environmental dna applications

Balıkçılık ve doğal hayatı koruma yönetimine yardımcı olmak için tür varlığını tespit etmek ve izlemek için yeni, invaziv olmayan yöntemler geliştirilmektedir. Makrobiyotayı tespit etmek için çevresel DNA (eDNA) örneklerinin kullanılması, hızla popüler hale gelen ve ulusal yönetim programlarında uygulanan bu tür yöntemlerden biridir. Burada prob bazlı nicel PCR (qPCR) uygulamaları için türlere özgü hedefli tahlillerin geliştirilmesine odaklanıyoruz. Prob tabanlı qPCR kullanmak, tek başına astarlarla mümkün olandan daha fazla özgüllük sunar. Ayrıca, bir numunedeki DNA miktarını ölçme yeteneği, eDNA'nın ekolojisini ve alandaki eDNA algılama kalıplarının yorumlanmasını anlamamızda yararlı olabilir. Hedef türlerin çevresel bir numuneden tespit edilmesi hassasiyetini ve özgüllüğünü sağlamak için bu tahlillerin geliştirilmesinde ve testinde dikkatli bir değerlendirmeye ihtiyaç vardır. Bu protokolde, hedef bir türün tespiti için prob tabanlı tahlillerin tasarlanması ve test edilmesi için gereken adımları tespit edeceğiz; sıra veritabanlarının oluşturulması, tahlil tasarımı, tahlil seçimi ve optimizasyonu, test tahlil performansı ve alan doğrulaması dahil. Bu adımların ardından, güvenle kullanılabilecek verimli, hassas ve spesifik bir test elde edilmesine yardımcı olacaktır. Bu süreci, ABD'nin Clinch Nehri'nde bulunan tatlı su midyesi türü olan mucket popülasyonları (Actinonaias ligamentina) popülasyonlarıiçin tasarlanmış tahlillerimizle gösteriyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications at JoVE.com

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

Çevresel DNA tahlilleri, alan verilerinin toplanmasına başlamadan önce titiz bir tasarım, test, optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Burada, çevresel örneklerden hedef tür DNA'sının tespiti ve nicelleştirilmesi için türe özgü, prob tabanlı bir qPCR testi tasarlamanın her adımında kullanıcıları götürecek bir protokol sunuyoruz.

ÇevreSEL DNA Uygulamaları için Türlere Özgü Nicel PCR Testlerinin Geliştirilmesi ve Testi

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

Research

JoVE Journal

Environment

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Farklı Ot Türlerinin Sağlam Herbisit Direnci Testi için Protokoller

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Hazırlık ve Test zehirlilik için hızlı değerlendirme İçme Suyu Örnekleri için RTgill-W1 Hücreleri ile akışkan bioçipler Empedans tabanlı

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Filtrasyon Su Örnekleri ve Çevre DNA Ekstraksiyon için bir Filtre Kartuşu Kullanımı

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Sucul Life Asma değerlendirmek Sedimanlar Etkileri için Flow-through Pozlama Sistemi

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Koloni Düzeyde Bireysel olan Bal Arısı Kalkınma Çevre Kimyasalların Etkisinin Değerlendirilmesi

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Nanomalzemeler sulu ortamda dağılımı: doğru iletişim kuralı en iyi duruma getirme

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

DMMTAV ve çevresel uygulamaları için DMAV kullanarak DMDTAV hazırlanması: sentez, arıtma ve onay

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

Diriliş uyuyan Daphnia magna: Protokolü ve uygulamaları

Long-term studies enable the identification of eco-evolutionary processes that occur over extended time periods. In addition, they provide key empirical ...

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Akut ve kronik Ecotoxicity test turkuaz Killifish Nothobranchius furzeri için iletişim kuralı

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...