Name: in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model
Uploaded: 2020-10-27T14:45:00
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Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), der China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904) finanziert. und das National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

Informationen zu kommerziellen Reagenzien und Instrumenten sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
Die AC16 humane Kardiomyozyten-Zelllinie wurde aus der Fusion von Primärzellen aus adultem ventrikulärem Herzgewebe mit SV40-transformierten menschlichen Fibroblasten17abgeleitet, die von BLUEFBIO (Shanghai, China) gekauft wurden. Die Zelllinie entwickelt viele biochemische und morphologische Merkmale, die für Kardiomyozyten charakteristisch sin...

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	<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients.">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).</li><li>Klein, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+invasive+ventricular+reconstruction+for+ischaemic+heart+failure.">Less invasive ventricular reconstruction for ischaemic heart failure.</a> EUROPEAN JOURNAL OF HEART FAILURE. 21 (12), 1638-1650 (2019).</li><li>Otto, K. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp90aa1:+a+novel+target+gene+of+miR-1+in+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Hsp90aa1: a novel target gene of miR-1 in cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Sci Rep. 6, 24498 (2016).</li><li>Castedo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hypothermia+on+right+atrial+cardiomyocyte+apoptosis+in+patients+undergoing+aortic+valve+replacement.">Influence of hypothermia on right atrial cardiomyocyte apoptosis in patients undergoing aortic valve replacement.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 2, 7 (2007).</li><li>Krech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+therapeutic+hypothermia+induces+multimodal+protective+effects+in+oxygen-glucose+deprivation/reperfusion+injured+cardiomyocytes.">Moderate therapeutic hypothermia induces multimodal protective effects in oxygen-glucose deprivation/reperfusion injured cardiomyocytes.</a> Mitochondrion. 35, 1-10 (2017).</li><li>Cooper, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermic+circulatory+arrest+causes+multisystem+vascular+endothelial+dysfunction+and+apoptosis.">Hypothermic circulatory arrest causes multisystem vascular endothelial dysfunction and apoptosis.</a> ANNALS OF THORACIC SURGERY. 69 (3), 696-702 (2000).</li><li>Kajimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cerebral+perfusion+prevents+abnormalities+in+glutamate+cycling+and+neuronal+apoptosis+in+a+model+of+infant+deep+hypothermic+circulatory+arrest+and+reperfusion.">Selective cerebral perfusion prevents abnormalities in glutamate cycling and neuronal apoptosis in a model of infant deep hypothermic circulatory arrest and reperfusion.</a> JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM. 36 (11), 1992-2004 (2016).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Hypothermic+Circulatory+Arrest+Does+Not+Show+Better+Protection+for+Vital+Organs+Compared+with+Moderate+Hypothermic+Circulatory+Arrest+in+Pig+Model.">Deep Hypothermic Circulatory Arrest Does Not Show Better Protection for Vital Organs Compared with Moderate Hypothermic Circulatory Arrest in Pig Model.</a> Biomed Research International. 2019, 1420216 (2019).</li><li>Davidson, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+modulates+IL-6+release+and+cytotoxicity+from+hypothermic+brain+cells+and+inhibits+hypothermia-induced+axonal+outgrowth.">S100B modulates IL-6 release and cytotoxicity from hypothermic brain cells and inhibits hypothermia-induced axonal outgrowth.</a> NEUROSCIENCE RESEARCH. 59 (1), 68-73 (2007).</li><li>Tong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+hypothermia+therapy+attenuates+LPS-induced+microglia+neuroinflammation+via+the+STAT3+pathway.">Deep hypothermia therapy attenuates LPS-induced microglia neuroinflammation via the STAT3 pathway.</a> Neuroscience. 358, 201-210 (2017).</li><li>Yu, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troxerutin+attenuates+oxygenglucose+deprivation+and+reoxygenationinduced+oxidative+stress+and+inflammation+by+enhancing+the+PI3K/AKT/HIF1alpha+signaling+pathway+in+H9C2+cardiomyocytes.">Troxerutin attenuates oxygenglucose deprivation and reoxygenationinduced oxidative stress and inflammation by enhancing the PI3K/AKT/HIF1alpha signaling pathway in H9C2 cardiomyocytes.</a> Molecular Medicine Reports. 22 (2), 1351-1361 (2020).</li><li>Drescher, C., Diestel, A., Wollersheim, S., Berger, F., Schmitt, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+hypothermia+protect+cardiomyocytes+during+cardioplegic+ischemia.">How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia.</a> European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).</li><li>Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. 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S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling.">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li><li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. 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S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

