Name: feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-10-22T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Ringraziamo Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai e Trevor Sorrells per i commenti sui manoscritti, e Zhongyan Gong e Kyrollos Barsoum per l'assistenza tecnica. Ringraziamo Alex Wild per le fotografie utilizzate nella Figura 1. K.V. è stato supportato dalla borsa di dottorato Boehringer Ingelheim Fonds. V.J. è stato supportato in parte da NIH T32-MH095246. Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione alla Rockefeller University dall'Howard Hughes Medical Institute attraverso il programma James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study a V.J. Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program nell'ambito del Grant No. Da NSF DGE-1325261 a V.J. Le opinioni, i risultati e le conclusioni o raccomandazioni espressi in questo materiale sono quelli dell'autore o degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per molte applicazioni di laboratorio, gli alimentatori a membrana artificiale offrono benefici distinti rispetto agli host dal vivo consentendo ai ricercatori la possibilità di manipolare direttamente il contenuto del pasto. Sebbene siano disponibili più metodi per l'alimentazione artificiale a membrana, il metodo descritto qui offre vantaggi in termini di flessibilità, costi e produttività. Rispetto ad altri alimentatori commerciali a membrana, il saggio Glytube richiede un piccolo volume di pasti, rendendolo un meccanismo di consegna efficiente per costosi reagenti, compresi farmaci o agenti patogeni, riducendo al minimo il volume totalerichiesto 7,35. Poiché sia i pasti del sangue salino che artificiali esenti da proteine promuovono l'ingorgemento, composti o agenti patogeni possono essere aggiunti a entrambi i pasti come alternativa ad alta produttività e non invasiva alle iniezioni. Inoltre, ogni componente del Glytube può essere facilmente lavato, sostituito o scalato per fornire e quantificare più tipi di pasto senza contaminazione incrociata dell'apparato di alimentazione.
Per quantificare i volumi di pasti consumati dalle zanzare, il metodo a base di fluorescenza consente una quantificazione delle dimensioni dei pasti più precisa rispetto alla pesatura delle zanzare prima e dopo l'alimentazione. Va notato che questo metodo è un saggio del punto finale. Al contrario, la pesatura consente di mantenere in vita le zanzare per ulteriori sperimentazioni. Utilizzando un lettore di piastre, il metodo a base di fluorescenza può essere facilmente scalato per una quantificazione ad alta produttività dei pasti consumati da centinaia di singole femmine.
Per ottenere alti tassi di alimentazione, deve essere presente una combinazione di segnali host sufficienti per attivare il comportamento femminile in cerca di ospite e attirare le femmine nell'alimentatore. Se le zanzare non si affollano sotto il Glytube, il pasto potrebbe non essere riscaldato correttamente o la consegna di CO2 potrebbe non essere sufficiente. L'aggiunta di odore umano alla superficie della membrana aumenta in modo affidabile l'attrattiva della membrana artificiale. Se le zanzare vengono osservate sotto il Glytube ma non riescono a nutrirsi, la composizione del pasto potrebbe essere difettosa. Le femmine non possono nutrirsi se il pasto stesso non è caldo, il sangue è troppo vecchio o se gli additivi al pasto sono intrinsecamente avversi o causano una reazione chimicaindesiderabile 36. L'ATP aggiuntivo aumenta anche in modo affidabile i tassi di alimentazione e può essere scalato fino a una concentrazione finale di 2 mM in ciascuna delle ricette fornite. Le femmine non possono nutrirsi se il parafilm non viene tirato teso attraverso il tappo di Glytube; il parafilm dovrebbe essere uniformemente trasparente e non dovrebbe allacciarsi, in quanto ciò impedisce alla femmina di essere in grado di perforare efficacemente il parafilm con il suo stile. Se il pasto perde attraverso il Glytube sulla rete, il parafilm potrebbe aver strappato durante il processo di stiramento e deve essere sostituito.
