Name: feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-10-22T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Мы благодарим Нипуна Басрера, Адриану К. Росас Вильегас, Надава Шай и Тревора Сорреллса за комментарии к рукописям, а Чжуньяна Гонга и Киролоса Барсума — за техническую помощь. Мы благодарим Алекса Уайлда за фотографии, использованные на рисунке 1. К.В. был поддержан стипендией Boehringer Ingelheim Fonds PhD. В.Я. частично поддержал NIH T32-MH095246. Эта работа была частично поддержана грантом Рокфеллеровского университета от Медицинского института Говарда Хьюза через стипендию Джеймса Х. Гиллиама для программы Advanced Study для V.J. Данный материал основан на работе, поддерживаемой Программой стипендий Национального научного фонда в рамках гранта No. NSF DGE-1325261 до В.Я. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями автора (ы) и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.

<ol>
	<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li><li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue.">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li><li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus.">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+virus+infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias.">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history,+emergence,+biology,+and+prospects+for+control.">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes:+implications+for+anautogeny.">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li><li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting.">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li><li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti.">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li><li>Guerrero, D., Cantaert, T., Miss&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses.">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li><li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands.">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li><li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+(diptera:+Culicidae).">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li><li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission.">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li><li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li><li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia.">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li><li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti.">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li><li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans.">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li><li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus.">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li><li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka.">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).</li><li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glytube:+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).</li><li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil.">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li><li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+diets+for+mosquitoes.">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+stimuli+and+artificial+feeding.">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+response+in+Aedes+aegypti:+stimulation+by+adenosine+triphosphate.">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li><li>Jov&#233;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li><li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity.">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li><li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako,+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+(ATSB).">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).</li><li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+(L.)+(Diperta:+Culicidae).">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li><li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope.">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+SkitoSnack,+an+artificial+blood+meal+replacement,+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota.">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior.">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).</li><li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet.">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li><li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact.">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li><li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector,+Aedes+aegypti,+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand.">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).</li><li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiteOscope,+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior.">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Для многих лабораторных применений, искусственные мембранные фидееры предлагают различные преимущества по сравнению с живыми хозяевами, позволяя исследователям возможность непосредственно манипулировать содержанием еды. Хотя несколько методов доступны для искусственного мембранного кормления, метод, описанный здесь предлагает преимущества в гибкости, стоимости и пропускной способности. По сравнению с другими коммерческими мембранными кормушками, анализ Glytube требует небольшого объема еды, что делает его эффективным механизмом доставки дорогостоящих реагентов, включая лекарства или патогенные микроорганизмы, путем минимизации общего объема,необходимого 7,35. По мере того как и протеин-свободно солевой и искусственная еда крови способствуют engorgement, соединения или патогены можно добавить к любой еде как high-throughput и неинвазивная алтернатива к инъекциям. Кроме того, каждый компонент Glytube можно легко мыть, заменять или масштабировать для доставки и количественной оценки нескольких типов еды без перекрестного загрязнения аппарата питания.