Die Komplexität intakter Tiere, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen, verhindert häufig detaillierte Untersuchungen spezifischer Komponenten von I/R-Verletzungen. Daher ist es notwendig, ein In-vitro-Zellmodell zu etablieren, das die molekularen Veränderungen nach Ischämie in vivo genau reflektieren kann. Forschung an OGD-Modelle wurde bereits berichtet13,22, und viele ausgeklügelte Methoden wurden etabliert...

Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach Herzoperationen1,2. Während der nichtpulsatilen Durchflussdurchblutung und Perioden des gesamten Kreislaufstillstands treten immer noch Schäden bei allen Arten von Herzzellen auf. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet die therapeutische Unterkühlung (TH) einen erheblichen Schutz gegen eine erwartete ischämische Beleidigung bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen3,4. TH ist definiert als eine Kernkörpertemperatur von 14-34 °C, obwohl es keinen Konsens über eine Definition der Kühlung während der Herzchirurgie5,6,7gibt. Im Jahr 2013 schlug eine internationale Expertengruppe ein standardisiertes Meldesystem vor, um verschiedene Temperaturbereiche des systemischen hypothermischen Kreislaufstillstands8zu klassifizieren. Basierend auf Elektroenzephalographie- und Stoffwechselstudien des Gehirns teilten sie die Hypothermie in vier Ebenen auf: tiefe Hypothermie (≤ 14 °C), tiefe Hypothermie (14,1-20 °C), moderate Unterkühlung (20,1-28 °C) und leichte Hypothermie (28,1-34 °C). Der Expertenkonsens bot eine klare und einheitliche Klassifizierung, die es ermöglicht, dass Studien vergleichbarer sind und klinisch relevantere Ergebnisse liefern. Dieser Schutz durch TH basiert auf seiner Fähigkeit, die metabolische Aktivität von Zellen zu reduzieren, was ihre Rate des verbrauchshöchstenergetischen Phosphatverbrauchs weiter begrenzt9,10. Jedoch, die Rolle der TH im Myokardschutz ist umstritten und kann mehrere Auswirkungen haben, je nach Grad der Unterkühlung.
Myokardi/R ist bekannt, dass sie von erhöhter Zellapoptisis11begleitet wird. Jüngste Berichte haben beobachtet, dass programmierte KardiomyozytenTod steigt während der Operation am offenen Herzen, und kann mit Nekrose zusammenfallen, wodurch die Zahl der toten Myokardzellen12erhöht. Daher ist die Verringerung der Kardiomyozytenapoptose ein nützlicher therapeutischer Ansatz in der klinischen Praxis. Im Maus-Atrial-HL-1-Kardiomyozytenmodell wurde gezeigt, dass die therapeutische Hypothermie die mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c und Apoptose-induzierendem Faktor (AIF) während der Reperfusion13reduziert. Jedoch, die Wirkung der Temperatur bei der Regulierung der Apoptose ist umstritten und scheint vom Grad der Unterkühlung abhängen. Cooper und Kollegen beobachteten, dass im Vergleich zu einer normothermen kardiopulmonalen Bypass-Kontrollgruppe die Apoptoserate des Myokardgewebes von Schweinen mit dem tiefen hypothermen Kreislaufstillstandum 14erhöht wurde. Darüber hinaus haben die Ergebnisse einiger Studien darauf hindeutet, dass tiefe Hypothermie den Apoptose-Weg aktivieren kann, während weniger aggressive Hypothermie den Weg zu hemmen scheint12,15,16. Der Grund für dieses Ergebnis kann auf verwirrende Effekte im Zusammenhang mit ischämischen Verletzungen und ein Mangelndes Verständnis der Mechanismen, durch die Temperatur wirkt sich auf Myokardgewebe. Daher sollten die Temperaturgrenzwerte, bei denen die Apoptose erhöht oder abgeschwächt wird, genau definiert werden.
Um ein besseres Verständnis der Mechanismen zu gewinnen, die mit der Wirksamkeit der Hypothermie verbunden sind, und eine rationale Grundlage für ihre Umsetzung beim Menschen zu schaffen, ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die Schäden ähnlich denen für den klinischen Zustand in reproduzierbarer Weise verursachen können. Ein wesentlicher Schritt zur Erreichung dieses Ziels ist die Schaffung der optimalen Bedingungen für die Induktion von Kardiomyozyten-Apoptose. Dementsprechend untersuchten wir in der vorliegenden Studie die methodischen Details zu Sauerstoff-Glukose-Entzugsexperimenten mit kultivierten Zellen, einem einfachen In-vitro-Modell der Ischämie-Reperfusion. Darüber hinaus haben wir die Wirkung verschiedener hypoxisch-ischämischer Zeiten auf die Kardiomyozytenapoptose bewertet und unsere Hypothese über die Wirkung unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Zellapoptose in vitro überprüft.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1062M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac myocyte growth supplement</td>
			<td>Sciencell,USA</td>
			<td>6252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 8 activity assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C1151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, no glucose</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>CytoFLEX,USA</td>
			<td>B49007AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human myocardial cells</td>
			<td>BLUEFBIO,China</td>
			<td>BFN60808678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>C2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Bio-Technology,China</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-gas incubator</td>
			<td>Memmert,Germany</td>
			<td>ICO50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco,USA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