Cambiare la composizione del pasto può anche consentire ai ricercatori di manipolare il periodo di tempo necessario per cancellare il pasto dal midgut e il successivo comportamento di ricerca dell'ospite. I pasti qui presentati richiedono 24-36 ore per ladigestione 7 simili al sangue di origine animale. Dopo essersi nutrite di uno di questi pasti, le femmine sopprimono la ricerca dell'ospite durante la finestra del tempo di digestione. Poiché il pasto salino manca di proteine, le femmine tornano alla ricerca dell'ospite dopo che il pasto è stato eliminato. Se è auspicabile un ritorno più veloce, i ricercatori possono scegliere pasti salini alternativi "quick clearing" che vengono escreti in circa 6 h27. Mentre la composizione del pasto salino qui presentato è abbinata per confrontare direttamente i risultati con la farina di sangue artificiale, il pasto di "pulizia rapida" corrisponde più strettamente ai livelli fisiologici di sale trovati nel sangue vertebrato.
I metodi qui descritti hanno limitazioni che dovrebbero essere prese in considerazione prima di selezionare il saggio più adatto agli obiettivi sperimentali del ricercatore. Le misurazioni della fluoresceina descritte non consentono di utilizzare nuovamente le zanzare per ulteriori sperimentazioni. Tuttavia, le misurazioni del peso possono essere effettuate prima della quantificazione delle dimensioni dei farine utilizzando il saggio sulla fluoresceina. Se il peso e le dimensioni dei pasti sono coerenti in più prove per un determinato pasto, il peso può essere utilizzato come proxy negli esperimenti futuri. Inoltre, questo protocollo non distingue tra deficit nella ricerca dell'ospite rispetto al comportamento di alimentazione del sangue; le zanzare che mostrano compromissioni nella ricerca dell'alimentatore a membrana avranno una riduzione dei tassi di alimentazione e / o delle dimensioni dei pasti. Aggiungendo una fotocamera per registrare il comportamento durante il test, i ricercatori possono determinare se le femmine non riescono a trovare il Glytube, o se trovano il Glytube, ma non si nutrono.
Il saggio descritto qui può essere adattato per esplorare molte domande in sospeso relative al comportamento alimentare nelle zanzare. Ad esempio, il contributo di specifiche proteine del sangue può essere esplorato alterando il rapporto tra proteine costituenti o concentrazione totale di proteine nella farina di sangue artificiale. Per valutare le dimensioni dei pasti da più eventi di alimentazione, è possibile aggiungere coloranti con spettri di fluorescenza distinti per differenziare i pasti da fontiuniche 37. Questo protocollo può anche essere modificato per stimolare separatamente le parti interne della bocca che rilevano il sangue e che vengono utilizzate per l'ingestione (cioè stylet), e le appendici chemiosensoriche che contattano la pelle (cioè laboratorio, gambe) mentre la zanzara atterra per iniziare l'alimentazione delsangue 36. Ad esempio, se i ligandi vengono aggiunti direttamente al pasto, non contattano il labium e le gambe, poiché la membrana viene perforata solo dallo stile. Se invece i ligandi vengono aggiunti alla superficie esterna del parafilm, rimangono separati dal pasto e possono essere contattati dal labium e dalle gambe36. Infine, la cinetica dettagliata del comportamento di alimentazione del sangue non è ben compresa e il metodo qui presentato potrebbe essere modificato per combinare il tracciamento ad alta risoluzione con strumenti di apprendimento automatico per estrarre letture comportamentali della locomozione, della postura e della dinamica dialimentazione 38.
Questo protocollo ha lo scopo di essere user-friendly ed economico, con la capacità di servire i ricercatori che impiegano manipolazioni farmacologiche e genetiche per studiare l'alimentazione del sangue delle zanzare e il comportamento post-emoderinazione.

Presentiamo un protocollo per l'alimentazione di pasti nel sangue modificati alle zanzare Aedes aegypti utilizzando un alimentatore a membrana artificiale e misurando con precisione il volume del pasto consumato da ogni singola zanzara. Questo protocollo può essere adattato in modo flessibile per alterare il contenuto del pasto o per confrontare il volume del pasto consumato da diversi gruppi sperimentali di zanzare.
