Name: feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-10-22T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

אנו מודים לניפון בסרור, אדריאנה ק. רוזס וילגס, נדב שי וטרבור סורלס על הערותיהם על כתבי היד, ולז'ונגיאן גונג וקיירולוס ברסום על הסיוע הטכני. אנו מודים לאלכס ווילד על התצלומים בהם נעשה שימוש באיור 1. K.V. נתמך על ידי מלגת הדוקטורט של בוהרינג'ר אינגלהיים פונדס. V.J. נתמך בחלקו על ידי NIH T32-MH095246. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק לאוניברסיטת רוקפלר מהמכון הרפואי ע"ש הווארד יוז באמצעות מלגת ג'יימס ה. גיליאם למחקר מתקדם ל-V.J. חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע בוגרי תכנית מחקר תחת גרנט לא. NSF DGE-1325261 לוי.ג'יי. כל חוות דעת, ממצאים ומסקנות או המלצות המתבטאים בחומר זה הם של המחברים ואינם משקפים בהכרח את עמדות הקרן הלאומית למדע.

<ol>
	<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li><li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue.">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li><li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus.">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+virus+infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias.">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history,+emergence,+biology,+and+prospects+for+control.">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes:+implications+for+anautogeny.">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li><li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting.">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li><li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti.">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li><li>Guerrero, D., Cantaert, T., Miss&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses.">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li><li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands.">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li><li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+(diptera:+Culicidae).">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li><li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission.">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li><li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li><li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia.">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li><li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti.">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li><li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans.">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li><li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus.">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li><li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka.">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).</li><li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glytube:+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).</li><li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil.">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li><li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+diets+for+mosquitoes.">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+stimuli+and+artificial+feeding.">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+response+in+Aedes+aegypti:+stimulation+by+adenosine+triphosphate.">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li><li>Jov&#233;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li><li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity.">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li><li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako,+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+(ATSB).">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).</li><li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+(L.)+(Diperta:+Culicidae).">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li><li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope.">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+SkitoSnack,+an+artificial+blood+meal+replacement,+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota.">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior.">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).</li><li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet.">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li><li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact.">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li><li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector,+Aedes+aegypti,+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand.">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).</li><li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiteOscope,+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior.">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עבור יישומי מעבדה רבים, מאכילי ממברנות מלאכותיות מציעים יתרונות ברורים בהשוואה למארחים חיים בכך שהם מאפשרים לחוקרים את היכולת לתפעל ישירות את תוכן הארוחה. למרות ששיטות מרובות זמינות להזנת קרום מלאכותי, השיטה המתוארת כאן מציעה יתרונות בגמישות, עלות ותפוקה. בהשוואה למאכילי קרום מסחריים אחרים, מבחני גליטוב דורשים נפח ארוחה קטן, מה שהופך אותו למנגנון אספקה יעיל עבור ריאגנטים יקרים, כולל תרופות או פתוגנים, על ידי מזעור הנפח הכולל הנדרש7,35. כמו גם מלוחים ללא חלבון וארוחות דם מלאכותיות לקדם engorgement, תרכובות או פתוגנים ניתן להוסיף לכל ארוחה כחלופה תפוקה גבוהה ולא פולשנית זריקות. בנוסף, ניתן לשטוף, להחליף או לשנות בקלות כל רכיב של גליטובה כדי לספק ולכמת סוגי ארוחות מרובים ללא זיהום צולב של מנגנון ההזנה.
כדי לכמת את נפחי הארוחות הנצרכים על ידי יתושים, השיטה המבוססת על פלואורסצנטיות מאפשרת כימות מדויק יותר של גודל הארוחה מאשר שקילה של היתושים לפני ואחרי האכלה. יש לציין כי שיטה זו היא חקירה נקודתית. לעומת זאת, שקילה מאפשרת לשמור על היתושים בחיים לניסויים נוספים. באמצעות קורא צלחות, ניתן לשנות בקלות את השיטה המבוססת על פלואורסצנטיות לכימות תפוקה גבוהה של ארוחות הנצרכות על ידי מאות נקבות בודדות.