Ischämie/Reperfusion abgeleitete Myokardfunktionsstörung ist ein häufiges klinisches Szenario bei Patienten nach einer Herzoperation. Insbesondere ist die Empfindlichkeit von Kardiomyozyten gegenüber ischämischen Verletzungen höher als bei anderen Zellpopulationen. Derzeit bietet Unterkühlung erheblichen Schutz vor einer erwarteten ischämischen Beleidigung. Untersuchungen zu komplexen Hypothermie-induzierten molekularen Veränderungen halten sich jedoch in Grenzen. Daher ist es wichtig, einen Kulturzustand ähnlich wie in vivo-Bedingungen zu identifizieren, die schäden ähnlich denen im klinischen Zustand in einer reproduzierbaren Weise verursachen können. Um Ischämie-ähnliche Bedingungen in vitro nachzuahmen, wurden die Zellen in diesen Modellen durch Sauerstoff-/Glukoseentzug (OGD) behandelt. Darüber hinaus haben wir ein Standard-Zeittemperaturprotokoll angewendet, das während der Herzchirurgie verwendet wird. Darüber hinaus schlagen wir einen Ansatz vor, um eine einfache, aber umfassende Methode für die quantitative Analyse von Myokardverletzungen zu verwenden. Apoptose und Expressionsniveaus von Apoptose-assoziierten Proteinen wurden durch Durchflusszytometrie und mit einem ELISA-Kit bewertet. In diesem Modell haben wir eine Hypothese über die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturbedingungen auf die Kardiomyozytenapoptose in vitro getestet. Die Zuverlässigkeit dieses Modells hängt von einer strengen Temperaturregelung, kontrollierbaren experimentellen Verfahren und stabilen experimentellen Ergebnissen ab. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um den molekularen Mechanismus des hypothermischen Kardioschutzes zu untersuchen, was wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von ergänzenden Therapien zur Verwendung mit Hypothermie haben kann.

Die Wirkung der OGD-Exposition auf die Lebensfähigkeit von HCM wurde durch CCK-8-Assay bestimmt. Im Vergleich zu der in der Kontrollgruppe beobachteten wurde die Zelllebensfähigkeit zeitabhängig signifikant verringert (Abbildung 2A). Die Apoptoseraten von HCM zu unterschiedlichen Zeiten nach der Reperfusion zeigten einen spezifischen Trend, bei dem die Apoptoseraten allmählich stiegen und die Höchstrate zum 16-Stunden-Zeitpunkt erreichten(Abbildung 2B). Da ...

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.

In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Forschung

Medizin

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

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Beurteilung der Herzfunktion und Morphologie Myokardiale Mit Small Animal Look-Locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Ratten

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Myokardinfarkt und Functional Outcome Assessment in Schweine

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

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Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

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Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Implantation von HiPSC abgeleitete Herzmuskel Patches nach Myokard-Schädigung in einem Meerschweinchen-Modell

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...