La zanzara Ae. aegypti minaccia la salute globale diffondendo agenti patogeni che causano malattie tra cui febbre gialla, febbre dengue, chikungunya e Zika1,2,3,4,5. Ae. le femmine di aegypti sono emoderizzatrici obbligate; devono consumare sangue vertebrato per ottenere la proteina necessaria per lo sviluppo delle uova e ogni frizione di uova richiede un pasto a sangue pieno da almeno un ospite6,7,8. La zanzara femmina morde per la prima volta il suo ospite perforando la pelle con il suo stile e iniettando saliva, che contiene composti che innescano la risposta immunitaria dell'ospite9. Quindi si nutre pompando sangue attraverso il suo stile nel suo midgut. Durante il consumo di un pasto di sangue da un ospite infetto, può ingerire agenti patogeni trasmessi dalsangue 6,8, che poi migrano dal midgut della zanzara alle sue ghiandole salivari10. Le zanzare femminili infettate in questo modo possono diffondere malattie iniettando agenti patogeni insieme alla saliva quando mordeno ospitisuccessivi 11,12. Comprendere e quantificare i meccanismi del comportamento di alimentazione del sangue sono passaggi cruciali per controllare la trasmissione delle malattie trasmesse dalle zanzare.
Molti protocolli di laboratorio per l'allevamento e la sperimentazione delle zanzare utilizzano animali vivi tra cui topi, porcellini d'India o esseri umani come fontedi sangue 13,14,15,16. L'uso di animali vivi impone preoccupazioni etiche e requisiti complessi per la formazione del personale, l'alloggio e la cura degli animali e il rispetto delle politiche del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). Limita anche i tipi di composti che possono essere consegnati alle zanzare, il che limita gli studi che possono essere effettuati17.
Gli apparati artificiali per l'alimentazione del sangue, che in genere utilizzano un sistema a membrana per simulare la pelle ospite, sono strumenti utili per studiare i comportamenti di alimentazione del sangue che eludeno la necessità di migliorare la necessità di ospitare ospiti vivi. Il sangue intero può essere acquistato da un certo numero di venditori e alimentato alle zanzare utilizzando alimentatori a membrana artificiale riscaldati e con giacca ad acqua o dispositivisimili 18,19. In questo protocollo, dimostriamo l'uso di piccoli alimentatori a membrana usa e getta chiamato "Glytubes". Questo alimentatore a membrana, precedentemente pubblicato da Costa-da-Silvaet al. Il Glytube è un'alternativa economica ed efficiente ad altri alimentatori artificiali commerciali, che possono richiedere volumi di pasto maggiori e sono più adatti per l'alimentazione in lotti di grandi gruppi di zanzare su una singola formulazione dipasto 21.
Questo protocollo comprende due sezioni: preparazione/consegna di pasti artificiali e quantificazione del consumo. Nella prima sezione, i Glytube vengono utilizzati come mezzo efficiente per fornire diete manipolate. Il sangue intero può essere sostituito con un pasto interamente artificiale per confrontare gli effetti dei sostituti del sangue al posto di una farina di sangue. Una ricetta adattata da Kogan (1990)22 è presentata qui, anche se molteplici formulazioni di pasti artificiali sono statesviluppate 23,24. Inoltre, l'alimentazione è un metodo meno invasivo e meno laborioso per introdurre composti farmacologici rispetto all'iniezione. A causa del basso volume totale richiesto per ogni pasto (1-2 mL), questo protocollo fornisce un metodo di consegna interessante per ridurre le quantità di reagenti costosi. Le femmine di Aegypti consumano prontamente pasti privi di proteine di soluzione salina con adenosina 5′-trifosfato (ATP)25,26, che fornisce una linea di base per misurare gli effetti dei singoli componenti del pasto. Ad esempio, il recettore simile a Neuropeptide Y 7 (NPYLR7) in Ae. aegypti è noto per mediare la soppressione in cerca di ospite dopo un pasto sanguigno ricco di proteine, e quando gli agonisti NPYLR7 vengono aggiunti a un pasto salino privo di proteine, le zanzare femminili mostrano una soppressione in cerca di ospiti simile a quelle che hanno consumatosangue intero 7.