כדי להשיג שיעורי הזנה גבוהים, שילוב של רמזים מארחים מספיק חייב להיות נוכח כדי להפעיל את ההתנהגות הנשית המארחת ולמשוך נקבות למאכיל. אם יתושים אינם מצטופפים מתחת לגלייטוב, ייתכן שהארוחה לא תחומם כראוי, או שמשלוח CO2 לא יספיק. הוספת ריח אנושי לפני השטח של הממברנה מגבירה באופן אמין את האטרקטיביות של הממברנה המלאכותית. אם יתושים נצפו מתחת לגליטוב אך אינם מצליחים להאכיל, הרכב הארוחה עשוי להיות אשם. הנקבות אינן רשאיות לאכול אם הארוחה עצמה אינה חמה, הדם ישן מדי, או אם התוספים לארוחה מרתיעים באופן מהותי או גורמים לתגובה כימית לא רצויה36. ATP נוסף גם מגדיל באופן אמין את שיעורי ההזנה וניתן לשנות את קנה המידה עד לריכוז סופי של 2 מ"מ בכל אחד מהמתכונים המסופקים. נקבות לא יכולות להאכיל אם הפרפילם לא נמשך מתוח על פני כובע גליטובה; הפרפילם צריך להיות שקוף באופן אחיד ולא צריך לקרוס, שכן זה מונע מהנקבה להיות מסוגל לנקב ביעילות את הפרפילם עם הסגנון שלה. אם הארוחה דולפת דרך גליטובה לרשת, ייתכן שהפרפילם נקרע במהלך תהליך המתיחה ויש להחליף אותו.
שינוי הרכב הארוחה יכול גם לאפשר לחוקרים לתפעל את משך הזמן הדרוש כדי לנקות את הארוחה מן midgut, כמו גם את ההתנהגות המארחת הבאים מחפש. הארוחות המוצגות כאן דורשות 24-36 שעות לעיכול7 בדומה לדם שמקורו בבעלי חיים. לאחר האכלה על כל הארוחות האלה, הנקבות ידכאו המארח מחפש במהלך חלון זמן העיכול. מכיוון שארוחת תמיסת מלח חסרה חלבון, הנקבות חוזרות למארחים לאחר פינוי הארוחה. אם חזרה מהירה יותר רצויה, החוקרים יכולים לבחור ארוחות מלוחות חלופיות "סליקה מהירה" המופרשות בכ 6 שעות27. בעוד ההרכב של הארוחה מלוחים המוצג כאן מותאם ישירות להשוות תוצאות עם ארוחת הדם המלאכותית, הארוחה "ניקוי מהיר" תואם באופן הדוק יותר את רמות המלח הפיזיולוגי נמצא בדם בעלי חוליות.
לשיטות המתוארות כאן יש מגבלות שיש לקחת בחשבון לפני בחירת ההסתעפות המתאימה ביותר למטרות הניסוי של החוקר. מדידות הפלואורסצנטין המתוארות אינן מאפשרות שימוש חוזר ביתושים לניסויים נוספים. עם זאת, מדידות משקל ניתן לבצע לפני כימות גודל הארוחה באמצעות מבחני פלואורסצנטין. אם משקל וגודל הארוחה עקביים על פני ניסויים מרובים לארוחה נתונה, משקל יכול לשמש פרוקסי בניסויים עתידיים. יתר על כן, פרוטוקול זה אינו מבחין בין ליקויים בהתנהגות המארחת לעומת האכלת הדם; יתושים המראים ליקויים במציאת מאכיל הממברנה יהיו ירידה בשיעורי האכלה ו / או גודל הארוחה. על ידי הוספת מצלמה כדי להקליט התנהגות לאורך כל ההסתערות, החוקרים יכולים לקבוע אם הנקבות לא יכולות למצוא את גליטובה, או אם הן מוצאות את גליטובה, אך אינן מזינות.