Для количественной оценки объемов еды, потребляемой комарами, метод на основе флуоресценции позволяет более точно определить размер еды, чем взвешивание комаров до и после кормления. Следует отметить, что данный метод является анализом конечных токов. В отличие от этого, взвешивание позволяет комаров, чтобы сохранить в живых для дальнейших экспериментов. С помощью считывателя пластин метод на основе флуоресценции может быть легко расширен для высокой пропускной способности количественной оценки блюд, потребляемых сотнями отдельных женщин.
Для достижения высоких показателей кормления, сочетание достаточного принимающей сигналы должны присутствовать, чтобы активировать женский принимающей поведение и привлечь женщин к кормушки. Если комары не скучены под Glytube, еда не может быть должным образом нагревается, или CO2 доставка не может быть достаточно. Добавление человеческого запаха к поверхности мембраны надежно повышает привлекательность искусственной мембраны. Если комары наблюдаются под Glytube, но не в состоянии кормить, состав еды может быть виноват. Самки не могут кормить, если сама еда не теплая, кровь слишком старая, или если добавки к трапезе по своей сути аверсивны или вызывают нежелательнуюхимическую реакцию 36. Дополнительный АТФ также надежно увеличивает показатели кормления и может быть увеличен до конечной концентрации 2 мМ в каждом из предусмотренных рецептов. Самки не могут кормить, если парафильм не вытащил тугой через крышку Glytube; парафильм должен быть равномерно прозрачным и не должен пряжки, так как это предотвращает женщину от возможности эффективно проколоть parafilm с ее stylet. Если еда протекает через Glytube на сетку, парафильм может быть разорван во время процесса растяжения и должен быть заменен.
Изменение состава еды также может позволить исследователям манипулировать продолжительностью времени, необходимого для очищения еды от midgut, а также последующим поведением, ищущим хозяина. Блюда, представленные здесь требуют 24-36 ч дляпищеварения 7 похож на животных полученных крови. После кормления на любой из этих приемов пищи, женщины будут подавлять хост-поиск во время пищеварения время окна. Так как солевой еды не хватает белка, женщины возвращаются к хозяину ищет после еды очищается. Если более быстрое возвращение желательно, исследователи могут выбрать альтернативные "быстрой очистки" солевые блюда, которые выделяются примерно в 6 ч27. В то время как состав солевой муки, представленной здесь, сравнивается с результатами искусственной крови, «быстрая очистка» еды более тесно соответствует физиологическим уровням соли, обнаруженным в крови позвоночных.
Методы, описанные здесь, имеют ограничения, которые следует рассмотреть, прежде чем выбрать анализ, который наиболее подходит для экспериментальных целей исследователя. Описанные измерения флуоресцента не позволяют снова использовать комаров для дополнительных экспериментов. Тем не менее, измерения веса могут быть приняты до количественной оценки размера еды с использованием флуоресксейна анализа. Если вес и размер еды являются последовательными в нескольких испытаниях для данного приема пищи, вес может быть использован в качестве прокси в будущих экспериментах. Кроме того, в этом протоколе не проводится различия между дефицитом в поиске хозяина и поведением, питающиеся кровью; комары, которые показывают нарушения в поиске мембраны подачи будет иметь снижение уровня кормления и / или размер еды. Добавив камеру для записи поведения на протяжении всего анализа, исследователи могут определить, не могут ли самки найти Glytube, или же они находят Glytube, но не питаются.
Анализ, описанный здесь, может быть адаптирован для изучения многих нерешенных вопросов, связанных с поведением кормления у комаров. Например, вклад конкретных белков крови можно исследовать путем изменения соотношения составных белков или общей концентрации белка в искусственной крови. Для оценки размеров еды из нескольких событий кормления, красители с различными спектрами флуоресценции могут быть добавлены, чтобы отличить питание от уникальныхисточников 37. Этот протокол также может быть изменен, чтобы отдельно стимулировать внутренние ротовые части, которые обнаруживают кровь и которые используются для приема внутрь (т.е. stylet), и хемосенсорные придатки, которые контактируют с кожей (т.е. лабий, ноги), как комар земли, чтобы начатькормление крови 36. Например, если лиганды добавляются непосредственно в трапезу, они не контактировать с лабием и ногами, так как мембрана пронзается только stylet. Если лиганды добавляются на внешнюю поверхность парафильма вместо этого, они остаются отделенными от еды и могут связаться с лабием иногами 36. Наконец, подробные кинетики крови кормления поведение не очень хорошо изучены и метод, представленный здесь может быть изменен, чтобы объединить высокое разрешение отслеживания с машинным обучением инструменты для извлечения поведенческих считывания передвижения, осанки и кормлениядинамики 38.
Этот протокол направлен на то, чтобы быть удобным и экономически эффективным, с возможностью служить исследователям, использующим фармакологические и генетические манипуляции для изучения комаров, кормящих кровью и после кормления крови поведения.