Nella seconda sezione vengono presentati i passaggi per quantificare il volume di ogni pasto consumato da una singola zanzara femmina. Questo saggio è a base di fluorescenza e cattura lo stato di alimentazione in una risoluzione più elevata rispetto ai metodi in cui le femmine sono classificate come "nutrite" o "non nutrite" sulla base della sola valutazione visiva della distensione addominale. Aggiungendo fluoresceina al pasto prima dell'alimentazione, i volumi di farina ingeriti dagli individui possono essere quantificati omogeneizzando ogni zanzara in una piastra da 96 pozze e misurando l'intensità della fluorescenza come lettura. Questo saggio può misurare le differenze nel vigore alimentare in risposta a variabili come la composizione dei pasti o il background genetico delle zanzare. Una quantificazione precisa è fondamentale per le dimensioni intermedie delle farine, ad esempio quando alle femmine vengono offerti pasti non ottimale contenenti deterrenti per l'alimentazione o quando consumano pasti di saccarosio di dimensionivariabili 27. Se le zanzare nutrite sono necessarie per i successivi test comportamentali dopo la quantificazione delle dimensioni dei pasti, la dimensione del pasto può invece essere calcolata pesando le femmine anestetizzate in gruppi e stimando la massa media aumentata per individuo. Sebbene meno precisa della marcatura della fluoresceina, la pesatura fornisce ancora una stima aggregata del volume dei farine e consente di esaminare l'effetto del pasto sui processi a valle, come la fecondità o la successiva attrazione ospite. Mentre la dimensione delle farine nel sangue è variabile e può essere influenzata da una miriadedi fattori 11,28,29, le dimensioni ingerite delle farine misurate con i metodi qui descritti sono coerenti con le precedentiquantificazioni 7,30,31.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Le femmine di alcune specie di zanzare possono diffondere malattie mentre mordeno ospiti vertebrati per ottenere pasti nel sangue ricchi di proteine necessari per lo sviluppo delle uova. In laboratorio, i ricercatori possono fornire pasti di sangue di origine animale e artificiale alle zanzare tramite alimentatori a membrana, che consentono la manipolazione della composizione dei pasti. Qui presentiamo metodi per nutrire sangue e pasti artificiali alle zanzare Aedes aegypti e quantificare il volume consumato dalle singole femmine.
L'alimentazione mirata e la quantificazione degli alimenti artificiali / ematici hanno ampi usi, tra cui testare gli effetti dei componenti dei pasti sul comportamento e sulla fisiologia delle zanzare, fornire composti farmacologici senza iniezione e infettare le zanzare con agenti patogeni specifici. L'aggiunta di colorante di fluoresceina al pasto prima dell'alimentazione consente una successiva quantificazione delle dimensioni del pasto. Il volume del pasto consumato dalle zanzare può essere misurato in peso, se le femmine devono essere utilizzate in seguito per esperimenti comportamentali, o omogeneizzando le singole femmine in piastre da 96 pozzetti e misurando i livelli di fluorescenza usando un lettore di piastre come test finale. La quantificazione delle dimensioni dei pasti può essere utilizzata per determinare se la modifica dei componenti del pasto altera il volume del pasto ingerito o se il consumo di pasti differisce tra i ceppi di zanzare. Una quantificazione precisa delle dimensioni dei pasti è fondamentale anche per i saggi a valle, come quelli che misurano gli effetti sull'attrazione o sulla fecondità dell'ospite. I metodi qui presentati possono essere ulteriormente adattati per tenere traccia della digestione dei pasti nel corso dei giorni o per includere più marcatori distinguibili aggiunti a pasti diversi (come nettare e sangue) per quantificare il consumo di ogni pasto da parte di una singola zanzara.
Questi metodi consentono ai ricercatori di eseguire da solo misurazioni ad alta produttività per confrontare il volume dei pasti consumato da centinaia di zanzare individuali. Questi strumenti saranno quindi ampiamente utili alla comunità dei ricercatori di zanzare per rispondere a diverse domande biologiche.

