Name: feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-10-22T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Vi tackar Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai och Trevor Sorrells för kommentarer om manuskripten och Zhongyan Gong och Kyrollos Barsoum för teknisk hjälp. Vi tackar Alex Wild för fotografier som används i figur 1. K.V. fick stöd av Boehringer Ingelheim Fonds doktorandstipendium. V.J. stöddes delvis av NIH T32-MH095246. Detta arbete stöddes delvis av ett anslag till The Rockefeller University från Howard Hughes Medical Institute genom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program till V.J. Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. NSF DGE-1325261 till V.J. Alla yttranden, slutsatser och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är upphovsmannens och återspeglar inte nödvändigtvis den nationella vetenskapsstiftelsens åsikter.

<ol>
	<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li><li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue.">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li><li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus.">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+virus+infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias.">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history,+emergence,+biology,+and+prospects+for+control.">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes:+implications+for+anautogeny.">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li><li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting.">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li><li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti.">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li><li>Guerrero, D., Cantaert, T., Miss&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses.">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li><li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands.">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li><li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+(diptera:+Culicidae).">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li><li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission.">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li><li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li><li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia.">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li><li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti.">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li><li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans.">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li><li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus.">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li><li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka.">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).</li><li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glytube:+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).</li><li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil.">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li><li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+diets+for+mosquitoes.">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+stimuli+and+artificial+feeding.">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+response+in+Aedes+aegypti:+stimulation+by+adenosine+triphosphate.">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li><li>Jov&#233;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li><li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity.">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li><li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako,+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+(ATSB).">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).</li><li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+(L.)+(Diperta:+Culicidae).">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li><li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope.">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+SkitoSnack,+an+artificial+blood+meal+replacement,+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota.">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior.">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).</li><li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet.">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li><li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact.">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li><li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector,+Aedes+aegypti,+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand.">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).</li><li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiteOscope,+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior.">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