ניתן להתאים את ההסתעפות המתוארת כאן כדי לחקור שאלות רבות יוצאות דופן הקשורות להתנהגות האכלה אצל יתושים. לדוגמה, ניתן לחקור את תרומתם של חלבוני דם ספציפיים על ידי שינוי היחס בין חלבונים מרכיבים או ריכוז החלבון הכולל בארוחה המלאכותית בדם. כדי להעריך את גודל הארוחות מאירועי האכלה מרובים, ניתן להוסיף צבעים עם ספקטרום פלואורסצנטי מובהק כדי להבדיל בין ארוחות ממקורות ייחודיים37. פרוטוקול זה יכול גם להיות שונה כדי לעורר בנפרד את חלקי הפה הפנימיים המזהים דם ומשמשים לבליעה (כלומר, stylet), ואת נספחים כימוסנסוריים כי מגע העור (כלומר, labium, הרגליים) כמו אדמות יתוש להתחיל להאכילדם 36. לדוגמה, אם ליגנדים מתווספים ישירות לארוחה, הם אינם יוצרים קשר עם הלביום והרגליים, שכן הממברנה מנוקבת רק על ידי הסגנון. אם ליגנדים מתווספים לפני השטח החיצוניים של הפרפילם במקום, הם נשארים מופרדים מהארוחה וניתן ליצור קשר עם השפתיים והרגליים36. לבסוף, הקינטיקה המפורטת של התנהגות האכלת הדם אינה מובנת היטב ואת השיטה המוצגת כאן ניתן לשנות לשלב מעקב ברזולוציה גבוהה עם כלי למידת מכונה כדי לחלץ קריאות התנהגותיות של תנועה, יציבה, ודינמיקת האכלה38.
פרוטוקול זה נועד להיות ידידותי למשתמש וחסכוני, עם היכולת לשרת חוקרים המשתמשים במניפולציות תרופתיות וגנטיות כדי לחקור האכלת דם של יתושים והתנהגות שלאחר האכלת דם.

אנו מציגים פרוטוקול להאכלת ארוחות דם מותאמות ליתושים Aedes aegypti באמצעות מאכיל קרום מלאכותי ומדידה מדויקת של נפח הארוחה הנצרכת על ידי כל יתוש בודד. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בגמישות כדי לשנות את התוכן של הארוחה או להשוות את נפח הארוחה הנצרכת על ידי קבוצות ניסיוניות שונות של יתושים.
יתוש Ae. aegypti מאיים על הבריאות העולמית על ידי הפצת פתוגנים הגורמים למחלות כולל קדחת צהובה, קדחת דנגה, chikungunya, ו זיקה1,2,3,4,5. נקבות Ae. aegypti מחייבות מאכילי דם; הם חייבים לצרוך דם בעלי חוליות כדי להשיג את החלבון הדרוש להתפתחות הביצית, וכל מצמד ביצים דורש ארוחתדםמלאה לפחות ממארח אחד 6,7,8. היתוש הנשי נושך לראשונה את המארח שלה על ידי פירסינג העור עם סגנון שלה הזרקת רוק, אשר מכיל תרכובות המפעילות את התגובה החיסונית של המארח9. לאחר מכן היא ניזון על ידי שאיבת דם דרך הסגנון שלה לתוך midgut שלה. בזמן שהיא צורכת ארוחת דם ממארח נגוע, היא עלולה לבלוע פתוגנים המועברים בדם6,8, אשר לאחר מכן נודדים מן midgut של היתוש אל בלוטות הרוק שלה10. יתושים נקבה נגועים בדרך זו יכול להפיץ מחלות על ידי הזרקת פתוגנים יחד עם רוק כאשר נושך המארחים הבאים11,12. הבנה וכימות המנגנונים של התנהגות האכלת דם הם צעדים חיוניים בשליטה על העברת מחלות המועברות על ידי יתושים.
פרוטוקולי מעבדה רבים לגידול יתושים וניסויים משתמשים בבעלי חיים כולל עכברים, שרקנים או בני אדם כמקורדם 13,14,15,16. השימוש בבעלי חיים מטיל חששות אתיים כמו גם דרישות מורכבות להכשרת כוח אדם, דיור וטיפול בבעלי חיים, ועמידה במדיניות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). זה גם מגביל את סוגי תרכובות שניתן להעביר יתושים, אשר מגביל את המחקרים שניתן לבצע17.