La figura 1 presenta uno schema per l'assemblaggio del Glytube, mentre la figura 2 mostra una panoramica del progetto sperimentale per misurare le dimensioni dei pasti utilizzando il saggio a base di fluorescenza qui descritto. La figura 3 fornisce misurazioni rappresentative delle dimensioni delle farine di fluoresceina da un esperimento di alimentazione del sangue. La figura 4, la figura 5e la figura 6 illustrano un campione di questioni biologiche che possono essere affrontate utilizzando questo protocollo. Le applicazioni del protocollo sono ad ampio raggio e includono l'alterazione della composizione delle farine nel sangue, l'alimentazione di composti farmacologici, la quantificazione precisa degli esami del sangue non ottimali o dei pasti di nettare più piccoli e il confronto del comportamento alimentare tra i genotipi delle zanzare.
Per generare una curva standard per i calcoli del volume dei pasti, le letture della fluorescenza vengono tracciate dai pozzi di riferimento designati, ciascuno contenente una zanzara non fed e un volume noto del pasto con 0,002% di fluoresceina (Figura 3A). Le letture di fluorescenza dai pozzi rimanenti, che contengono zanzare del gruppo di controllo negativo delle zanzare non fed o del gruppo sperimentale di zanzare offerte un pasto, vengono confrontate con questa curva standard per quantificare il volume del pasto (μL) consumato da ogni zanzara (Figura 3B). Per convalidare le letture di base in questo saggio, va confermato che alle zanzare del gruppo di controllo negativo non pari a unfed non viene assegnato un valore positivo di μL consumato (Figura 3B, sinistra). Sebbene a tutte le femmine del gruppo sperimentale sia stata offerta la farina di sangue, alcune zanzare si sononutrite (figura 3B, al centro)e alcune no(figura 3B, a destra). Questo risultato dimostra che due tipi di dati possono essere ottenuti da questo protocollo: 1) la percentuale di femmine totali che si nutrono di un dato pasto e 2) il volume ingerito dalle femmine che si nutrono di un dato pasto.
Questo protocollo può essere utilizzato per fornire e quantificare pasti con varie composizioni proteiche. La figura 4A,B mostra i dati raccolti utilizzando i pasti con fluoresceina aggiunta. La proporzione di zanzare che si nutrivano e il volume dei pasti che ingerivano, rispettivamente, sono stati calcolati dalle letture della fluorescenza. Queste letture sono altamente sensibili e consentono una quantificazione precisa di μL, ma hanno la limitazione che le zanzare non possono essere utilizzate per futuri esperimenti dal vivo. La figura 4C,D mostra i dati raccolti da un esperimento indipendente con zanzare che sono state segnate come nutrite o non alimentate a occhio dopo che sono stati offerti pasti senza fluoresceina. La dimensione del pasto è stata calcolata come peso medio / femmina da gruppi di 5 zanzare. Sebbene queste misurazioni del peso siano meno sensibili delle misurazioni della fluorescenza, consentono alle femmine di essere recuperate e utilizzate per ulteriori sperimentazioni dal vivo. La percentuale di zanzare che si nutrono può variare in diversi giorni sperimentali, come si riflette nella figura 4A e nella figura 4C.
La figura 5 mostra il volume consumato di pasti contenenti farmaci che regolano il comportamento di ricerca di ospiti di zanzare. In questi esperimenti, alle femmine sono stati offerti pasti di sangue, soluzione salina + ATP o salina + ATP con 100 μM dell'agonista del recettore NPY Y2 umano, TM30338. Questo farmaco altera il comportamento di ricerca dell'ospite attraverso l'attivazione del recettore Ae. aegypti NPY-like 7. Misurare le dimensioni dei pasti è fondamentale per l'interpretazione degli esperimenti per valutare l'effetto di questo farmaco sul comportamento post-alimentazione del sangue perché consente al ricercatore di calcolare la dose consumata da ogni femmina.