För många laboratorieapplikationer erbjuder konstgjorda membranmatare distinkta fördelar jämfört med levande värdar genom att ge forskare möjlighet att direkt manipulera måltidens innehåll. Även om flera metoder finns tillgängliga för artificiell membranmatning, erbjuder den metod som beskrivs här fördelar i flexibilitet, kostnad och genomströmning. I jämförelse med andra kommersiella membranmatare kräver Glytube-analysen en liten måltidsvolym, vilket gör det till en effektiv leveransmekanism för kostsamma reagenser, inklusive läkemedel eller patogener, genom att minimera den totala volymensom krävs 7,35. Eftersom både den proteinfria saltlösningen och konstgjorda blodmåltider främjar engorgement, föreningar eller patogener kan läggas till antingen måltid som en hög genomströmning och icke-invasiva alternativ till injektioner. Dessutom kan varje komponent i Glytube enkelt tvättas, bytas ut eller skalas upp för att leverera och kvantifiera flera måltidstyper utan korskontaminering av matningsapparaten.
För att kvantifiera måltidsvolymer som konsumeras av myggor möjliggör den fluorescensbaserade metoden mer exakt måltidsstorleks kvantifiering än att väga myggorna före och efter utfodring. Det bör noteras att denna metod är en slutpunktsanalys. Däremot tillåter vägning myggorna att hållas vid liv för ytterligare experiment. Genom att använda en tallriksläsare kan den fluorescensbaserade metoden enkelt skalas upp för kvantifiering av måltider som konsumeras av hundratals enskilda kvinnor.
För att uppnå höga utfodringshastigheter måste en kombination av tillräckliga värdsignaler vara närvarande för att aktivera kvinnligt värdsökande beteende och locka kvinnor till mataren. Om myggor inte trängs under Glytube kanske måltiden inte värms ordentligt, eller CO2-leveransen kanske inte är tillräcklig. Tillsats av mänsklig lukt till membranytan ökar på ett tillförlitligt sätt attraktiviteten hos det konstgjorda membranet. Om myggor observeras under Glytube men misslyckas med att mata, kan måltidssammansättningen vara fel. Kvinnor får inte mata om måltiden i sig inte är varm, blodet är för gammalt eller om tillsatserna till måltiden är i sig aversiva eller orsakar en oönskad kemisk reaktion36. Ytterligare ATP ökar också utfodringshastigheterna på ett tillförlitligt sätt och kan skalas upp till en slutlig koncentration på 2 mM i vart och ett av recepten. Kvinnor får inte mata om parafilmen inte dras spänd över Glytube-locket; parafilmen ska vara enhetligt transparent och bör inte spännas, eftersom detta förhindrar att honan effektivt kan genomborra parafilmen med sin stil. Om måltiden läcker genom Glytuben på nätet kan parafilmen ha slitits sönder under sträckningsprocessen och bör bytas ut.
Att ändra måltidssammansättningen kan också göra det möjligt för forskare att manipulera den tid som behövs för att rensa måltiden från midgut samt det efterföljande värdsökande beteendet. Måltiderna som presenteras här kräver 24-36 h för matsmältning7 som liknar animaliskt härlett blod. Efter utfodring på någon av dessa måltider kommer kvinnor att undertrycka värdsökande under matsmältningstidens fönster. Eftersom saltlösningsmjölet saknar protein återvänder kvinnor till värdsökande efter att måltiden har rensats. Om en snabbare avkastning är önskvärd kan forskare välja alternativa "snabb clearing" saltlösning måltider som utsöndras i cirka 6 h27. Medan sammansättningen av saltlösningsmjölet som presenteras här matchas för att direkt jämföra resultat med den konstgjorda blodmåltiden, matchar den "snabba clearing" måltiden närmare fysiologiska saltnivåer som finns i ryggradsdjursblod.
De metoder som beskrivs här har begränsningar som bör övervägas innan du väljer den analys som är mest lämpad för forskarens experimentella mål. De fluoresceinmätningar som beskrivs tillåter inte myggor att användas igen för ytterligare experiment. Viktmätningar kan dock göras före kvantifiering av måltidsstorleken med fluoresceinanalysen. Om vikt och måltidsstorlek är konsekventa i flera försök för en viss måltid kan vikt användas som proxy i framtida experiment. Dessutom skiljer detta protokoll inte mellan underskott i värdsökande kontra blodmatningsbeteende; myggor som visar försämringar i att hitta membranmataren kommer att ha en minskning av utfodringshastigheter och / eller måltidsstorlek. Genom att lägga till en kamera för att spela in beteende under hela analysen kan forskare avgöra om honorna inte kan hitta Glytube, eller om de hittar Glytube, men inte matar.
Analysen som beskrivs här kan anpassas för att utforska många enastående frågor relaterade till utfodringsbeteende hos myggor. Till exempel kan bidraget från specifika blodproteiner utforskas genom att ändra förhållandet mellan ingående proteiner eller total proteinkoncentration i den konstgjorda blodmjölet. För att utvärdera måltidsstorlekar från flera utfodringshändelser kan färgämnen med distinkt fluorescensspektra läggas till för att skilja måltider från unika källor37. Detta protokoll kan också ändras för att separat stimulera de inre munstyckena som detekterar blod och som används för intag (dvs. stylet) och de kemosensoriska bihang som kommer i kontakt med huden (dvs. labium, ben) när myggan landar för att börjablodmatning 36. Till exempel, om ligands läggs direkt till måltiden, kontaktar de inte labiet och benen, eftersom membranet endast genomborras av styleten. Om ligands läggs till den yttre ytan av parafilmen istället, förblir de separerade från måltiden och kan kontaktas av labium och ben36. Slutligen är de detaljerade kinetikerna av blodmatningsbeteende inte väl förstådda och metoden som presenteras här kan ändras för att kombinera högupplöst spårning med maskininlärningsverktyg för att extrahera beteendemässiga avläsningar av rörelse, hållning ochutfodringsdynamik 38.
Detta protokoll syftar till att vara användarvänligt och kostnadseffektivt, med förmågan att betjäna forskare som använder farmakologiska och genetiska manipuleringar för att studera myggblodmatning och post-blodmatningsbeteende.