Мы представляем протокол для кормления модифицированных блюд крови комаров Aedes aegypti с помощью искусственной мембранной подачи и точного измерения объема еды, потребляемой каждым отдельным комаром. Этот протокол может быть гибко адаптирован для изменения содержания еды или для сравнения объема еды, потребляемой различными экспериментальными группами комаров.
Комар Ae. aegypti угрожает глобальному здоровью, распространяя патогенные микроорганизмы, которые вызывают заболевания, включая желтую лихорадку, лихорадку денге, чикунгунья и вирус Зика1,2,3,4,5. Самки Ae. aegypti обязаны кровоскормы; они должны потреблять позвоночных крови, чтобы получить необходимый белок для развития яйцеклетки, и каждый сцепление яиц требует полной еды крови, по крайнеймере один хозяин 6,7,8. Самка комара сначала кусает хозяина, прокалывая кожу своим стилем и вводя слюну, которая содержит соединения, которые вызывают иммунный ответхозяина 9. Затем она питается, перекачивая кровь через ее stylet в ее midgut. Потребляя пищу крови от инфицированного хозяина, она может провести кровьпатогенов 6,8 , которые затеммигрируютиз комаров midgut к ее слюнных желез10. Самки комаров, инфицированных таким образом, могут распространять болезни путем инъекций патогенных микроорганизмов вместе со слюной приукусе последующих хозяев 11,12. Понимание и количественная оценка механизмов поведения при кормлении крови являются важнейшими шагами в борьбе с передачей болезней, передаваемых комарами.
Многие лабораторные протоколы для выращивания комаров и экспериментов использовать живых животных, включая мышей, морскихсвинок, или людейв качестве источника крови 13,14,15,16. Использование живых животных налагает этические проблемы, а также сложные требования к обучению персонала, жилью и уходу за животными, а также соблюдение политики Комитета по уходу и использованию животных (МАКУК). Он также ограничивает типы соединений, которые могут быть доставлены комаров, что ограничивает исследования, которые могут быть проведены17.
Искусственные аппараты для кормления крови, которые обычно используют мембранную систему для имитации кожи хозяина, являются полезными инструментами для изучения поведения при кормлении крови, которые обходят необходимость поддержания живых хозяев. Вся кровь может быть приобретена у ряда поставщиков и подается комарам с помощью подогревом, водяной курткой искусственных мембран фиделили аналогичных устройств 18,19. В этом протоколе мы демонстрируем использование небольших одноразовых мембранных фидерсов, которые называются «Глитрубы». Эта мембранная кормушка, ранее опубликованная Costa-da-Silva et al. (2013)20, может быть легко собрана из стандартного лабораторного оборудования, что делает ее идеальной для доставки крови к умеренному количеству комаров и простой для масштабирования для тестирования больших групп или нескольких формулировок еды. Glytube является недорогой и эффективной альтернативой другим коммерческим искусственных фидеров, которые могут потребовать больших объемов еды и более пригодны для партии кормления больших групп комаров на одинприем пищи формулировки 21.
Этот протокол включает в себя два раздела: подготовка/доставка искусственных блюд и количественная оценка потребления. В первом разделе, Glytubes используются в качестве эффективного средства для доставки манипулировать диеты. Вся кровь может быть заменена полностью искусственной едой, чтобы сравнить эффекты заменителей крови вместо еды крови. Рецепт адаптированы из Коган (1990)22 представлен здесь, хотя несколько искусственных формулировокеды были разработаны 23,24. Кроме того, кормление является менее инвазивным и менее трудоемким методом введения фармакологических соединений, чем инъекция. Из-за низкого общего объема, необходимого для каждого приема пищи (1-2 мл), этот протокол обеспечивает привлекательный метод доставки, чтобы уменьшить количество дорогих реагентов. Ae. aegypti женщины легко потребляют без белка питание солевого раствора с аденозином 5 "трифосфат(АТФ) 25,26, который обеспечивает базовый уровень для измерения воздействия отдельных компонентов еды. Например, Нейропептид Y-как рецептор 7 (NPYLR7) в Ae. aegypti, как известно, посредником принимающей ищет подавления после богатых белком крови еды, и когда NPYLR7 агонисты добавляются в безбелковый солевой еды, самки комаров экспонат принимающей поисках подавления похож на те, которыепотребляли всю кровь 7.