מנגנוני הזנת דם מלאכותיים, אשר בדרך כלל משתמשים במערכת קרום כדי לדמות עור מארח, הם כלים שימושיים לחקר התנהגויות האכלת דם העוקפות את הצורך בשמירה על מארחים חיים. דם שלם ניתן לרכוש ממספר ספקים ולהאכיל יתושים באמצעות מחומם, מאכילי קרום מלאכותי מעיל מים או מכשירים דומים18,19. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש במאכילי קרום חד פעמיים קטנים המונחים "גליטובים". מאכיל קרום זה, שפורסם בעבר על ידי קוסטה דה סילבה ואח '(2013)20, ניתן להרכיב בקלות מציוד מעבדה סטנדרטי, מה שהופך אותו אידיאלי עבור אספקת ארוחות דם למספר מתון של יתושים וישיר כדי להגדיל את לבדיקת קבוצות גדולות יותר או ניסוחים ארוחה מרובים. Glytube היא חלופה זולה ויעילה מאכילים מלאכותיים מסחריים אחרים, אשר עשוי לדרוש נפחי ארוחות גדולים יותר והם מתאימים יותר עבור אצווה להאכיל קבוצות גדולות של יתושים על ניסוח ארוחה אחת21.
פרוטוקול זה כולל שני סעיפים: הכנה/אספקה של ארוחות מלאכותיות וכימות הצריכה. בחלק הראשון, גליטובים משמשים כאמצעי יעיל כדי לספק דיאטות מניפולציה. דם שלם עשוי להיות מוחלף בארוחה מלאכותית לחלוטין כדי להשוות את ההשפעות של תחליפי דם במקום ארוחת דם. מתכון מותאם קוגן (1990)22 מוצג כאן, אם כי ניסוחים ארוחה מלאכותית מרובים פותחו23,24. יתר על כן, האכלה היא שיטה פחות פולשנית ופחות מייגעת להציג תרכובות פרמקולוגיות מאשר הזרקה. בשל הנפח הכולל הנמוך הנדרש עבור כל ארוחה (1-2 מ"ל), פרוטוקול זה מספק שיטת משלוח אטרקטיבית כדי להפחית את כמויות ריאגנטים יקרים. Ae. נקבות aegypti צורכות בקלות ארוחות ללא חלבון של תמיסת מלח עם אדנוזין 5′-טריפוספט (ATP)25,26, אשר מספק בסיס למדידת ההשפעות של רכיבי ארוחה אחת. לדוגמה, נוירופפטיד Y כמו קולטן 7 (NPYLR7) ב Ae. aegypti ידוע לתווך דיכוי מחפש מארח לאחר ארוחת דם עשירה בחלבון, וכאשר אגוניסטים NPYLR7 מתווספים לארוחה מלוחה ללא חלבון, יתושים נקבה להפגין דיכוי מחפש מארח דומה לאלה שצרכו דם שלם7.
בחלק השני, צעדים לכימות הנפח של כל ארוחה הנצרכת על ידי יתוש נקבה בודדים מוצגים. בדיקה זו מבוססת פלואורסצנטיות ולוכדת את מעמד ההזנה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר שיטות שבהן נקבות מסווגות כ"מוזנות" או "unfed" בהתבסס על הערכה חזותית של התנפחות הבטן בלבד. על ידי הוספת פלואורסצנטין לארוחה לפני האכלה, נפחי הארוחות שנבלעו על ידי אנשים יכולים להיות מכמתים על ידי הומוגניזציה של כל יתוש בצלחת של 96 באר ומדידת עוצמת הפלואורסצנטיות כקריאה. בדיקה זו יכולה למדוד הבדלים במרץ האכלה בתגובה למשתנים כגון הרכב הארוחות או הרקע הגנטי של היתושים. כימות מדויק הוא קריטי עבור גדלי ארוחות ביניים, למשל כאשר הנקבות מוצעות ארוחות תת אופטימליות המכילות הרתעת האכלה או כאשר הם צורכים ארוחות סוכרוז בגדלים משתנים27. אם יתושים ניזונים נדרשים למבחנים התנהגותיים עוקבים לאחר כימות גודל הארוחה, ניתן לחשב את גודל הארוחה במקום זאת על ידי שקילה של נקבות מורדמות בקבוצות ולהעריך את המסה המוגברת הממוצעת לאדם. למרות שפחות מדויק מסימון פלואורסצנטין, שקילה עדיין מספקת הערכה מצטברת של נפח הארוחות ומאפשרת לבחון את השפעת הארוחה על תהליכים במורד הזרם, כגון פוריות או משיכה מארחת עוקבת. בעוד גודל ארוחת הדם משתנה והוא יכול להיות מושפע על ידי מספר עצום של גורמים11,28,29, בלע את גודל הארוחה נמדד עם השיטות המתוארות כאן עולים בקנה אחד עם כימותיםקודמים 7,30,31.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

נקבות ממין יתושים מסוימים יכולות להפיץ מחלות תוך נשיכת מארחי בעלי חוליות כדי להשיג ארוחות דם עשירות בחלבון הנדרשות להתפתחות ביצים. במעבדה, חוקרים יכולים לספק ארוחות דם שמקורן בבעלי חיים ומלאכותיות ליתושים באמצעות מאכילי קרום, המאפשרים מניפולציה של הרכב הארוחות. כאן, אנו מציגים שיטות להאכלת דם וארוחות דם מלאכותיות ליתושים Aedes aegypti וכימות הנפח הנצרך על ידי נקבות בודדות.