Vi presenterar ett protokoll för utfodring av modifierade blodmåltider till Aedes aegypti myggor med hjälp av en konstgjord membranmatare och exakt mäta måltidsvolymen som konsumeras av varje enskild mygga. Detta protokoll kan flexibelt anpassas för att ändra måltidens innehåll eller för att jämföra måltidsvolymen som konsumeras av olika experimentella grupper av myggor.
Ae. aegypti mygga hotar den globala hälsan genom att sprida patogener som orsakar sjukdomar inklusive gula febern, denguefeber, chikungunya och Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti honor är skyldiga blodmatare; De måste konsumera ryggradsdjur blod för att få det nödvändiga proteinet för äggutveckling, och varje koppling av ägg kräver en full blodmåltid från minst envärd 6,7,8. Den kvinnliga myggan biter först sin värd genom att genomborra huden med sin stylet och injicera saliv, som innehåller föreningar som utlöser värdens immunsvar9. Hon matar sedan genom att pumpa blod genom sin stil i sin midgut. Medan hon konsumerar en blodmåltid från en infekterad värd, kan hon inta blodburna patogener6,8, som sedan migrerar från myggans midgut till hennes salivkörtlar10. Kvinnliga myggor infekterade på detta sätt kan sprida sjukdom genom att injicera patogener tillsammans med saliv när man biter efterföljandevärdar 11,12. Att förstå och kvantifiera mekanismerna för blodmatningsbeteende är avgörande steg för att kontrollera överföringen av myggburna sjukdomar.
Många laboratorieprotokoll för mygguppfödning och experiment använder levande djur inklusive möss, marsvin eller människor som blodkälla13,14,15,16. Användningen av levande djur medför etiska problem samt komplexa krav på personalutbildning, djurhållning och djuromsorhållning samt efterlevnad av IACUC:s (Institutional Animal Care and Use Committee) politik. Det begränsar också de typer av föreningar som kan levereras till myggor, vilket begränsar de studier som kan utföras17.
Konstgjorda blodmatningsapparater, som vanligtvis använder ett membransystem för att simulera värdhud, är användbara verktyg för att studera blodmatningsbeteenden som kringgår behovet av underhåll av levande värdar. Helblod kan köpas från ett antal leverantörer och matas till myggor med uppvärmda, vattenmantlade konstgjorda membranmatare eller liknandeenheter 18,19. I detta protokoll demonstrerar vi användningen av små, engångsmembranmatare som kallas "Glytubes". Denna membranmatare, tidigare publicerad av Costa-da-Silva et al. (2013)20, kan enkelt monteras från standard laboratorieutrustning, vilket gör den idealisk för att leverera blodmåltider till måttligt antal myggor och enkelt att skala upp för att testa större grupper eller flera måltidsformuleringar. Glytube är ett billigt och effektivt alternativ till andra kommersiella konstgjorda matare, vilket kan kräva större måltidsvolymer och är mer lämpliga för batchmatning av stora grupper av myggor på en enda måltidsformulering21.
Detta protokoll innehåller två avsnitt: förbereda/leverera konstgjorda måltider och kvantifiera konsumtionen. I det första avsnittet används Glytubes som ett effektivt sätt att leverera manipulerade dieter. Helblod kan ersättas med en helt konstgjord måltid för att jämföra effekterna av blodsubstitut i stället för en blodmåltid. Ett recept anpassat från Kogan (1990)22 presenteras här, även om flera konstgjorda måltidsformuleringar har utvecklats23,24. Dessutom är utfodring en mindre invasiv och mindre mödosam metod för att införa farmakologiska föreningar än injektion. På grund av den låga totala volymen som krävs för varje måltid (1–2 ml) ger detta protokoll en attraktiv leveransmetod för att minska mängden dyra reagenser. Ae. aegypti honor konsumerar lätt proteinfria måltider av saltlösning med adenosin 5′-tripfosfat (ATP)25,26, vilket ger en baslinje för att mäta effekterna av single meal komponenter. Till exempel är Neuropeptid Y-liknande receptor 7 (NPYLR7) i Ae. aegypti känd för att medla värdsökande undertryckande efter en proteinrik blodmåltid, och när NPYLR7-agonister läggs till en proteinfri saltlösningsmåltid uppvisar kvinnliga myggor värdsökande undertryckande som liknar dem som har konsumerat helblod7.