Negli esempi precedenti, le femmine venivano nutrite con sangue o pasti nel sangue sostitutivi, che hanno portato tutti a pasti da 3 a 5 μL(figura 3, figura 4, figura 5). Questo saggio a base di fluorescenza può anche essere utilizzato per misurare dimensioni di farina più piccole e/o più variabili che non possono essere accuratamente individuate dalle misurazioni medie del peso di gruppo. Nella figura 6, lo stesso protocollo di quantificazione della fluorescenza è stato utilizzato per misurare il comportamento di alimentazione del nettare scambiando il Glytube con un batuffolo di cotone saturo di saccarosio al 10% contenente 0,002% di fluoresceina. Gli zuccheri di nettare non possono essere presentati nel saggio di Glytube perché le femmine non riescono a rilevare la presenza di zuccheri nettare con lo stile e non iniziano a nutrire27. Questi dati consentono al ricercatore di determinare che i pasti di zucchero sono costantemente più piccoli degli esami del sangue, in accordo con illavoro precedente 34 (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Figura 1: Impostazione del metodo Glytube utilizzato per alimentare i pasti alle zanzare. (A) Schema di un Glytube decostruito utilizzato per nutrire il sangue e altri pasti alle zanzare. (B) Schema di un Glytube presentato in cima a un contenitore di zanzare con un coperchio a rete. Le zanzare femminili possono perforare il coperchio della rete per nutrirsi. (C) Fotografie delle zanzare Aedes aegypti di Glytube (in alto) e delle femmine di Aedes aegypti prima, durante e dopo l'alimentazione (in basso, da sinistra a destra) su un pasto consegnato da Glytube. Le zanzare vengono mostrate penetrare attraverso la rete che copre il loro contenitore per accedere all'alimentatore a membrana. (D) Fotografie che mostrano l'aspetto delle zanzare Ae. aegypti femminili che non sono sane (a sinistra) e che si sono ingoiate su un pasto di sangue artificiale (destra, in alto) o su un pasto salino + ATP (destra, in basso). Il metodo Glytube è stato precedentemente pubblicato in Costa-da-Silvaet al. Le fotografie in( C) e (D) sono per gentile concessione di Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Figura 2: Schema di come quantificare le dimensioni dei pasti dopo il protocollo di alimentazione del sangue di Glytube. (A) Alle zanzare viene offerto un pasto con fluoresceina (superiore, gruppo sperimentale) o nessun pasto (gruppo di controllo negativo inferiore e non a fed). (B) Le singole zanzare vengono aggiunte a una piastra da 96 pozzetta dopo aver interrotto l'esperimento di alimentazione. (C) La curva standard viene generata utilizzando quantità note di farina contenenti 0,002% di fluoresceina. (D) Le zanzare sono omogeneizzate per rilasciare qualsiasi fluoresceina consumata e i livelli di fluorescenza in ogni pozzo sono quantificati utilizzando un lettore di piastre. Questo metodo di quantificazione della fluorescenza è modificato da Lieschet al. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Figura 3: Esperimento di alimentazione del sangue di Glytube con quantificazione a base di fluoresceina. (A) Misurazioni standard della curva ottenute dai pozzi in cui una zanzara del gruppo di controllo non fusa è stata aggiunta a una quantità nota di farina contenente lo 0,002% di fluoresceina (scala dell'asse y = unità arbitrarie). (B) Volume dei pasti calcolato utilizzando letture di fluorescenza per le femmine del gruppo di controllo non alimentato (sinistra, nera, n = 40), il gruppo sperimentale che si nutriva di sangue (medio, rosso, n = 37) e il gruppo sperimentale che non si nutriva di sangue (destra, rosso, n = 23). Ogni punto rappresenta una misura di una singola femmina. I dati vengono visualizzati come mediani con intervallo. Le lettere indicano gruppi statisticamente distinti, il test di Kruskal-Wallis con il confronto multiplo di Dunn, p<0.01. Questi dati sono stati pubblicati in Jové etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Figura 4: Quantificazione dei pasti con diversa composizione proteica. Alle femmine venivano offerti pasti di sangue di pecora (rosso), sangue artificiale con proteine del sangue umano (Kogan (1990)22) (arancione), o soluzione salina senza proteine + farina ATP (aqua)7. (A) Percentuale di femmine nutrite valutate utilizzando letture a fluorescenza. Ogni punto rappresenta un gruppo di 12-16 femmine. I dati sono mostrati come mediane con intervalli, n = 12. (B) Volume dei pasti calcolato mediante letture a fluorescenza. Ogni punto rappresenta una misurazione di una singola femmina in un'unica prova della figura 4A. I dati sono mostrati come mediane con intervalli, n = 12. (C) Percentuale di femmine completamente ingoiate dopo l'alimentazione artificiale