האכלה ממוקדת וכימות של ארוחות מלאכותיות /דם יש שימושים נרחבים, כולל בדיקת ההשפעות של מרכיבי ארוחה על התנהגות יתושים ופיזיולוגיה, אספקת תרכובות פרמקולוגיות ללא הזרקה, והדבקת יתושים עם פתוגנים ספציפיים. הוספת צבע פלואורסצנטי לארוחה לפני האכלה מאפשרת כימות גודל הארוחה הבאים. נפח הארוחה הנצרכת על ידי יתושים ניתן למדוד גם לפי משקל, אם הנקבות ישמשו מאוחר יותר לניסויים התנהגותיים, או על ידי הומוגניזציה של נקבות בודדות בצלחות 96 באר ומדידת רמות פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחת כמו בדיקת נקודת קצה. כימות גודל הארוחה יכול לשמש כדי לקבוע אם שינוי מרכיבי הארוחה משנה את נפח הארוחה לבלוע או אם צריכת הארוחה שונה בין זני יתושים. כימות מדויק של גודל הארוחה הוא קריטי גם למבחנים במורד הזרם, כגון אלה המודדים השפעות על משיכה מארחת או על פוריות. השיטות המוצגות כאן יכולות להיות מותאמות עוד יותר כדי לעקוב אחר עיכול הארוחות במהלך הימים או לכלול סמנים בולטים מרובים שנוספו לארוחות שונות (כמו צוף ודם) כדי לכמת את הצריכה של כל ארוחה על ידי יתוש אחד.
שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לבצע לבדו מדידות תפוקה גבוהה כדי להשוות את נפח הארוחות הנצרך על ידי מאות יתושים בודדים. כלים אלה יהיו אפוא שימושיים באופן נרחב לקהילת חוקרי היתושים למענה על שאלות ביולוגיות מגוונות.

איור 1 מציג סכמטי להרכבת ה-Glytube, ואילו איור 2 מציג סקירה כללית של העיצוב הניסיוני למדידת גודל הארוחה באמצעות ההסתעפות המבוססת על פלואורסצנטיות המתוארת כאן. איור 3 מספק מדידות מייצגות של גודל ארוחות פלואורסצנטיות מניסוי להזנת דם. איור 4, איור 5 ואיור 6 ממחישים מדגם של שאלות ביולוגיות שניתן לטפל בהן באמצעות פרוטוקול זה. היישומים של הפרוטוקול הם נרחבים וכוללים שינוי הרכב ארוחות הדם, האכלת תרכובות תרופתיות, כימות מדויק של ארוחות דם תת אופטימליות או ארוחות צוף קטנות יותר, והשוואת התנהגות האכלה על פני גנוטיפים יתושים.