I det andra avsnittet presenteras steg för kvantifiering av volymen av varje måltid som konsumeras av en enskild kvinnlig mygga. Denna analys är fluorescensbaserad och fångar utfodringsstatus i högre upplösning än metoder där kvinnor klassificeras som "matade" eller "unfed" baserat på visuell bedömning av enbart bukdistension. Genom att tillsätta fluorescein till måltiden före utfodring kan måltidsvolymer som intas av individer kvantifieras genom att homogenisera varje mygga i en 96-brunnsplatta och mäta fluorescensintensitet som en avläsning. Denna analys kan mäta skillnader i utfodringskraft som svar på variabler som måltidssammansättning eller myggornas genetiska bakgrund. Exakt kvantifiering är avgörande för mellanmålsstorlekar, till exempel när kvinnor erbjuds suboptimala måltider som innehåller foderavskräckningsmedel eller när de konsumerar sackarosmåltider av varierandestorlek 27. Om matade myggor krävs för efterföljande beteendemässiga analyser efter måltidsstorleks kvantifiering, kan måltidsstorleken istället beräknas genom att väga bedövade honor i grupper och uppskatta den genomsnittliga ökade massan per individ. Även om vägningen är mindre exakt än fluoresceinmärkningen ger vägningen fortfarande en aggregerad uppskattning av måltidsvolymen och gör det möjligt att undersöka måltidens inverkan på nedströmsprocesser, såsom fecundity eller efterföljande värdattraktion. Medan blodmjölsstorleken är variabel och kan påverkas av en myriad avfaktorer 11,28,29, intas måltidsstorlekar mätt med de metoder som beskrivs här överensstämmer med tidigare kvantifieringar7,30,31.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Kvinnor av vissa myggarter kan sprida sjukdomar medan biter ryggradsdjur värdar för att få proteinrika blodmåltider som krävs för äggutveckling. I laboratoriet kan forskare leverera animaliska och konstgjorda blodmåltider till myggor via membranmatare, vilket möjliggör manipulering av måltidssammansättning. Här presenterar vi metoder för att mata blod och konstgjorda blodmåltider till Aedes aegypti myggor och kvantifiera volymen som konsumeras av enskilda honor.
Riktad utfodring och kvantifiering av konstgjorda / blodmåltider har breda användningsområden, inklusive testning av måltidskomponenternas effekter på myggbeteende och fysiologi, leverera farmakologiska föreningar utan injektion och infektera myggor med specifika patogener. Att tillsätta fluoresceinfärgning till måltiden före utfodring möjliggör efterföljande kvantifiering av måltidsstorleken. Måltidsvolymen som konsumeras av myggor kan mätas antingen efter vikt, om honorna ska användas senare för beteendeexperiment, eller genom att homogenisera enskilda honor i 96-brunnsplattor och mäta fluorescensnivåer med hjälp av en plattläsare som en slutpunktsanalys. Kvantifiering av måltidsstorlek kan användas för att avgöra om ändring av måltidskomponenterna förändrar måltidsvolymen som intas eller om måltidskonsumtionen skiljer sig mellan myggstammar. Exakt kvantifiering av måltidsstorleken är också avgörande för nedströmsanalyser, såsom de som mäter effekter på värdattraktion eller fecundity. De metoder som presenteras här kan anpassas ytterligare för att spåra måltidssammanfattning under dagarna eller för att inkludera flera urskiljbara markörer som läggs till olika måltider (som nektar och blod) för att kvantifiera konsumtionen av varje måltid av en enda mygga.
Dessa metoder gör det möjligt för forskare att på egen hand utföra mätningar med hög genomströmning för att jämföra måltidsvolymen som konsumeras av hundratals enskilda myggor. Dessa verktyg kommer därför att vara i stort sett användbara för myggforskare för att svara på olika biologiska frågor.