della membrana, segnata dall'occhio. Ogni punto rappresenta la percentuale di femmine ingoiate da gruppi di 20-30 femmine. I dati sono mostrati come mediane con intervalli, n = 23. (D) Le dimensioni dei pasti sono state valutate come peso/femmina dopo che lo stato di alimentazione è stato valutato a occhio. I pesi sono stati calcolati come media di gruppi di 5 zanzare. I dati sono mostrati come mediane con intervalli, n = 23. A–D: Le lettere indicano gruppi statisticamente distinti, test di Kruskal-Wallis con il confronto multiplo di Dunn, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Figura 5: Quantificazione dei pasti con composti farmacologici. Le femmine consumano pasti delle stesse dimensioni di sangue di pecora (rosso), soluzione salina + ATP (acqua) e salina + ATP + 100 μM dose di agonista del recettore NPY Y2 umano TM30338 (blu scuro). Volume dei pasti calcolato utilizzando letture di fluorescenza. Ogni punto rappresenta una misura di una singola femmina. I dati sono mostrati come mediane con intervalli, n = 12. Le lettere indicano gruppi statisticamente distinti, il test di Kruskal-Wallis con il confronto multiplo di Dunn, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Figura 6: Quantificazione dei pasti più piccoli di nettare. (A) Schema del saggio di alimentazione del nettare. (B) Volume dei pasti calcolato utilizzando letture di fluorescenza per le femmine di tipo selvatico che offrivano pasti di acqua (blu, n = 36) o 10% di saccarosio (verde, n = 53), ciascuno con 0,002% di fluoresceina, nel saggio di alimentazione del nettare. Ogni punto rappresenta una misura di una singola femmina. I dati vengono visualizzati come mediane con intervalli. Le lettere indicano gruppi statisticamente distinti, test mann-whitney, p<0.05. Questi dati sono stati pubblicati in Jové etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Farina di sangue artificiale</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentrazione della soluzione stock (mg/mL)</td>
			<td>Volume della soluzione stock in farina (μL/mL)</td>
			<td>Concentrazione finale delle farine (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Componenti proteici*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-globuline</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emoglobina</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumina</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteine totali</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Componenti non proteici</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentrazione della soluzione stock (mM)</td>
			<td>Volume della soluzione stock in farina (μL/mL)</td>
			<td>Concentrazione finale dei pasti (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>Nel γ-globulina</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>Nel γ-globulina</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*I componenti proteici sono preparati in soluzione stock di acqua doppia distillata, ad eccezione delle γ-Globuline, che vengono sciolte in NaHCO3 da 400 mM e includono una quantità variabile di NaCl (2-4%) nel prodotto.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricetta per la preparazione di esami del sangue artificiale (adattati da Kogan (1990)22). Il sangue artificiale è costituito da componenti proteici e non proteici che si trovano regolarmente nel sangue umano e offre la possibilità di variare i rapporti di questi componenti. Le zanzare possono produrre uova dopo essersi nutrite di sangueartificiale 7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Pasto salino</td>
		</tr>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione della soluzione stock (mM)</td>
			<td>Volume della soluzione stock in farina (μL/mL)</td>
			<td>Concentrazione finale dei pasti (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Ricetta per pasti salini con ATP (adattato da Duvall et al. (2019)7). I pasti salini senza proteine possono essere utilizzati per fornire composti di interesse alle zanzare mentre si imita ancora la distensione addominale che si verifica dopo l'alimentazione del sangue, ma senza innescare lo sviluppo delle uova che si verifica quando le proteine vengono ingerite.

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire pasti di sangue di origine animale e artificiale alle zanzare Aedes aegypti attraverso un alimentatore di membrane artificiale e quantificare con precisione il volume di farina ingerita.

Alimentazione e quantificazione del sangue di origine animale e dei pasti artificiali nelle zanzare Aedes aegypti

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Pittura cromosoma 2D e 3D nelle zanzare della malaria

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...