כדי ליצור עקומה סטנדרטית לחישוב נפח הארוחות, קריאות הפלואורסצנטיות מותוות מבארות הייחוס הייעודיות שכל אחת מהן מכילה יתוש לא מזוהה ונפח ידוע של הארוחה עם 0.002% פלואורסצנטין(איור 3A). קריאות פלואורסצנטיות מהבארות הנותרות, המכילות יתושים מקבוצת הביקורת השלילית של יתושים לא משוחדים או מקבוצת היתושים הניסיונית שהציעה ארוחה, מושווים לעקומה סטנדרטית זו כדי לכמת את נפח הארוחות (μL) הנצרך על ידי כל יתוש(איור 3B). כדי לאמת את הקריאות הבסיסיות במבחן זה, יש לאשר כי יתושים מקבוצת הביקורת השלילית unfed אינם מוקצים ערך חיובי של μL הנצרך (איור 3B, שמאל). למרות שלכל הנקבות בקבוצת הניסוי הוצעה ארוחת הדם, חלק מהיתושים האכילו(איור 3B, אמצע)וחלקם לא (איור 3B, נכון). תוצאה זו מוכיחה כי ניתן לקבל שני סוגים של נתונים מפרוטוקול זה: 1) אחוז הנשים הכוללות הניזנות מארוחה נתונה, ו -2) הנפח שנבלע על ידי הנקבות הניזונים מארוחה נתונה.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לספק ולכמת ארוחות עם קומפוזיציות חלבון שונות. איור 4A,B מציג נתונים שנאספו באמצעות ארוחות עם פלואורסצנטין נוסף. שיעור היתושים שהאכילו ונפח הארוחות שהם בלעו, בהתאמה, חושבו מקריאות הפלואורסצנטיות. קריאות אלה רגישות מאוד ומאפשרות כימות מדויק של μL, אך יש להן מגבלה שלא ניתן להשתמש ביתושים לניסויים חיים עתידיים. איור 4C,D מציג נתונים שנאספו מניסוי עצמאי עם יתושים שקיבלו ציון של מזון או unfed על ידי העין לאחר שהוצעו להם ארוחות ללא פלואורסצנטין. גודל הארוחה חושב כמשקל ממוצע / נקבה מקבוצות של 5 יתושים. למרות שמדידות משקל אלה רגישות פחות ממדידות פלואורסצנטיות, הן מאפשרות לנקבות להתאושש ולהשתמש בהן לניסויים חיים נוספים. שיעור היתושים הניזונים יכול להשתנות בימים ניסיוניים שונים, כפי שמשתקף באיור 4A ובאיור 4C.
איור 5 מראה את הנפח הנצרך של ארוחות המכילות תרופות המווסתות התנהגות של מארח יתושים. בניסויים אלה, הנקבות הוצעו דם, מלוחים + ATP, או מלוחים + ארוחות ATP עם 100 מיקרומטר של אגוניסט קולטן NPY Y2 האנושי, TM30338. תרופה זו משנה התנהגות המארח מחפש באמצעות הפעלה של Ae. aegypti NPY כמו קולטן 7. מדידת גודל הארוחות היא קריטית עבור הפרשנות של ניסויים כדי להעריך את ההשפעה של תרופה זו על התנהגות לאחר האכלת דם כי זה מאפשר לחוקר לחשב את המינון הנצרך על ידי כל נקבה.