Во втором разделе представлены шаги по количественной оценке объема каждого приема пищи, потребляемого отдельными самками комаров. Этот анализ основан на флуоресценции и фиксирует состояние кормления в более высоком разрешении, чем методы, в которых женщины классифицируются как "кормили" или "unfed" на основе визуальной оценки брюшной дистензии в одиночку. Добавляя флуоресцентный к трапезе до кормления, объемы еды, проглатываемые отдельными лицами, могут быть количественно определены путем гомогенизации каждого комара в 96-хорошо пластины и измерения интенсивности флуоресценции в качестве считывания. Этот анализ может измерять различия в энергии кормления в ответ на такие переменные, как состав еды или генетический фон комаров. Точная количественная оценка имеет решающее значение для промежуточных размеров еды, например, когда женщинам предлагаются неоптимальные блюда, содержащие сдерживающие факторы для кормления, или когда они потребляют сахарозные блюдапеременных размеров 27. Если подкормленные комары необходимы для последующих поведенческих анализов после количественной оценки размера еды, размер еды может быть рассчитан путем взвешивания анестезированная самка в группах и оценки средней увеличенной массы на человека. Хотя менее точны, чем флуорессейн маркировки, взвешивание по-прежнему обеспечивает агрегированную оценку объема еды и позволяет изучать влияние еды на процессы вниз по течению, такие как плодовитость или последующего притяжения хозяина. В то время как размер еды крови является переменной и может зависетьот множества факторов 11,28,29 , попадаетразмеры едыизмеряется с методами, описанными здесь в соответствии спредыдущими количественными 7,30,31.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Самки некоторых видов комаров могут распространять болезни, кусая позвоночных хозяев, чтобы получить богатые белком блюда крови, необходимые для развития яйцеклеток. В лаборатории исследователи могут доставлять комаров с помощью мембранных фидей, которые позволяют манипулировать составом пищи животного происхождения и искусственной крови. Здесь мы представляем методы кормления крови и искусственной крови комаров Aedes aegypti и количественного объема, потребляемого отдельными женщинами.
Целенаправленное кормление и количественная оценка искусственных/кровяных блюд широко используются, включая тестирование влияния компонентов питания на поведение комаров и физиологию, доставку фармакологических соединений без инъекций и заражение комаров конкретными патогенами. Добавление флуоресцентного красителя в пищу перед кормлением позволяет последующей количественной оценки размера еды. Объем еды, потребляемой комарами, может быть измерен либо по весу, если самки должны быть использованы позже для поведенческих экспериментов, или путем гомогенизации отдельных женщин в 96-хорошо пластин и измерения уровня флуоресценции с помощью считывателя пластин в качестве конечной точки анализа. Количественная оценка размера еды может быть использована для определения того, изменяет ли изменение компонентов еды объем приема пищи или потребление еды отличается между штаммами комаров. Точная количестве еды количественно также имеет решающее значение для вниз по течению анализы, такие, как те, измерения воздействия на принимающей притяжения или плодовитости. Методы, представленные здесь, могут быть дополнительно адаптированы для отслеживания пищеварения еды в течение нескольких дней или для включения нескольких различимых маркеров, добавленных в различные блюда (например, нектар и кровь) для количественной оценки потребления каждого приема пищи одним комаром.
Эти методы позволяют исследователям в одиночку выполнять измерения высокой пропускной способности для сравнения объема еды, потребляемой сотнями отдельных комаров. Поэтому эти инструменты будут в целом полезны для сообщества исследователей комаров для ответа на различные биологические вопросы.

Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Цель этого протокола заключается в доставке животных полученных и искусственных блюд крови комаров Aedes aegypti через искусственную мембрану подачи и точно количественно объем еды попадает.

Кормление и количественная оценка крови и искусственного питания животных у комаров Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Выделение мышью перитонеальных клеток полости

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Анализ кальция Биолюминесценция для функционального анализа Mosquito ( Aedes aegypti) И Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G-белком рецепторы

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Протокол для сбора и окрашивания гемоциты от желтой лихорадки комаров Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Флуоресцентный<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации на митотических хромосом от комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Клиническое применение<em&gt; Спящая красавица</em&gt; И искусственный антиген-представляющие клетки генетически модифицировать T клеток из периферической и пуповинной крови

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D и 3D хромосомная живопись у малярийных комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...