Figur 1 presenterar ett schema för montering av Glytube, medan figur 2 visar en översikt över den experimentella designen för att mäta måltidsstorleken med hjälp av den fluorescensbaserade analysen som beskrivs här. Figur 3 ger representativa mätningar av fluoresceinmjölsstorlek från ett blodmatningsexperiment. Figur 4, figur 5och figur 6 illustrerar ett urval av biologiska frågor som kan tas upp med hjälp av detta protokoll. Tillämpningarna av protokollet är omfattande och inkluderar att ändra blodmjölssammansättningen, mata farmakologiska föreningar, exakt kvantifiera suboptimala blodmåltider eller mindre nektarmåltider och jämföra utfodringsbeteendet mellan mygggenotyper.
För att generera en standardkurva för måltidsvolymberäkningar plottas fluorescensavläsningar från de angivna referensbrunnarna som var och en innehåller en ofed mygga och en känd volym av måltiden med 0,002% fluorescein (Figur 3A). Fluorescensavläsningar från de återstående brunnarna, som innehåller myggor från antingen den negativa kontrollgruppen av unfed myggor eller den experimentella gruppen myggor som erbjuds en måltid, jämförs med denna standardkurva för att kvantifiera måltidsvolymen (μL) som konsumeras av varje mygga (Figur 3B). För att validera baslinjeavläsningarna i denna analys bör det bekräftas att myggor från den oskyddade negativa kontrollgruppen inte tilldelas ett positivt värde på μL som konsumeras (figur 3B, vänster). Även om alla honor i den experimentella gruppen erbjöds blodmåltiden, matades vissa myggor (Figur 3B, mitten) och vissa gjorde det inte (Figur 3B, höger). Detta resultat visar att två typer av data kan erhållas från detta protokoll: 1) andelen totala honor som matar på en viss måltid och 2) volymen som intas av honorna som matar på en viss måltid.
Detta protokoll kan användas för att leverera och kvantifiera måltider med olika proteinsammansättningar. Figur 4A,B visar data som samlats in med hjälp av måltider med tillsatt fluorescein. Andelen myggor som matade och måltidsvolymen de intog beräknades från fluorescensavläsningarna. Dessa avläsningar är mycket känsliga och möjliggör exakt kvantifiering av μL, men har begränsningen att myggor inte kan användas för framtida levande experiment. Figur 4C, D visar data som samlats in från ett oberoende experiment med myggor som fick poäng som matade eller ofed av ögat efter att de erbjöds måltider utan fluorescein. Måltidsstorlek beräknades som genomsnittlig vikt / kvinna från grupper om 5 myggor. Även om dessa viktmätningar är mindre känsliga än fluorescensmätningar, tillåter de att honorna återvinns och används för ytterligare levande experiment. Andelen myggor som matar kan variera mellan olika experimentella dagar, vilket återspeglas i figur 4A och figur 4C.
Figur 5 visar volymen som konsumeras av måltider som innehåller droger som reglerar myggvärdssökande beteende. I dessa experiment erbjöds kvinnor blod, saltlösning + ATP eller saltlösning + ATP-måltider med 100 μM av den mänskliga NPY Y2-receptoragonisten TM30338. Detta läkemedel förändrar värdsökande beteende genom aktivering av Ae. aegypti NPY-liknande receptor 7. Mätning av måltidsstorlekar är avgörande för tolkningen av experiment för att bedöma effekten av detta läkemedel på beteende efter blodmatning eftersom det gör det möjligt för forskaren att beräkna den dos som konsumeras av varje kvinna.
I de tidigare exemplen utfodrades honorna med antingen blod eller substitut för blodmåltider, som alla resulterade i 3–5 μL-måltider (figur 3, figur 4, figur 5). Denna fluorescensbaserade analys kan också användas för att mäta mindre och/eller mer variabla måltidsstorlekar som inte kan urskiljas exakt från genomsnittliga gruppviktsmätningar. I figur 6användes samma fluorescensk kvantifieringsprotokoll för att mäta nektarmatningsbeteende genom att byta Glytube mot en bomullstuss mättad med 10% sackaros som innehåller 0,002% fluorescein. Nektarsocker kan inte presenteras i Glytube-analysen eftersom kvinnor inte kan upptäcka närvaron av nektarsocker med styleten och inte initierar utfodring27. Dessa uppgifter gör det möjligt för forskaren att fastställa att sockermåltider är genomgående mindre än blodmåltider, i enlighet med tidigarearbete 34 (figur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Figur 1: Inställning av Glytube-metoden som används för att mata måltider till myggor. A)Schematisk av en dekonstruerad Glytube som används för att mata blod och andra måltider till myggor. (B) Schematisk av en Glytube presenteras ovanpå en behållare med myggor med ett nätlock. Kvinnliga myggor kan genomborra genom nätlocket för att mata. (C) Fotografier av Glytube (överst) och Aedes aegypti myggor före, under och efter utfodring (botten, från vänster till höger) på en Glytube-levererad måltid. Myggor visas piercing genom nätet som täcker deras behållare för att komma åt membranmataren. (D) Fotografier som visar utseendet på kvinnliga Ae. aegypti myggor som är unfed (vänster) och som har engorged på antingen en konstgjord blodmåltid (höger, överst) eller en saltlösning + ATP måltid (höger, botten). Glytube-metoden publicerades tidigare i Costa-da-Silva et al. (2013)20. Fotografier i (C) och (D) är med tillstånd av Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Figur 2: Schematiskt om hur man kvantifierar måltidsstorleken efter Glytubes blodmatningsprotokoll. (A) Myggor erbjuds en måltid med fluorescein (topp, experimentell grupp) eller ingen måltid (botten, oskyddad negativ kontrollgrupp). (B) Enskilda myggor tillsätts till en 96-brunnsplatta efter att utfodringsexperimentet har upphört. (C) Standardkurvan genereras med hjälp av kända mängder mjöl som innehåller 0,002 % fluorescein. (D) Myggor homogeniseras för att frigöra förbrukat fluorescein, och fluorescensnivåerna i varje brunn kvantifieras med hjälp av en plåtläsare. Denna fluorescens kvantifieringsmetod modifieras från Liesch et al. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Figur 3: Glytube blodmatningsförsök med fluoresceinbaserad kvantifiering. (A) Standardkurvmätningar som erhållits från brunnarna där en mygga från den oskyddade kontrollgruppen tillsattes till en känd mängd mjöl som innehöll 0,002% fluorescein (y-axelskala = godtyckliga enheter). (B) Måltidsvolym beräknad med fluorescensavläsningar för kvinnor i den oskyddade kontrollgruppen (vänster, svart, n = 40), den experimentella gruppen som matade på blod (mitten, rött, n = 37) och den experimentella gruppen som inte matade på blod (höger, röd, n = 23). Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna. Data visas som median med intervall. Bokstäver indikerar statistiskt distinkta grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns multipeljämförelse, p<0.01. Dessa uppgifter publicerades i Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Figur 4: Kvantifiering av måltider med olika proteinsammansättning. Kvinnor erbjöds måltider av antingen fårblod (rött), artificiellt blod med humant blodproteiner (Kogan (1990)22) (orange) eller proteinfri saltlösning + ATP-måltid (aqua)7. (A) Procentandel kvinnor som matas poäng med fluorescensavläsningar. Varje poäng representerar en grupp på 12–16 honor. Data visas som medianer med intervall, n = 12. B)Måltidsvolym beräknad med hjälp av fluorescensavläsningar. Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna i en enda studie från figur 4A. Data visas som medianer med intervall, n = 12. C)Procentandel kvinnor som är helt engorgerade efter konstgjord membranmatning, poängsätts med ögat. Varje punkt representerar den procent av kvinnorna som är insydd i grupper om 20–30 honor. Data visas som medianer med intervall, n = 23. (D) Måltidsstorlekar poängst. vikt/kvinna efter utfodringsstatus poäng gjordes med ögat. Vikter beräknades som genomsnittet av grupper på 5 myggor. Data visas som medianer med intervall, n = 23. A–D: Bokstäver indikerar statistiskt distinkta grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns multipla jämförelse, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Figur 5: Kvantifiering av måltider med farmakologiska föreningar. Kvinnor konsumerar måltider av samma storlek av fårblod (rött), saltlösning + ATP (aqua) och saltlösning + ATP + 100 μM dos av human NPY Y2 receptor agonist TM30338 (mörkblå). Måltidsvolym beräknad med fluorescensavläsningar. Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna. Data visas som medianer med intervall, n = 12. Bokstäver indikerar statistiskt distinkta grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns multipeljämförelse, p<0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Figur 6: Kvantifiering av mindre nektarmåltider. A)Schematisk analys av nektarmatning. (B) Måltidsvolym beräknad med fluorescensavläsningar för vilda honor erbjöd måltider av antingen vatten (blå, n = 36) eller 10% sackaros (grön, n = 53), var och en med 0,002% fluorescein, i nektarmatningsanalysen. Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna. Data visas som medianvärden med intervall. Bokstäver anger statistiskt distinkta grupper, Mann-Whitney test, p<0.05. Dessa uppgifter publicerades i Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Konstgjord blodmåltid</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Koncentration av stamlösning (mg/ml)</td>
			<td>Volym lagerlösning i måltid (μL/ml)</td>
			<td>Slutlig måltidskoncentration (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Proteinkomponenter*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-Globuliner</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemoglobin</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumin</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt protein</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Icke-proteinkomponenter</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Koncentration av stamlösning (mM)</td>
			<td>Volym lagerlösning i måltid (μL/ml)</td>
			<td>Slutlig måltidskoncentration (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>I γ-globulinbuljong</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (på NaHCO)
</td>
			<td>I γ-globulinbuljong</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vatten</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*Proteinkomponenter bereds i stamlösning av dubbeldestillerat vatten, med undantag för γ-Globulins, som löses upp i 400 mM NaHCO3 och inkluderar en variabel mängd NaCl (2-4%) i produkten.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Recept för att förbereda konstgjorda blodmåltider (anpassad från Kogan (1990)22). Artificiellt blod består av protein och icke-proteinkomponenter som regelbundet finns i humant blod och ger möjlighet att variera förhållandet mellan dessa komponenter. Myggor kan producera ägg efter utfodring på artificielltblod 7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Saltlösning måltid</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komponent</td>
			<td>Koncentration av stamlösning (mM)</td>
			<td>Volym lagerlösning i måltid (μL/ml)</td>
			<td>Slutlig måltidskoncentration (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (på NaHCO)
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vatten</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Recept på saltlösningsmjöl med ATP (anpassad från Duvall et al. (2019)7). Proteinfria saltlösningsmåltider kan användas för att leverera föreningar av intresse för myggor samtidigt som de efterliknar bukdistensionen som uppstår efter blodmatning, men utan att utlösa äggutvecklingen som uppstår när proteiner intas.

Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Målet med detta protokoll är att leverera animaliska och konstgjorda blodmåltider till Aedes aegypti myggor genom en konstgjord membranmatare och exakt kvantifiera volymen av mjöl som intas.

Utfodring och kvantifiering av animaliskt härlett blod och konstgjorda måltider i Aedes aegypti myggor

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Utarmning av specifika cellpopulationer med Komplettera Utarmning

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolering av Mouse bukhålan celler

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

En Kalcium bioluminescence-analys för funktionsanalys av Mosquito ( Aedes aegypti) Och Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G proteinkopplade receptorer

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Ett protokoll för insamling och färgning hemocyter från gula febern Mosquito Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på Mitotiska kromosomer myggor

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D- och 3D-kromosommålning i malariamyggor

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...