בדוגמאות הקודמות הוזנו הנקבות בדם או בארוחות דם חלופיות, שכולן הביאו לארוחות של 3-5 מיקרומטר(איור 3, איור 4, איור 5). ניתן להשתמש בפקודה מבוססת פלואורסצנטיות זו גם למדידת גדלי ארוחות קטנים יותר ו/או משתנים יותר שלא ניתן להבחין בהם במדויק ממדידות המשקל הקבוצתי הממוצעות. באיור 6, אותו פרוטוקול כימות פלואורסצנטי שימש למדידת התנהגות האכלת צוף על ידי החלפת גליטוב לכדור צמר גפן רווי ב-10% סוכרוז המכיל 0.002% פלואורסצנטין. סוכרי צוף לא ניתן להציג ב- Glytube assay כי הנקבות לא יכול לזהות את נוכחותם של סוכרים צוף עם סגנון ולא ליזום האכלה27. נתונים אלה מאפשרים לחוקר לקבוע כי ארוחות הסוכר קטנות באופן עקבי מארוחות דם, בהתאם לעבודההקודמת 34 (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> איור 1: הגדרת שיטת גליטוב המשמשת להזנת ארוחות ליתושים. (A)סכמטי של גליטובה מפורקת המשמשת להזנת דם וארוחות אחרות ליתושים. (B)סכמטי של גליטובה הציג על גבי מיכל של יתושים עם מכסה רשת. נקבת יתושים יכולה לנקב דרך מכסה הרשת כדי להאכיל. (ג)תצלומים של הגליטובה (למעלה), ונקבת יתושים Aedes aegypti לפני, במהלך ואחרי האכלה (למטה, משמאל לימין) על ארוחה שנמסרה על ידי גליטובה. יתושים מוצגים פירסינג דרך הרשת מכסה את המיכל שלהם כדי לגשת מאכיל הממברנה. (ד)תצלומים המראים את המראה של יתושים Ae. aegypti נקבה כי הם unfed (שמאל) וכי יש engorged על ארוחת דם מלאכותית (ימין, למעלה) או מלוחים + ארוחת ATP (ימין, למטה). שיטת גליטובה פורסמה בעבר בקוסטה-דה-סילבה ואח ' (2013)20. הצילומים ב-( C) ו- (D) באדיבות אלכס ויילד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> איור 2: סכמטי כיצד לכמת את גודל הארוחה לאחר פרוטוקול האכלת הדם של גליטוב. (A)יתושים מוצעים ארוחה עם פלואורסצנטין (למעלה, קבוצת ניסיוני) או לא ארוחה (למטה, קבוצת ביקורת שלילית unfed). (B)יתושים בודדים מתווספים לצלחת של 96 באר לאחר סיום ניסוי ההאכלה. (C) עקומה סטנדרטית נוצרת באמצעות כמויות ידועות של ארוחה המכילה 0.002% פלואורסצנטין. (D)יתושים הם הומוגניים כדי לשחרר את כל פלואורסצנטין נצרך, ורמות פלואורסצנטיות בכל באר מכמתים באמצעות קורא צלחת. שיטת כימות פלואורסצנטיות זו משתנה מ- Liesch et al. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> איור 3: ניסוי האכלת דם של גליטובה עם כימות מבוסס פלואורסצנטין. (A)מדידות עקומה סטנדרטיות שהתקבלו מהבארות שבהן יתוש מקבוצת הביקורת unfed התווסף לכמות ידועה של ארוחה המכילה 0.002% פלואורסצנטין (סולם ציר y = יחידות שרירותיות). (ב)נפח הארוחה מחושב באמצעות קריאות פלואורסצנטיות לנקבות בקבוצת הביקורת unfed (שמאל, שחור, n = 40), הקבוצה הניסיונית שניזונה מדם (אמצע, אדום, n = 37), וקבוצת הניסוי שלא ניזון מדם (ימין, אדום, n = 23). כל נקודה מייצגת מדידה של נקבה בודדת. הנתונים מוצגים כחציון עם טווח. מכתבים מצביעים על קבוצות שונות סטטיסטית, מבחן קרוסקל-וואליס עם ההשוואה המרובת של דאן, p<0.01. נתונים אלה פורסמו ב Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> איור 4: כימות ארוחות עם הרכב חלבונים שונה. לנקבות הוצעו ארוחות של דם כבשים (אדום), דם מלאכותי עם חלבוני דם אנושיים (קוגן (1990)22) (כתום), או מלוחים ללא חלבון + ארוחת ATP (אקווה)7. (A)אחוז הנקבות שניזונו מציון באמצעות קריאות פלואורסצנטיות. כל נקודה מייצגת קבוצה של 12-16 נקבות. הנתונים מוצגים כחציבונים עם טווחים, n = 12. (B) נפח הארוחה מחושב באמצעות קריאות פלואורסצנטיות. כל נקודה מייצגת מדידה של נקבה בודדת במשפט אחד מאיור 4A. הנתונים מוצגים כחציבונים עם טווחים, n = 12. (ג)אחוז הנקבות ספוג לחלוטין לאחר הזנת קרום מלאכותי, הבקיע על ידי העין. כל נקודה מייצגת את אחוז הנקבות המחולקות מקבוצות של 20-30 נקבות. הנתונים מוצגים כחציבונים עם טווחים, n = 23. (D)מידות הארוחה הבקיע כמשקל / נקבה לאחר מצב האכלה היה הבקיע על ידי העין. משקולות חושבו כממוצע של קבוצות של 5 יתושים. הנתונים מוצגים כחציבונים עם טווחים, n = 23. A–D: אותיות מצביעות על קבוצות שונות סטטיסטית, מבחן קרוסקל-וואליס עם ההשוואה המרובות של דאן, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> איור 5: כימות ארוחות בתרכובות תרופתיות. נקבות צורכות ארוחות באותו גודל של דם כבשים (אדום), מלוחים + ATP (אקווה), מלוחים + ATP + 100 מינון מיקרומטר של אגוניסט קולטן NPY Y2 אנושי TM30338 (כחול כהה). נפח הארוחות מחושב באמצעות קריאות פלואורסצנטיות. כל נקודה מייצגת מדידה של נקבה בודדת. הנתונים מוצגים כחציבונים עם טווחים, n = 12. מכתבים מצביעים על קבוצות שונות סטטיסטית, מבחן קרוסקל-וואליס עם ההשוואה המרובת של דאן, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> איור 6: כימות ארוחות צוף קטנות יותר. (A)סכמטי של מבחני האכלת צוף. (B) נפח הארוחה מחושב באמצעות קריאות פלואורסצנטיות עבור נקבות מסוג בר הציע ארוחות של מים או (כחול, n = 36) או 10% סוכרוז (ירוק, n = 53), כל אחד עם 0.002% פלואורסצנטין, בצריף האכלה מבחנים. כל נקודה מייצגת מדידה של נקבה בודדת. הנתונים מוצגים כחציון עם טווחים. מכתבים מצביעים על קבוצות שונות סטטיסטית, מבחן מאן-וויטני, p<0.05. נתונים אלה פורסמו ב Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">ארוחת דם מלאכותית</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ריכוז תמיסת מלאי (מ"ג/מ"ל)</td>
			<td>נפח של פתרון מלאי בארוחה (μL / מ"ל)</td>
			<td>ריכוז ארוחה סופי (מ"ג/מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">רכיבי חלבון*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-גלובולין</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>המוגלובין</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלבומין (שם)</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ חלבון</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">רכיבים שאינם חלבונים</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ריכוז פתרון מלאי (mM)</td>
			<td>נפח של פתרון מלאי בארוחה (μL / מ"ל)</td>
			<td>ריכוז הארוחה הסופית (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>במניית γ גלובולין</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>נהקו3
</td>
			<td>במניית γ גלובולין</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*רכיבי החלבון מוכנים בתמיסת מלאי של מים מזוקקים כפולים, למעט γ-גלובולין, המומסים ב-400 מ"מ NaHCO3 וכוללים כמות משתנה של NaCl (2-4%) במוצר.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מתכון להכנת ארוחות דם מלאכותיות (מותאם מקוגן (1990)22). דם מלאכותי מורכב מרכיבי חלבון ולא חלבון המצויים באופן קבוע בדם אנושי ומספק את האפשרות לשנות את היחסים בין רכיבים אלה. יתושים יכולים לייצר ביצים לאחר האכלה עלדםמלאכותי 7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">ארוחה מלוחה</td>
		</tr>
<tr>
<td>רכיב</td>
			<td>ריכוז פתרון מלאי (mM)</td>
			<td>נפח של פתרון מלאי בארוחה (μL / מ"ל)</td>
			<td>ריכוז הארוחה הסופית (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>נהקו3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: מתכון לארוחה מלוחה עם ATP (מותאם מ-Duvall et al. (2019)7). ניתן להשתמש בארוחות מלוחות נטולות חלבונים כדי לספק תרכובות מעניינות ליתושים ועדיין לחקות את התפזרות הבטן המתרחשת לאחר האכלת הדם, אך מבלי לעורר את התפתחות הביצית המתרחשת כאשר חלבונים נבלעים.

Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

מטרת פרוטוקול זה היא לספק ארוחות דם שמקורן בבעלי חיים ומלאכותיות ליתושים Aedes aegypti באמצעות מאכיל קרום מלאכותי ולכמת במדויק את נפח הארוחה שנבלעה.

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...